содержание   ..  1  2  3  4  5  6  7   ..

ДЕЙСТВИЕ ГОРМОНОВ И МЕТАБОЛИЗМ ФОСФОЛИПИДОВ

Недавно проведенные исследования в области действия пептид­ных гормонов показали, что мембранные фосфолипиды и продук­ты их метаболизма играют важную роль в реакции клеток-мишеней на гормональную стимуляцию. Фосфолипиды участвуют в дейст­вии гормонов, по меньшей мере, тремя основными путями 1) как источник производных арахидоновой кислоты — пред­шественников для синтеза простагландинов и родственных соеди­нений с вторичными эффектами на ткань-мишень; 2) за счет ускорения кругооборота фосфатидилинозитола и об­разования полнфосфоинозитидов, влияющих на метаболизм клетки-мишени (например, стероидогенез); 3) за счет повышения метилирования фосфолипидов, приводя­щего к образованию фосфатидилхолина из фосфатидилэтаноламина с последующими изменениями текучести плазматической мем­браны и подвижности рецепторов в ней.

Рис. 4—19. Взаимоотношения между путями активации, «запускаемыми» гормональными рецепторами и связанными с мобилизацией кальция и аде­нилатциклазой. Этот пример подчеркивает роль Са²⁺-кальмодулина в опре­делении скорости разрушения циклического нуклеотида фосфодиэстеразой. Другие области взаимодействия между двумя системами показаны на рис. 4—13, 4—15, 4—17 и 4—18 (Schulster, Levitski [45в] в модификации).

Г — гормон: Рец — рецептор; АЦ — аденилатциклаза: ПК — протеинкиназа (кат-каталитическая, per — регуляторная субъединица); КМ — кальмодулин; ФДЭ — фосфодиэстераза; белок-Ф—фосфорилированный белок.

Фосфолипиды: структура, метаболизм и функция

Рис. 4—20. Общая структура фос­фолипидов.

Природные фосфолипиды являются производными глицерофосфа­та или сфингозинфосфата, содержащими две жирные кислоты и гидрофильный заместитель, такой, как холин, этаноламин, инозитол или серин. Они служат главными составными частями липопротеинов и клеточных мембран и в большом количестве присутствуют в периферической нервной ткани и головном мозге. Фосфоглицериды обладают общей структурой (рис. 4—20), образующейся путем эстерификации глицерофосфата с двумя длинноцепочечными жир­ными кислотами и гидрофильным компонентом. Важной особен­ностью фосфолипидов является их способность взаимодействовать как с гидрофобными, так и с гидрофильными доменами и зани­мать поверхность раздела между органическими и водными среда­ми. Так, в липопротеинах они выступают в роли связующего звена между белковой частью и транспортируемым нейтральным липи­дом, а в клеточной мембране они образуют характерный липидный бислой, который ограничивает внутриклеточное пространство.

В плазматической мембране около 60% фосфолипидов прихо­дится на долю фосфатидилхолина, который частично синтезирует­ся в самой мембране путем метилирования фосфатидилинозитола. Фосдатидилинозитол и фосфатидилсерин присутствуют в меньших количествах, причем жирокислотные заместители в разных тканях варьируют по длине и степени насыщенности. Фосдатидилхолины, или лецитины, синтезируются в животных тканях тремя путями. В ходе основного пути, аналогичного таковому для синтеза фосфа­тидилинозитола, холин фосфорилируется АТФ, образуя фосфохолин. Последний соединяется с ЦТФ, превращаясь в ЦДФ-холин, который реагирует с диацилглицерином в присутствии фосфохолинтрансферазы, образуя фосфатидилхолин. Второй путь синтеза фосфатидилхолина заключается в ацилировании лизофосфатидилхолина (образующегося при гидролизе лецитина фосфолипазой А). Наконец, 3-й путь, имеющий особенное отношение к современным исследованиям гормональных влияний на фосфолипиды мембраны, сводится к последовательному метилированию фосфатидилэтаноламина в клеточной мембране. Эти реакции в схематическом виде представлены на рис. 4—21.

Гормональные влияния на метаболизм фосфолипидов. Стимуляция образования арахидоновой кислоты и синтеза проста­гландинов.

Многие пептидные гормоны повышают продукцию про­стагландинов тканью-мишенью, что иногда сопровождается вто­ричными реакциями сосудов и клеток. Хотя простагландины, по-видимому, не играют роли медиаторов действия пептидных гор­монов, но стимуляция этих местно образующихся тканевых гормо­нов при активации клеток-мишеней составляет важный компонент клеточной реакции на взаимодействие пептидных гормонов с их рецепторами [57]. Простагландины и родственные им простацик­лины и тромбоксаны быстро синтезируются из полиненасыщенных жирных кислот—предшественников, особенно из арахидоновой кислоты, при стимуляции клеток-мишеней. Ненасыщенные жирные кислоты присутствуют в клетке в виде фосфоглицеридов, кото­рые для того, чтобы превратиться в субстрат для метаболизма в простагландины и другие активные интермедиаты, должны деацилироваться под действием фосфолипаз. На долю арахидоновой кислоты приходится наибольшее количество ненасыщенных жир­ных кислот в тканевых фосфолипидах; эта кислота подвергается метаболизму в двух основных направлениях, называемых циклооксигеназным и липооксигеназным. Ближайшими продуктами циклооксигеназного пути являются эндоперекиси (ПГG₂ и ПГН₂), которые превращаются в простагландины (ПГЕ₂, ПГF_2a и ПГD₂) под действием ферментов, носящих общее название простагландинсинтетазы, а также в тромбоксаны (ТКА₂ и ТКВ₂) и простацикли­ны (ПГI₂) под действием соответствующих синтетаз (рис. 4—22). Классификация этих метаболитов эндоперекисей связана со сте­пенью ненасыщенности их жирокислотных предшественников; эйкозатетраеновая кислота превращается в продукты 1-го класса (ПГЕ₁, ПГF_1a, TKA₁ и др.), а арахидоновая кислота—в продук­ты 2-го класса (ПГЕ₂, ПГF_2a, ТКА₂, ТКВ₂ и ПГI₂) [58].

Рис. 4—21. Пути биосинтеза фосфатидилхолина.

Тромбоксаны и простациклины также образуются при дальней­шем метаболизме эндоперекисей, появляющихся в ходе циклооксигеназного пути; они представляют собой важные регуляторы взаи­модействий тромбоцитов с сосудистой стенкой. Простациклин (ПГI₂) в больших количествах продуцируется эндотелиальными и гладкомышечными клетками сосудов, где его образование модули­руется гидроперекисными метаболитами липооксигеназного пути [59]. ПГI₂ является высокоактивным ингибитором агрегации тром­боцитов, а его продукция в эндотелиальных клетках стимулирует­ся тромбином и тормозится липопротеинами низкой плотности. Имеются также данные, свидетельствующие о возможной роли снижения способности гладкомышечных клеток сосудов продуци­ровать ПГI₂ в развитии атеросклероза.

Позднее обнаруженный липооксигеназный путь обусловливает превращение арахидоновой кислоты в оксижирные кислоты, в том числе в гидропероксиэйкозатетраеновую кислоту (ГПЭТЕ), кото­рая затем разрушаясь превращается в оксиэйкозатетраеновую кис­лоту (ОЭТЕ). Эти метаболиты липооксигеназного пути играют существенную роль в воспалительных реакциях, в том числе хемо­таксисе нейтрофилов и других следствиях активации циклооксигеназы в тромбоцитах и продукции ПГI₂ в ткани сосудов. Недавно полученные данные свидетельствуют также о том, что липооксигенированные метаболиты арахидоновой кислоты могут опосредовать действие ГнРГ на высвобождение гормонов гипофизарными гонадотрофами [60].

Рис. 4—22. Образование и метаболизм арахидоновой кислоты. Ненасыщен­ная жирная кислота, высвобождаемая фосфолипазой А₂ из мембранных фосфолипидов, превращается в активные производные в ходе липоксигеназного, циклоксигеназного и простагландинсинтетазного ферментативных процессов.

Любой из перечисленных путей продукции активных метаболи­тов арахидоновой кислоты зависит от адекватного поступления ненасыщенного жирокислотного предшественника из мембранных фосфолипидов. В настоящее время известно, что многие формы опосредованной рецепторами активации клеток сопровождаются повышением активности связанных с мембранами фосфолипаз, ко­торые катализируют гидролиз эфирных связей в глицерофосфолипидах. Наиболее важна в этом отношении фосфолипаза А₂, отщепляющая жирные кислоты во 2-м положении диацилглицерофосфолипидов, которая образует лизофосфолипид и ненасыщен­ную жирную кислоту, обычно арахидонат. Деацилированный фос­фолипид быстро реацилируется за счет переноса активированной СоА жирной кислоты, что легко можно измерить по включению меченой арахидоновой кислоты в фосфолипиды клеток. Этот кру­гооборот глицерофосфолипида служит источником арахидоновой кислоты для метаболизма по цикло- и липооксигеназному путям (рис. 4—23) и может влиять на проницаемость мембраны и актив­ность других связанных с мембраной ферментов [61].

Активация фосфолипазы А₂ зависит от кальция; она происхо­дит при стимуляции клеток надпочечников АКТГ, что приводит к ускорению кругооборота арахидонилфосфатидилинозитола [62]. Этот эффект вызывается также кальциевым ионофором А23187 и может отражать повышение внутриклеточного уровня кальция при действии АКТГ и вторичной стимуляцией фосфолипазы А₂ в каче­стве ранней реакции, сопутствующей АКТГ-рецепторному взаимо­действию. Известно, что действие АКТГ на стероидогенез в надпо­чечниках зависит от кальция, а не только от образования цАМФ. По крайней мере, часть потребностей в кальции для действия АКТГ может быть связана с опосредуемым фосфолипазой A₂ кру­гооборотом мембранных фосфолипидов при активации коры над­почечников.

Рис. 4—23. Кругооборот фосфоглицеридов в плазматической мембране с эф­фектами опосредованного рецепторами (Р) потока кальция на фосфолипа­зу А₂ и продукцию арахидоновой кислоты.

ОЭТЕ — оксиэйкозатетраеновая кислота: Г — гормон; АЦ — аденилатциклаза НСБ — нуклеотид связывающий белок; ГПЭТЕ — гидропероксиэйкозатетраеновая кислота.

Хотя механизм, включающий активацию фосфолипазы, может отражать общее свойство гормонрегулируемых секреторных кле­ток, при гормональной стимуляции специфических клеток-мише­ней меняются и другие этапы метаболизма фосфолипидов. Так, в клетках гранулемы яичника, где ЛГ увеличивает продукцию про­стагландинов, гормон не повышает образование арахидоновой кис­лоты, а действует на более поздних этапах, увеличивая активность простагландинсинтетазы [63]. Этот эффект Л Г на синтез проста­гландинов в граафовом фолликуле (пузырчатый яичниковый фол­ликул), по-видимому, не опосредует стероидогенного действия го­надотропина, но играет важную роль в развитии овуляции [64].

Стимуляция кругооборота фосфатидилинозитола и образования полифосфоинозитидов.

Инозитоловые фосфолипиды составляют не­большую, но важную часть фосфолипидов плазматической мембра­ны в большинстве эукариотических клеток. Главным инозитоловым липидом в большинстве клеток является фосфатидилинозитол (ФИ), в котором миоинозитол присоединен к диэфирной фосфатной груп­пе диацилглицеринового скелета. Полифосфоинозитиды (ди- и трифосфоинозитолы), содержащие моно- или дважды фосфатированные гидроксильные группы пнозитола, присутствуют в плазмати­ческой мембране в меньших количествах. Инозитоловые фосфолипиды превращаются друг в друга под действием АТФ-зависимых киназ и фосфомоноэстераз и разрушаются фосфодиэстеразами до инозитолфосфатов и диацилглицерина.

Уже в течение нескольких лет известно, что при стимуляции секреторных клеток усиливается метаболизм ФИ с увеличением включения радиоактивного фосфата и инозитола в ФИ и его пред­шественник фосфатидат. В настоящее время установлено, что эта реакция отражает распад и ресинтез ФИ и, как постулировал Nichell [65], является общим следствием взаимодействия между лигандами и рецепторами клеточной поверхности. Позднее выясни­лось, что эта реакция характеризует гормонрецепторные взаимо­действия, приводящие к повышению внутриклеточной концентра­ции кальция.

Реакция ФИ часто не зависит от внеклеточной и внутрикле­точной концентрации кальция и представляется общим процессом, сопутствующим активации рецепторов, приводящей к притоку или мобилизации кальция и повышению его концентрации в цитозоле. Отсюда было сделано предположение, что распад ФИ принимает участие в общем механизме, с помощью которого активация ре­цепторов клеточной поверхности контролирует мобилизацию каль­ция [65]. Повышение концентрации кальция в цитоплазме могло бы определяться увеличением проницаемости плазматической мем­браны или высвобождением кальция из запасов в плазматической мембране или митохондриях. До сих пор в стимулируемых гормо­нами тканях отмечали отчетливую корреляцию между реакцией ФИ и мобилизацией кальция. В отличие от этого было показано, что некоторые гормоны, которые повышают внутриклеточный уро­вень цАМФ, но не кальция, практически не влияют на метаболизм фосфоинозитидов. Таким образом, реакция ФИ — это не просто общий ответ клеток на активацию их поверхностных рецепторов, но, по-видимому, характерная особенность стимулов, для которых мобилизация кальция является существенным компонентом реак­ции клеток-мишеней [65].

Дополнительной особенностью гормонрецепторных взаимодей­ствий, обусловливающих реакцию ФИ, является повышение активности гуанилатциклазы и уровня цГМФ в клетке. Как уже отмечалось, это, вероятно, представляет собой следствие повыше­ния внутриклеточной концентрации кальция, а не необходимый этап процесса активации, который вызывает характерную реак­цию клетки-мишени на гормональную стимуляцию. Хотя между реакцией ФИ и мобилизацией кальция при активации многих кле­точных рецепторов наверняка существует тесное сопряжение, при­рода связи между этими процессами пока не ясна. По всей вероят­ности, опосредование рецепторами кругооборота ФИ происходит в плазматической мембране клетки, в результате чего и увеличи­вается проницаемость для кальция и/или высвобождение кальция в цитоплазму. Стимулируемый гормоном распад ФИ мог бы являться важным компонентом некоторых механизмов, связанных с активацией рецепторов, вызывая открытие кальциевых каналов на клеточной поверхности, а также модулируя эффекты других рецеп­торов, которые активируют аденилатциклазу [65].

Другой важный аспект метаболизма ФИ связан с возможной ролью полифосфоинозитидов в действии пептидных гормонов. Эти сильно заряженные липиды подвергаются быстрому метаболиче­скому кругообороту, особенно в головном мозге, и ускоряют свой распад при стимуляции a-адренергических и мускариновых рецеп­торов. В отличие от реакции ФИ, эти изменения зависят от уров­ня кальция и могут представлять собой вторичные ответы на по­вышение его концентрации в цитозоле подобно общему изменению активности гуанилатциклазы [28]. Потенциальная роль полифос­фоинозитидов в действии гормонов установлена для коры надпо­чечников, в которой АКТГ остро повышает содержание дифосфо-и трифосфоинозитидов. Эти эффекты воспроизводятся и цАМФ, причем, как и эффекты АКТГ, они блокируются ингибиторами синтеза белка. Добавление дифосфоинозитида к надпочечниковым митохондриям или изолированным клеткам повышает продукцию прегненолона и кортикостерона, что свидетельствует об опосреду­ющей роли полифосфоинозитидов в стимуляции стероидогенеза в надпочечниках под влиянием АКТГ и цАМФ [66].

Стимуляция метилирования фосфолипидов.

Синтез фосфатидилхолина из фосфатидилэтаноламина в клеточной мембране проходит через два последовательных этапа метилирования, осуществляемых путем переноса метильных групп с S-аденозилметионина под кон­тролем двух ферментов, называемых фосфометилтрансферазами I и II. Первый фермент переносит одну метильную группу, образуя фосфатидилмонометилэтаноламин; как субстрат фосфатидилэтаноламин, так и первый метилтрансферазный фермент локализуются на цитоплазматической стороне клеточной мембраны. Второй фер­мент переносит еще две метильные группы опять-таки с S-адено­зилметионина, образуя фосфатидилхолин. Как продукт фосфатидилхолин, так и вторая метилтрансфераза располагаются на на­ружной поверхности мембраны. Такое асимметричное распределе­ние ферментов и их субстратов способствует быстрому переносу фосфолипидов через плазматическую мембрану в ходе последова­тельного метилирования [67]. Внутримембранный синтез промежу­точного продукта фосфатидилмонометилэтаноламина вызывает резкие изменения текучести мембраны, создавая условия для уско­ренного латерального движения собственных мембранных белков. Стимуляция процесса метилирования фосфолипидов в ретикуло­цитах под действием b-адренергических агонистов и снижение вязкости мембраны при этом сопровождается демаскированном скрытых b-адренергических рецепторов, ускорением латерального движения рецепторов и усилением сопряжения между рецептора­ми и аденилатциклазой. Метилирование мембранных фосфолипи­дов увеличивает число рецепторов некоторых гормонов, в том чис­ле пролактина и ЛГ. К другим мембранным ферментам и процессам, на которые влияют синтез и транслокация метилированных фосфолипидов, относятся кальцийзависимая АТФаза, хемотаксис лейкоцитов, секреция гистамина тучными клетками и митогенез лимфоцитов (рис. 4—24). В клетках астроцитомы стимуляция b-адренергических и бензодиазепиновых рецепторов повышает ме­тилирование фосфолипидов аддитивным образом, что свидетельст­вует о независимой стимуляции двумя лигандами метилтрансфераз, локализованных в отдельных доменах вблизи соответствую­щих рецепторов [68].

Рис. 4—24. Механизм действия катехоламинов (КА) на метилирование фосфолипидов и мобиль­ность b-адренергических рецепторов (Р). Пред­полагают, что повышение текучести мембраны об­легчает взаимодействие рецепторов с гуанилнуклеотидсопрягающим фактором (ГНСФ) и аденилатциклазой (АЦ) (Hirata, Axelrod [68]).

КА — катехоламин: МТ — метилтрансфераза: ФХ — фосфатидилхолин: ФЭ — фосфатидилэтаноламин; ФМЭ — фосфатидилмоно­метилэтаноламин.

Такие вызываемые лигандами изменения в метилировании фос­фолипидов и текучести мембраны, по всей вероятности, отражают общий феномен модификации структуры и функции мембраны при многих формах регуляции клеток гормонами и другими агентами. Они могут объяснять также кратковременное увеличение числа рецепторов гомологичного и других гормонов, наблюдаемое после стимуляции клеток-мишеней. Так, ЛГ в семенниках крысы вызы­вает временное увеличение рецепторов как самого ЛГ, так и про­лактина, а АКТГ вызывает начальное повышение числа рецепто­ров пролактина в надпочечниках. В каждом из этих случаев уве­личение числа рецепторов предшествует изученному процессу потери рецепторов, или «снижающей регуляции», который in vivo начинается через несколько часов после взаимодействия лигандов с рецепторами. Степень, в которой повышение текучести мембра­ны контролирует рецептор-циклазное сопряжение в клетках-мише­нях гормонов, пока не известна, но этот механизм может быть важным компонентом регуляции клеточной чувствительности и реактивности к гормональной стимуляции.

СТЕРОИДНЫЕ ГОРМОНЫ

Основные классы стероидных гормонов, секретируемых половыми и надпочечными железами, включают андрогены, эстрогены, прогестины, глюко- и минералокортикоиды. Стадии биосинтеза этих стероидов определяются комплектом ферментов, присутствующих в отдельных стероидогенных клетках-мишенях, а общая скорость синтеза стероидов в каждом случае регулируется одним или не­сколькими тропными гормонами гипофиза: ЛГ, ФСГ, АКТГ и пролактином.

Типы действия стероидов: роль структуры

Каждая специализированная стероидсекретирующая ткань проду­цирует один основной стероид со сравнительно ограниченным спек­тром действия на ткани-мишени. Поскольку стероидные гормоны образуются в ходе общего биосинтетического пути из холестерина, а их биологические особенности определяются весьма немногочис­ленными структурными модификациями, не удивительно, что эф­фекты близких стероидных молекул перекрывают друг друга. Обычно такое перекрывание проявляется лишь при высоких кон­центрациях гормонов, но может встречаться и при введении их в терапевтических дозах, как, например, сользадерживающее, или минералокортикоидное, действие стероидов (глюкокортикоидов), оказывающих главные эффекты в углеводном обмене. Эти эффек­ты обусловлены перекрестным реагированием гетерологичного стероида с рецепторами, в норме взаимодействующими с гомоло­гичным лигандом, в данном случае с альдостероном. Поскольку домен биологического действия каждого подвида стероидов преж­де всего определяется рецепторами, через которые они оказывают свое действие, и сопряженными процессами активации, то гормо­нальные действия можно было бы наиболее точно классифициро­вать в соответствии с рецепторами, опосредующими каждый харак­терный эффект [69]. Все основные стероидные гормоны взаимодей­ствуют со специфическими рецепторами, присутствующими в соответствующей клетке-мишени, но не в других тканях. Гормон-рецепторные комплексы, образующиеся в цитоплазме и, возмож­но, в ядре, подвергаются активации, а затем связываются с хро­матином, регулируя транскрипцию специфических мРНК, которые кодируют ферменты и другие интермедиаты, определяющие харак­терную реакцию клетки-мишени. Половые стероиды — андрогены, эстрогены и прогестерон — участвуют преимущественно в регуля­ции роста и функции тканей репродуктивной системы, тогда как надпочечниковые стероиды служат главным образом регулятора­ми метаболизма, контролируя межуточный обмен и гомеостаз элек­тролитов (табл. 4—5).

Некоторые эффекты стероидных гормонов каждого класса, реа­лизуемые через их специфические рецепторы, определяются преж­де всего конформацией их молекул. Как это характерно для всех регуляторных лигандов, в том числе фармакологических веществ и гормонов, проявление активности агониста обусловливается его способностью связываться и активировать специфические рецеп­торы, которые контролируют последующую метаболическую реак­цию (или реакции), меняющуюся под влиянием лиганда. Исход­ная кольцевая структура стероидных гормонов модифицируется в процессе биосинтеза за счет отщепления боковых цепей, восстанов­ления, гидроксилирования и (в случае эстрогенов) ароматизации кольца А. Структуры природных стероидов, типичные для основ­ных их классов, вместе с синтетическими соединениями, приме­няемыми с терапевтической целью, приведены на рис. 4—25 [70].

Таблица 4—5. Виды эффектов стероидных гормонов

Роль связывания в плазме

Циркулируя в крови, половые и надпочечниковые стероиды при­сутствуют в виде свободных гормонов и связанных форм, образую­щих комплексы с белками плазмы. Хотя секретируемые стероиды в тех низких концентрациях, которые содержатся в плазме (при­мерно 10~⁹ M), растворимы в воде, основная масса циркулирую­щих гормонов транспортируется в виде стероидбелковых комплек­сов [71]. С белками плазмы связано более 98% половых стероидов, около 90% содержащегося в крови кортизола и около 50% альдо­стерона. Поскольку на уровне клеток-мишеней активны именно свободные гормоны, роль связывания в плазме может заключаться в создании резервуара или буфера, который контролирует доступ­ность гормона для рецепторов клеток-мишеней. Хотя каждый сте­роидный гормон может связываться тем или другим белком плаз­мы, но степень и прочность (или сродство) связывания разных стероидов значительно варьируют. Так, около 40% содержащегося в крови альдостерона слабо связано с сывороточным альбумином, тогда как более 90% кортизола и тестостерона связаны с высоким сродством специфическими белками, называемыми соответствен­но кортикостероидсвязывающим глобулином (КССГ), или транс-

Рис 4—25. Структура главных классов стероидных гормонов. Лроизводные андрогенов R 1881 и R 2956 носят кодовые номера фармацевтической ком­пании Roussel (Mainwaring [70] в модификации). кортином, и сексгормонсвязывающим глобулином. Последний бе­лок связывает и эстрадиол, хотя в физиологических условиях, вероятно, степень его связывания не слишком велика.

В отношении типичных стероидных гормонов, равно как и в отношении аналогичных гормонов, таких, как витамин D и тирок­син, отсутствуют указания на важность роли их связывания в плазме в механизме биологического действия. Как уже отмечалось, именно свободный гормон представляет собой биологически актив­ную фракцию и именно его уровень коррелирует с величиной реак­ции на гормон. Кроме того, стероиды активны и в отсутствие своих связывающих белков, а синтетические аналоги стероидов, которые обычно не связываются с транспортными белками, сохра­няют способность вызывать биологические эффекты в тканях-ми­шенях за счет взаимодействия со специфическими внутриклеточ­ными рецепторами. Когда в условиях патологии или под влиянием терапевтических мероприятий концентрация связывающих белков повышается или снижается, концентрация свободного стероида остается относительно постоянной, несмотря на изменение общего уровня гормона в крови.

Хотя связывание в плазме, по-видимому, не имеет непосред­ственного значения для гормонального эффекта (кроме значения в качестве резервуара циркулирующего стероида), оно может, оче­видно, оказывать влияние на скорость клиренса крови от секрети­руемого, инъецируемого или принимаемого внутрь гормона. Свя­зывание с белками плазмы может также служить буфером, сводя­щим к минимуму влияние эпизодической секреции гормона на кон­центрацию свободного стероида, поступающего к клетке-мишени. При лечении стероидными гормонами связывание с транспортны­ми белками плазмы могло бы снижать скорость метаболизма вво­димого стероида и создавать резервуар, из которого постепенно освобождается свободный гормон. Степень, в которой эти эффекты связывания в плазме влияют на продолжительность и интенсив­ность реакций на отдельные стероиды, не ясна, но она могла бы иметь очевидное значение для фармакокинетики стероидных пре­паратов [69]. Связывание с альбумином не снижает доступности стероидных гормонов для головного мозга, тогда как гормон, свя­занный с глобулинами, не транспортируется в мозг. Таким обра­зом, доля содержащегося в плазме гормона, которая может транс­портироваться в головной мозг, не ограничивается свободной фрак­цией, а включает и более крупные, связанные с альбумином, ком­плексы [72]. В крысиной плазме эта доля могла бы составлять 60% прогестерона, 40% тестостерона и 15% кортикостероидов, тогда как свободные фракции этих гормонов в плазме колеблются в пре­делах 2—8%.

Другой физиологически важный аспект связывания стероидов с белками плазмы заключается в значении избирательности этого процесса для действия альдостерона на его специфические мине­ралокортикоидные рецепторы в почках. Поскольку главные участ­ки связывания альдостерона в почках обнаруживают также высо- кое сродство к дезоксикортикостерону (ДОК) и меньшее, но отчетливое, сродство к кортизолу, эти стероиды могли бы, очевид­но, занимать почечные рецепторы, так как их концентрации в крови близки (ДОК) или на несколько порядков выше (корти­зол), чем концентрация альдостерона. Однако более 90% ДОК и кортизола, присутствующих в крови, связаны с альбумином и КССГ, тогда как только 40% альдостерона в циркуляции связано с альбумином. В связи с этим ДОК и глюкокортикоиды конкури­руют за рецепторы альдостерона in vivo много слабее, чем in vitro в условиях отсутствия плазмы (например, для ДОК 1—5% против 80%). Без избирательности связывания ДОК и глюкокортикои­дов в плазме альдостерон не мог бы насыщать минералокортико­идные рецепторы и оказывать характерное регулирующее дейст­вие на гомеостаз натрия. Этим способом связывание в плазме спо­собствует предотвращению связывания «неадекватных» стероидов (таких, как ДОК, кортикостерон и кортизол, которые могут дейст­вовать как минералокортикоиды, но секретируются под контролем АКТГ) с обладающими высоким сродством л низкой емкостью ре­цепторными участками в клетках-мишенях минералокортикои­дов [73].

Следует отметить, что циркулирующие в крови стероидсвязывающие белки в некоторых отношениях отличаются от внутрикле­точных рецепторов стероидов, опосредующих реакцию клетки-мишени. С физической точки зрения, связывающие белки плаз­мы — это относительно стабильные, растворимые глобулярные гли­копротеины, тогда как рецепторы асимметричны, сравнительно более гидрофобны и менее стабильны. С функциональной же сто­роны, транспортные белки связывают преимущественно природ­ные стероидные молекулы и хуже (или вообще не связывают) более активные синтетические аналоги. Рецепторные же молеку­лы, напротив, связывают как природные, так и синтетические сте­роиды (или их метаболиты) соответственно их биологической активности.

Поглощение стероидов клетками-мишенями

Если не считать поглощения холестерина, который проникает в клетку в ходе опосредованного рецепторами эндоцитоза липопротеинов плазмы [23], существует мало данных, свидетельствующих о существовании механизмов транспорта, контролирующих погло­щение стероидных гормонов клетками. Более того, принято счи­тать, что стероиды свободно и быстро диффундируют через клеточ­ную мембрану, которая, по-видимому, не ограничивает доступно­сти стероидов для цитоплазматических рецепторных участков. Хотя большинство имеющихся данных свидетельствует о том, что поглощение стероидов действительно не зависит от мембранных барьеров или процессов транспорта, можно привести некоторые примеры действия стероидов на мембранные процессы, указываю­щие на возможность участия более сложных механизмов, чем про­стая диффузия, в проникновении стероидных гормонов в клетку  Так, влияние прогестерона на дифференцировку ооцитов лягушки? начинается именно с наружной поверхности клеточной мембраны [74], где инициируется реакция мейотического созревания. Эта спо­собность прогестерона взаимодействовать с мембраной ооцита [75] равно, как и другие признаки взаимодействия стероидов с поверх­ностью клеток-мишеней [76], свидетельствуют о том, что не следо­вало бы пренебрегать ролью плазматической мембраны в процес­сах поглощения клеткой и действия стероидных гормонов.

Рецепторы стероидов

На способность стероидных гормонов регулировать ядерные про­цессы вначале указывали данные об увеличении синтеза РНК в матке [77] и предстательной железе [77] под влиянием соответст­венно эстрогенов и андрогенов. Впоследствии было показано, что все классы стероидных гормонов после введения их с тритиевой меткой накапливаются в ядрах соответствующих клеток-мишеней. Так, было обнаружено, что меченые эстрогены концентрируются в женских репродуктивных тканях, которые характеризуются высо­ким содержанием цитоплазматических рецепторов эстрадиола в. отличие от малого их количества, присутствующего в других тка­нях [79]. Рецепторы эстрогенов локализуются преимущественно в цитозоле матки кастрированных или неполовозрелых крыс, а после воздействия эстрогенов in vivo или in vitro транслоцируются в ядро [80]. Б дальнейшем оказалось, что стероиды всех классов вначале связываются со специфическими цитоплазматическими рецептора­ми, которые подвергаются активации и транслокации в ядро.

Цитоплазматические рецепторы эстрогенов при центрифугиро­вании в градиенте плотности в присутствии 0,4 М КС1 обнаружива­ют свойства 4S белка, который при активации и транслокации в ядро превращается в 58-форму. Способность антиэстрогенов, та­ких, как кломифен и нафоксидин, снижать поглощение эстрогенов и сопутствующую этому реакцию роста матки указывает на значе­ние рецепторного связывания в качестве раннего этапа действия эстрогенов. Известно, что рецепторы эстрогенов, первоначально-идентифицированные в цитозоле матки как белки с константой седиментации в низкосолевой среде 8—9S, при внутриклеточных условиях ионной силы существуют в 4S-форме [80]. При воздейст­вии эстрогенов и нагревании цитозольные 4S-рецепторы превращаются в 5S-форму, обнаруживающую выраженное сродство к изо­лированным ядрам и хроматину. Природа 4S—5S превращения не ясна, но этот процесс зависит, по-видимому, не просто от конфор­мационного изменения, а предполагает какую-то форму вызывае­мой гормоном димеризации [81]. Такой же тип цитоплазматических рецепторов и процесса транслокации в ядро наблюдали во многих эстрогензависимых тканях, в том числе в передней доле гипофиза и опухоли молочной железы. Ткань гормонзависимого рака молоч­ной железы человека поглощает больше эстрогенов, чем ткань автономных опухолей, и содержание рецепторов эстрогенов в рако­вой ткани можно использовать для прогнозирования последующей реакции на кастрацию у больных с далеко зашедшим раком молоч­ной железы.

Очистка цитозольных и ядерных эстрогенрецепторных ком­плексов вызывала большие трудности из-за их нестабильности и склонности к агрегированию. Однако цитозольные рецепторы ста­билизируются в присутствии кальция и при низкой или высокой концентрации соли приобретают свойства 4,5S-форм. Ядерные эстрадиолрецепторные комплексы в процессе очистки теряют склонность к агрегированию и были выделены в виде 4,8S-белка с молекулярной массой 66000. Позднее с помощью иммунизации кроликов, коз и мышей очищенными препаратами ядерных рецеп­торов эстрадиола из матки телок были получены антитела к рецеп­торам эстрогенов. Эти антитела давали перекрестную реакцию с рецепторами из эстрогенчувствительных тканей и опухолей живот­ных нескольких видов [82]. Одной из многих возможных областей применения таких антител является разработка иммунохимических методов определения рецепторов эстрогенов в тканях-мише­нях, включая рак молочной железы у человека, для оценки их дстрогенной зависимости.

Рецепторы прогестерона присутствуют в женских репродук­тивных тканях, в том числе яйцеводах, матке и влагалище, и оха­рактеризованы как 6,5—8S-цитозольные компоненты, которые диссоциируют на 4S-форму в присутствии соли, подобно рецепторам эстрогенов. Эстрогены оказывают выраженное влияние на харак­тер и число прогестероновых рецепторов. Комплексы прогестерона с рецепторами из матки нестимулированных крыс седиментируют при низкой ионной силе с константой 4—5S, а после воздействия эстрогенов превращаются в более крупные компоненты (6,5—8S),[83]. Кроме того, в ходе эстрального цикла в проэструсе преобла­дают крупные цитозольные формы (6,7S), а в диэструсе — мень­шие (4, 5S) формы, что согласуется с эффектами вводимых эстро­генов. Концентрация прогестероновых рецепторов в репродуктив­ных тканях под влиянием эстрогенов заметно повышается. Число связывающих мест в матке животных достигает максимума в про­эструсе, а у человека в гиперпластическом эндометрии выше, чем во время пролиферативной и секреторной фаз менструального цикла.

Свойства прогестероновых рецепторов интенсивно изучались на яйцеводах незрелых цыплят, в которых эстрогены способствуют дифференцировке клеток канальцевых желез, секретирующих крупные протеины яичного белка, овальбумин, кональбумин и ли-зоцим, и стимулируют образование прогестероновых рецепторов. После элиминации эстрогенов синтез овальбумина прекращается, но может возобновляться после воздействия либо эстрогенами, либо прогестероном. Воздействие прогестероном вызывает также дифференцировку эпителия в бокаловидные клетки, синтезирую­щие авидин — белок яйцеводов, с чрезвычайно высоким сродством связывающий биотин. Цитоплазматические прогестероновые ре­цепторы седиментируют как 3,8S-комплексы и в присутствии про­гестерона подвергаются транслокации в ядро в ходе зависимого от температуры процесса. Ядерные прогестеронрецепторные комплек­сы представляют собой 4S-белки, аналогичные таковым в цитозоле, и не обнаруживают изменения седиментационных свойств, что характерно для ядерных эстрогеновых рецепторов, которые в про­цессе активации и транслокации превращаются из 4S в 5S-форму. Цитозольный 8S-рецептор прогестерона был очищен и разделен на два 4S-компонента с молекулярными массами 110000 (А) и 117 000 (В). Было установлено, что компонент В специфически связывается с хроматином клеток яйцеводов и может определять специфичность тканевого связывания активированного прогестеронового рецептора [84].

Рецепторы андрогенов были идентифицированы в мужских по­ловых органах и акцессорных половых тканях в исследованиях по связыванию меченных тритием тестостерона и дигидротестостерона. Рецепторы андрогенов, присутствующие в цитозоле предста­тельной железы, семенных пузырьков и других мужских тканей, седиментируют как 8—9S-формы при низкой ионной силе и как 4S-формы в присутствии соли. Подобно рецепторам эстрогенов и прогестерона, цитоплазматические андрогенрецепторные комплек­сы подвергаются зависимой от температуры транслокации в ядро, откуда их можно экстрагировать в виде 3S-формы [85]. Важной особенностью андрогенрецепторной системы в мужских акцессор­ных половых тканях является необходимость превращения тесто­стерона в дигидротестостерон, предшествующего связыванию с ре­цептором и его транслокации. Таким образом, 3S-ядерный андрогенрецепторный комплекс в этих тканях содержит не тестостерон, а дигидротестостерон, образующийся под действием 5a-редуктазы до связывания с цитоплазматическими рецепторами. Необходи­мость ферментативного превращения андрогенных гормонов в ди­гидротестостерон для активации рецепторов во многих мужских тканях-мишенях имеет отношение к некоторым формам генетиче­ски детерминированной резистентности к андрогенам. Синдром тестикулярной феминизации — крайняя форма мужского псевдо­гермафродитизма может обусловливаться как нарушением синте­за дигидротестостерона, так и рецепторным дефектом при дейст­вии андрогенов.

Сходный синдром у грызунов (Tfm) определяется дефектом андрогеновых рецепторов, а не нарушением восстановления тесто­стерона в дигидротестостерон [86].

Глюкокортикоидные рецепторы первоначально были обнаруже­ны в печеночных и лимфоидных клетках, а в настоящее время от­крыты в большинстве тканей млекопитающих, что согласуется с представлением о широко распространенном регуляторном влия­нии кортизола и родственных кортикостероидов. В отсутствие сте­роида рецепторы нестабильны и проявляют высокое сродство и стереоспецифичность к природным глюкокортикоидам и их активным синтетическим аналогам, таким, как дексаметазон и триамсинолон. Подобно другим стероидрецепторным комплексам, глюкодюртикоид-рецепторный комплекс подвергается быстрой темпера­турной активации с приобретением способности транслоцироваться в ядро и связываться с хроматином. Глюкокортикоид-рецепторные комплексы седиментируют как 7S-формы при низкой ионной силе и превращаются в 48-форму при высокой ионной силе. Акти­вация стероидрецепторного комплекса не изменяет его седиментационных свойств, но вызывает снижение изоэлектрической точ­ки, что обусловливает изменение подвижности на ионообменных средах (фосфоцеллюлозе и ДЭАЭ-целлюлозе), а также повышение сродства к ДНК и хроматину [87]. Такие изменения ионных свойств позволяют разделять активированные и неактивированные комп­лексы на ДЭАЭ-целлюлозе. Анализ цитозоля клеток вилочковой железы с помощью этой методики показал, что неактивированные комплексы присутствуют только в 1-ю минуту после воздействия дексаметазоном, а в течение следующих нескольких минут быстро превращаются в активированные [88].

Альдостероновые рецепторы были обнаружены в тканях-мишенях минералокортикоидов, таких, как почки, мочевой пузырь, околоушная железа и кишечник. В секреторном эпителии такие рецепторы крайне лабильны и с трудом поддаются анализу, при­чем их изучение осложняется присутствием в тканях-мишенях других рецепторов для структурно и биологически сходных глюко­кортикоидов [89]. Сравнительное сродство двух классов рецепторов к альдостерону и глюкокортикоидам таково, что альдостерон в низ­ких и физиологических концентрациях преимущественно связыва­ется с I (минералокортикоидным) типом связывающих мест, а в более высоких концентрациях со все большим количеством глюко­кортикоидных рецепторов. И наоборот, глюкокортикоиды в физио­логических концентрациях лишены минералокортикоидной активности, но в сверхфизиологических количествах (эндо- или экзогенных) связываются с I типом рецепторов и оказывают сользадерживающее действие [73]. При исследовании с помощью мето­дики, позволяющей нивелировать вмешательство глюкокортикоид­ных рецепторов, оказалось, что альдостероновые рецепторы связывают минералокортикоиды в соответствии с их биологической активностью и реагируют с кортизолом (при достаточно высокой концентрации последнего), равно как и с более активными сользадерживающими стероидами — альдостероном и дезоксикортикостероном, Главные цитоплазматические альдостеронрецепторные комп­лексы седиментируют как 8,5S-формы при низкой ионной силе и как 4S-формы при высокой ионной силе [90]. Ядерные ре­цепторы, экстрагированные 0,3 М КСl, также седиментируют как 48-формы и подвергаются максимальной транслокации из цитозо­ля через 10 мин после инъекции альдостерона.

Рис. 4—26. Диаграмма этапов действия стеро­идных гормонов. Активация внутриклеточных рецепторов стероидны­ми гормонами сменяет­ся ядерным связывани­ем комплекса и стиму­ляцией синтеза мРНК (Baxter, McLeod [69] в модификации). С — стероид, Р — рецептор.

Влияние стероидов на рецептор: активация и связывание ядром

Стероидные гормоны любого из основных классов, включающих эстрогены, прогестины, андрогены, глюкокортикоиды и минерало­кортикоиды, действуют в соответствии с общей схемой, т. е. свя­зываются со специфическими цитоплазматическими белками, или рецепторами, после чего происходит активация комплекса и транс­локация его в ядро. Здесь связывание комплекса ядерными акцеп­торными участками хроматина клеток-мишеней модулирует актив­ность специфических генов, ответственных за синтез определенных видов мРНК (рис. 4—26). Как уже отмечалось, любые цитозоль­ные комплексы стероида с рецептором подвергаются индуцируе­мой гормоном конверсии, называемой активацией рецептора, кото­рая вызывает их накопление и связывание в ядре.

Процесс активации рецептора индуцируется гормоном и зави­сит от температуры; он включает обычно изменение кажущейся молекулярной массы, заряда или конформации комплекса. Однако не существует постоянных изменений, которые характеризовали бы процесс активации применительно ко всем классам стероидных гормонов. Увеличение скорости седиментации с 4 до 5S обнаружи­вают только эстрогеновые рецепторы. Андрогенрецепторные и не­которые прогестеронрецепторные комплексы после активации снижают скорость седиментации, а глюкокортикоидные рецепторы не изменяют ее, но обнаруживают изменение заряда. Хотя процесс «активации» рецепторов стероидных гормонов необходим для ядерного связывания и действия, он варьирует для отдельных сте­роидных рецепторов, и общая его основа остается неясной.

Агонисты и антагонисты стероидов

Как и многие другие типы биологически активных лигандов, будь то лекарственные вещества, трансмиттеры или гормоны, стероид­ные гормоны и их производные можно разделить на агонисты, антагонисты и неактивные соединения. Активность агонистов пропорциональна сродству их связывания с рецепторами и эффектив­ности активации биологической реакции гормонрецепторным ком­плексом. Антагонисты также обнаруживают высокое сродство к рецептору, но не связываются с ядром или не обладают способно­стью активировать ядерные процессы. Аллостерическая модель действия стероидных агонистов и антагонистов на конформацию и активность рецепторов приведена на рис. 4—27. Важно подчерк­нуть, что различия между агонистами и антагонистами редко бы­вают абсолютными и что многие соединения действуют как час­тичные агонисты (или частичные антагонисты), связываясь с рецепторами и, даже при полном насыщении рецепторных участ­ков, не вызывая максимальной реакции. «Чистые» агонисты могут быть «слабыми» или «сильными» в зависимости от их сродства к рецепторам, но они не действуют как антагонисты. Так, «слабые» агонисты могут вызывать ту же биологическую реакцию, что и «сильные», если присутствуют в концентрации, достаточно высо­кой, чтобы насытить ту же самую долю рецепторов. В отличие от этого, частичные агонисты не могут вызвать полную реакцию, даже насыщая большинство или все рецепторы, и затем могут ока­зывать антагонистическое влияние или блокировать эффекты до­бавляемых соединений-агонистов. Частичные агонисты можно рас­сматривать как вещества, занимающие определенное место в спектре активности между чистыми агонистами и чистыми антаго­нистами. Для большинства клинических и экспериментальных целей лучше пользоваться чистыми агонистами и антагонистами. Однако многие антагонисты обладают некоторой степенью актив­ности агониста, что необходимо учитывать при их применении для лечения и при анализе рецепторного связывания. Следует отме­тить также, что если активность данных агонистов в различных тканях относительно постоянна, то частичные агонисты и антаго­нисты могут проявлять непостоянную агонистическую и антагони­стическую активность в отдельных тканях-мишенях или в разных экспериментальных условиях [69].

Рис. 4—27. Аллостерическая модель взаимодей­ствий стероидного ли­ганда с рецептором. Ре­цептор включает как стероидсвязывающий (ССУ),. так и функциональный участок (ФУ), необхо­димые для проявления биологической активно­сти, и может существо­вать в неактивной или активной конфигурации (Mainwaring [70] в моди­фикации).

Антагонисты эстрогенов

Некоторые нестероидные аналоги эстрогенов, такие, как нафоксидин и тамоксифен, препятствуют проявлению вызываемых эстро­генами реакций: роста матки и гиперплазии клеток-мишеней. Такие вещества связываются с цитоплазматическими эстрогеновыми рецепторами и стимулируют транслокацию антагонистрецепторного комплекса в ядро. Здесь комплекс связывается с хромати­ном и задерживается на длительный период, вызывая начальную стимуляцию РНК-полимеразы и клеточной гипертрофии. Однако связывание антагонист-рецепторного комплекса не сменяется по­следующим восстановлением числа цитозольных рецепторов, будь то за счет повторных циклов или ресинтеза их, что наблюдается после транслокации рецепторов под действием эстрогеновых аго­нистов [91].

Антагонисты андрогенов

Наиболее активным природным антиандрогеном является проге­стерон, и некоторые из наиболее мощных антагонистов андрогенов представляют собой активные прогестиновые производные. Анти­андрогены противодействуют эффектам тестостерона или дигидротестостерона, конкурируя за андрогенсвязывающие участки рецеп­торов, присутствующих в андрогензависимых тканях-мишенях. Такие соединения имеют потенциальную значимость в лечении гирсутизма и других маскулинизирующих синдромов, а также в лечении гиперплазии и рака предстательной железы. Высокоактив­ные прогестиновые антиандрогены, такие, как ципротерон-ацетат, взаимодействуют с андрогеновыми, равно как и с прогестероновыми, рецепторами. Однако не все прогестины являются антагониста­ми андрогенов, а хломадинон-ацетат обладает относительно низкой антиандрогенной активностью, несмотря на его близкое струк­турное сходство с ципротерон-ацетатом. Присутствие циклопропа-новой группы в кольце А ципротерон-ацетата является основным структурным отличием его от хломадинон-ацетата и может играть важную роль в определении антиандрогенной активности [92а]. Некоторые антиандрогены подавляют также гонадотропную сек­рецию с последующим снижением продукции тестостерона, равно как и блокадой действия андрогенов. Медроксипрогестерон угне­тает и активность 5a-редуктазы, нарушая тем самым образование ДГТ. Важно отметить, что некоторые прогестиновые антиандроге­ны обладают и другими видами гормональной активности, напри­мер ципротерон-ацетат проявляет не только андрогенные, но и антиэстрогенные и антигонадотропные свойства. Кроме того, длительное лечение ципротероном для достижения антиандроген­ного эффекта может приводить к подавлению функции надпочеч­ников за счет торможения секреции АКТГ, вероятно, через цен­тральные механизмы высвобождения кортикотропина. Спироно­лактон также взаимодействует с эстрогеновыми и андрогеновыми рецепторами, равно как и с рецепторами альдостерона, и может оказывать эстрогенные и антиандрогенные влияния, в том числе-появление гинекомастии и потерю либидо. К нестероидным антаго­нистам андрогенов относится флутамид, который не обладает гор­мональной активностью, а по своим антиандрогенным свойствам сходен с ципротерон-ацетатом. Подобно прогестинам, флутамид в тканях-мишенях угнетает поглощение и задержку в ядрах андро­генов, конкурируя за связывание с их цитозольными рецепторами.

Антагонисты глюкокортикоидов

Б настоящее время не существует клинически применимого анта­гониста глюкокортикоидных эффектов, поскольку увеличение сек­реции АКТГ быстро преодолевает действие блокады этих эффектов за счет повышения секреции кортизола надпочечниками. Однако некоторые стероиды проявляют частичную или тканезависимую способность к конкурентному торможению действия кортизола и родственных глюкокортикоидов. Большинство глюкокортикоидов обладает аксиальной 11 b-гидроксильной группой, которая может играть важную роль в связывании и активации рецептора [92а]. Такие стероиды, как кортизон и кортексолон (11-дезоксикортизол или соединение S) и производные прогестерона, связываются с глюкокортикоидными рецепторами, но практически не обладают собственной глюкокортикоидной биологической активностью. Эти соединения могут действовать как частичные агонисты или анта­гонисты, особенно in vitro, когда они не метаболизируются даль­ше в глюкокортикоиды. In vivo последний процесс может препят­ствовать проявлению полного антиглюкокортикоидного действия таких стероидов, за исключением неметаболизируемых соедине­ний, таких, как ципротерон-ацетат и позднее полученные антаго­нисты [93].

Антагонисты минералокортикоидов

Такие соединения, как спиронолактон, действуют в качестве анта­гонистов альдостерона, конкурентно ингибируя связывание по­следнего с минералокортикоидными рецепторами и образуя антагонист-рецепторный комплекс, не подвергающийся транслокации и связыванию в ядре. Эти антагонист-рецепторные комплексы по седиментационным свойствам отличаются от альдостерон-рецепторного комплекса, что может отражать неактивное состояние рецеп­тора или изменение конформации, вызываемое связыванием анта­гониста [94]. Помимо описанных эффектов, спиронолактон в вы­соких дозах угнетает биосинтез альдостерона, оказывая тем самым дополнительное антиминералокортикоидное действие.

К другим соединениям, взаимодействующим с минералокорти­коидными рецепторами, относятся нестероидные агенты, такие, как противовоспалительные средства (например, фенилбутазон) и глицирретиновая кислота. Эти агенты конкурируют за связывание с почечными рецепторами и вызывают задержку натрия и другие стероидные эффекты. Таким образом, взаимодействие таких соеди­нений-агонистов с альдостероновыми рецепторами может приво­дить к развитию реакции клеток-мишеней предположительно за счет того же ядерного механизма, который опосредует эффекты эндогенных минералокортикоидов на транспорт электролитов.

Связывание стероидных рецепторов в ядрах

Для проявления биологических эффектов стероидных гормонов не­обходимо взаимодействие активированных цитоплазматических гормонрецепторных комплексов с ядрами клеток-мишеней. Акти­вированный стероидрецепторный комплекс приобретает способ­ность связываться с хроматином, равно как и с ДНК и другими полианионами, и накапливаться в ядре. Данные о присутствии в ядре, так же как в цитоплазме нестимулированных клеток свобод­ных эстрогеновых рецепторов, свидетельствуют о том, что они мо­гут распределяться по всей клетке-мишени, несмотря на зависи­мость их накопления в ядре от превращения в активированную хроматинсвязывающую форму со сдвигом равновесия между рас­пределением в ядре и вне его [81].

В ядре активированные комплексы связываются с акцептор­ными участками хроматина и инициируют синтез специфических мРНК и белков [95]. Точная природа ядерных акцепторных участ­ков не известна, но о значении ДНК в реакции свидетельствует способность ДНКазы препятствовать связыванию стероидрецепторных комплексов с ядрами и высвобождать из ядра ранее свя­занные комплексы. Хроматин из ядер клеток-мишеней андрогенов и прогестерона связывает больше гормонрецепторных комплексов, чем хроматин из тканей, не реагирующих на эти стероиды. Подоб­но этому, рецепторы, выделенные из клеток некоторых резистент­ных к глюкокортикоидам лимфом, обладают сниженным сродством к ядрам и ДНК. Связывание комплексов с ДНК определяется, по-видимому, ионными взаимодействиями между положительно заряженным участком молекулы рецептора и отрицательно заря­женными фосфатными группами ДНК, а также неионными сила­ми. Считают, что ДНК-связывающий участок рецепторной молеку­лы содержит лизиновый, аргининовый и гистидиновый остатки и изменяется под влиянием агентов, действующих на сульфгидриль­ные группы.

По крайней мере один из видов рецепторных молекул (для про­гестерона) состоит из двух субъединиц: одной (А), обладающей неспецифическим связывающим сродством к ДНК, и второй (В), имеющей специфическое сродство к хроматину клеток яйцеводов. Избирательное. связывание прогестерон-рецепторных комплексов определяется взаимодействием В-субъединицы с особой фракцией негистоновых белков хроматина, которая может обусловливать тканевую специфичность действия прогестерона. Такой двойной процесс связывания мог бы повышать матричную активность хроматина, обеспечивая доступность мест инициации синтеза авидиновой и других мРНК, кодирующих белки яйцевода [84].

Несмотря на эти данные о значении связывания с ДНК и хро­матином для ядерных эффектов стероидных гормонов, все же оста­ются сомнения относительно природы акцепторных участков и ро­ли большинства процессов связывания, наблюдаемых в ядре. Эстрадиолрецепторный комплекс можно экстрагировать из ядер матки в комбинации с рибонуклеопротеидом, а активированные стероидрецепторные комплексы прочно связаны с ядерными гистонами и основными негистоновыми белками ядра. Таким образом, как ядерные белки, так и ДНК, по-видимому, принимают участие в процессе связывания хроматином, который протекает, очевидно, как в нуклеосомах, так и в промежуточных участках хроматина, доступных для нуклеазного переваривания [96]. Кроме того, специ­фическое связывание эстрогенов и андрогенов обнаружено в бесхроматиновом ядерном матриксе тканей-мишеней половых гормо­нов: в областях репликации ДНК, а также процессинга и транс­порта ядерных РНК (яРНК) [97].

Высокую связывающую емкость ядра по отношению к гормон-рецепторным комплексам трудно согласовать с представлением о том, что активированные комплексы связываются с ограниченным числом ядерных акцепторных мест, регулируя лишь несколько специфических генов. Действительно, насыщение ядерных мест гормонрецепторными комплексами наблюдается не всегда, и при стимуляции физиологическими концентрациями гормона трансло­кации может подвергаться до 10 000 комплексов. Эти данные сви­детельствуют о связывании транспонированных гормонрецепторных комплексов со многими ядерными участками, обладающими низким сродством, что маскирует взаимодействие с небольшим числом акцепторных мест, определяющее регуляцию генов [81]. Тем не менее линейные корреляции между биологическими реак­циями (такими, как синтез мРНК) и насыщенностью рецепторов удается наблюдать вплоть до нескольких тысяч рецепторов в одном ядре [69].

Влияние гормонрецепторных комплексов на хроматин

После этапа активации, обусловливаемого взаимодействием стеро­идных гормонов с их специфическими внутриклеточными рецеп­торными белками, гормонрецепторные комплексы приобретают способность быстро связываться с хроматином и влиять на транс­крипцию специфических молекул мРНК. Отдельные белки, синтез которых, как было установлено, индуцируется действием стероид­ных гормонов на образование яРНК, перечислены в табл. 4—6.

По всей вероятности, будет показано, что многие другие белки, о которых известно, что на их содержание влияют стероидные гор­моны, также регулируются через первичное действие гормонре­цепторных комплексов на транскрипцию генов и скорость образо­вания мРНК.

Таблица 4—6. Специфические белки, регулируемые стероидными гормонами через контроль синтеза мРНК

 Известны многие другие зависимые от стероидных гормонов белки (напри­мер, субстрат ренина, тироксинсвязывающий глобулин, кортикостероидсвязывающий глобулин), но уровень регуляции их продукции пока не установлен прямыми опре­делениями образования мРНК при действии гормонов [1].

Точный механизм регуляции экспрессии специфических генов все еще изучается, но недавно были начаты исследования струк­туры и функции генов с целью определения главных стадий этого процесса. Большинство соответствующих сведений было получено при изучении влияния эстрогенов на синтез РНК и белка в двух тканях-мишенях: незрелой матке крыс [80] и яйцеводах цыплят [95]. При первичной стимуляции этих тканей эстрогенами в тече­ние фазы клеточного роста и дифференцировки происходит синтез ДНК, всех видов РНК и многих белков [98]. В матке ранней реак­цией на эстроген является синтез мРНК, кодирующей характерный «индуцированный белок» [99]. В яйцеводе цыпленка начальная реакция пролиферации клеток трубчатых желез сопровожда­ется синтезом нескольких протеинов яичного белка, главным ком­понентом которых является овальбумин. После регресса первич­ной реакции на эстроген повторное воздействие эстрогеном или прогестероном вызывает в яйцеводе быстрое увеличение продук­ции мРНК, контролирующих синтез специфических «экспортируе­мых» белков, в том числе овальбумина и кональбумина. Скорость синтеза овальбуминовой мРНК, регистрируемая либо путем транс­ляции in vitro, либо с помощью гибридизации с комплементарной ДНК (кДНК), после введения эстрогена быстро увеличивается и тесно коррелирует со скоростью синтеза овальбумина. После отме­ны эстрогена число молекул овальбуминовой мРНК быстро умень­шается, что согласуется с представлением о необходимости присут­ствия эстрогенов для продолжения транскрипции мРНК на матрице овальбуминового гена [1, 95].

Эти, а также аналогичные данные об эффектах андрогенов и глюкокортикоидов in vivo и in vitro, подтверждают предположение о том, что стероидные гормоны действуют путем повышения син­теза специфических мРНК, исчезающих после удаления индуци­рующего гормона. В некоторых случаях повышенный синтез мРНК снижается при добавлении второго гормона, ингибирующего дей­ствие первого, что наблюдается при добавлении антагонистов эст­рогенов или андрогенов. Хотя эффекты стероидных гормонов заключаются обычно в увеличении скорости синтеза мРНК, но бывают случаи, когда гормональное воздействие приводит к «выключению» специфических мРНК, как это происходит, напри­мер, при ингибиторном действии глюкокортикоидов на синтез и секрецию АКТГ клетками передней доли гипофиза. Здесь уровень специфического 31 К-предшественника кортикотропина и b-липопротеина увеличивается после адреналэктомии и снижается при действии глюкокортикоидов, что свидетельствует о регуляции ими скорости образования молекул мРНК предшественника [100]. Ана­логичный эффект глюкокортикоидов наблюдается в культуре кле­ток опухоли гипофиза, хотя острое подавление секреции АКТГ под действием глюкокортикоидов представляется слишком быстрым, чтобы быть обусловленным только снижением синтеза мРНК [101]. За исключением этой формы ингибиторного контроля, которая, ве­роятно, имеет общее значение для эффектов стероидных и тиреоид­ных гормонов по механизму обратной связи на секрецию соответ­ствующих тропных гормонов, большинство воздействий стероид­ных гормонов на синтез белка первично реализуется, по-видимому, через дерепрессию специфических генов. Полный эффект гормон-рецепторных комплексов в ядрах клеток-мишеней включает, веро­ятно, несколько аспектов синтеза и процессинга РНК с главным влиянием на повышение синтеза РНК [81].

Гормонрецепторные комплексы оказывают прямое воздействие на активность РНК-полимеразы в изолированных ядрах, а также на матричную функцию хроматина клеток-мишеней. Эстрогены и андрогены стимулируют активность ядрышковой [I] и нуклеоплазменной [II] РНК-полимераз в соответствующих клетках-мишенях (матке и предстательной железе), а прогестеронрецепторные комплексы повышают матричную активность хроматина из яйце­водов цыплят, но не из тканей, не являющихся мишенями для про­гестерона. Эти данные позволяют считать, что системы синтеза и процессинга РНК в гормонзависимых тканях и опухолях в отсут­ствие гормона ограничиваются или подавляются, отчасти за счет ограничения матричной функции хроматина, и что гормонрецепторные комплексы снимают это ингибирование. Поскольку пры стимуляции ткани, например эстрогенами, в клетках-мишенях синтезируется огромное количество белков, следует полагать, что в трофических эффектах гормонов должны принимать участие многие гормонрецепторные комплексы, даже если экспрессия генов главных секретируемых белков зависит от активации очень неболь­шого числа участков генома.

Накопление мРНК при действии стероидных гормонов могло бы определяться как прямыми быстрыми влияниями на транскрипцию" так и вторичными эффектами белков, образующихся вследствие начальной стимуляции синтеза мРНК. Так, влияние экдизона на хроматин слюнных желез насекомых заключается в индукции кратковременных вздутий (пуффов) на хромосомах, которые пред­ставляют собой активные гены, причем синтез белка необходим для образования поздних, но не ранних пуффов [102а]. Экдизон локализуется в специальных участках политопных хромосом, реа­гирующих образованием пуффов. Удаление стероида приво­дит к регрессии ранних, но не поздних пуффов. Это свидетельст­вует о том, что ранние эффекты стероида включают синтез белка,, индуцирующего поздние пуффы. Гормональные влияния на накоп­ление мРНК могли бы опосредоваться и изменениями в скорости-их деградации, как это видно, например, по гораздо более длитель­ному периоду полужизни овальбуминовой мРНК в яйцеводах полу­чавших эстроген цыплят, чем у цыплят, лишенных эстрогенов. Таким образом, эффекты стероидрецепторных комплексов могли бы включать индукцию белка, увеличивающего стабильность мРНК, равно как и первичное действие, сводящееся к повышению синтеза мРНК. Быстрый прогресс представлений о структуре в организации гена обнаружил неожиданную сложность основных транскрипционных единиц в эукариотических клетках, а также процессинга мРНК, образующейся под влиянием стероидных гор­монов и других регуляторов генов.

Структура гена и процессинг продуктов транскрипции (мРНК)

Известно, что между транскрипцией РНК на матрице ДНК и появ­лением транслируемой мРНК в цитоплазме существует несколько стадий. До недавнего времени полагали, что транскрипция приво­дит к образованию высокомолекулярной РНК, процессинг которой сводится к простому нарезанию специфических молекул мРНК, которые затем и проходят в цитоплазму, где транслируются с об­разованием соответствующих белков. Однако в настоящее время выяснилось, что стадии процессинга, участвующие в образовании мРНК, более сложны и включают такие модификации, как полиаденилирование 3 -конца и присоединение метилированного гуанозина и к 5 -концу молекулы мРНК. Последовательности-ДНК, определяющие первичную структуру мРНК, также оказа­лись не смежными, как полагали раньше, а, как правило, разъеди­ненными «вставками» (или интронами), которые отсутствуют в комплементарной структуре соответствующих мРНК. Таким обра­зом, мРНК не прямо копируется с генной последовательности, а-транскрибируется вначале в виде гораздо более крупного продук­та, из которого в ходе процессинга вырезаются промежуточные последовательности с образованием зрелой мРНК, непосредствен­но транслирующейся на рибосомном уровне [104].

Присутствие промежуточных последовательностей ДНК в эука­риотических генах впервые было обнаружено в генах b-глобулина, легких цепей иммуноглобулинов и альбумина. Позднее такие вставки были найдены также в генах овальбумина, кональбумина и овомукоида, равно как и в других генах специфических белков [1, 104]. Современная точка зрения на организацию овальбуминового гена, отраженная на рис. 4—28, заключается в том, что струк­турный ген разъединяется по меньшей мере 7 промежуточными последовательностями. Стимуляция эстрогеном вызывает коорди­нированное повышение транскрипции структурных и промежуточ­ных последовательностей овальбуминового гена с накоплением как высокомолекулярной РНК, содержащей ов альбуминовую последо­вательность, так и цитоплазматической овальбуминовой мРНК [105]. Молекулы крупного предшественника мРНК, содержащего промежуточные последовательности, подвергаются воздействию ферментов с вырезанием вставок и последующим сшиванием, что приводит к образованию зрелой мРНК (см. рис. 4—28). Функция промежуточных последовательностей (или интронов) в эукариотических структурных генах не выяснена. Одно из предположений заключается в том, что они ограничивают участки гена, кодирую­щие домены белка, ответственные за отдельные части его общей функции, и что структурные участки ДНК (или экзоны) сближа­лись в процессе эволюции при участии интронов [106]. Применимы ли эти объяснения к овальбумину, не ясно, поскольку специфиче­ские функции этого белка яйцеводов не известны. Однако данные о том, что ген кональбумина (овотрансферрина) содержит 17 экзонов, позволяют проверить эту концепцию путем анализа функцио­нальных доменов, принимающих участие в секреции (сигнальная последовательность) белка и связывании железа [107].

Рис. 4—28. Структурная организация и транс­крипция гена овальбумина. Эстроген стимули­рует экспрессию всего гена, а промежуточные последовательности за­тем вырезаются со сши­ванием отрезков и обра­зованием зрелой мРНК овальбумина цыплят (Chan и соавт. [1] в мо­дификации). ов — овальбумин; светлый участок — структурный ген темный участок — вставоч­ные последовательности ДНК: линия — боковые последовательности ДНК.

Анализ генома клеток яйцеводов вблизи овальбуминового гена позволил недавно обнаружить два соседних гена с последователь­ностями, гомологичными овальбуминовому гену [108]. Эти два до­полнительных гена имели и интроны, сходные с таковыми в гене овальбумина, и экспрессировались при стимуляции эстрогенами, хотя и в меньшей степени, чем овальбуминовый ген. Такой клас­тер родственных генов мог бы возникнуть в процессе эволюции-путем параллельной сборки из смеси родственных и неродствен­ных участков или путем удвоения исходного гена, в котором соче­тание нитронов и экзонов было зафиксировано с самого начала [109]. Отражает ли разная экспрессия трех генов при действии эстрогенов различия в эффективности транскрипции или различия в последующем процессинге и стабилизации мРНК, пока не уста­новлено. Организация овальбуминовой области генома аналогична таковой генов глобина, и кластеризация структурно и функцио­нально близких генов может быть общей чертой генома эукариотических клеток [108].

ТИРЕОИДНЫЕ ГОРМОНЫ

Тиреоидные гормоны оказывают многочисленные и разнообразные эффекты на дифференцировку, развитие и метаболический гомео­стаз, контролируя синтез и активность регуляторных белков, в том числе ключевых ферментов метаболизма, гормонов и рецепторов. Известное действие тиреоидных гормонов на потребление кислорода определяется отчасти стимуляцией натриевого насоса за счет ин­дукции мембранного фермента: натрий-, калийзависимой АТФазы [110а]. Этот и другие метаболические эффекты тиреоидных гормо­нов зависят от гормональной индукции синтеза РНК, осуществляе­мой путем регуляции экспрессии генов на ядерном уровне. Хотя постулировались прямые влияния тиреоидных гормонов и на кле­точную мембрану и на митохондрии, но многие из эффектов этих гормонов на процессы метаболизма опосредуются, по-видимому, активацией ядерных реакций связывания с увеличением образова­ния специфических РНК.

Основным йодтиронином, секретируемым щитовидной железой, является тироксин (Т4), которому сопутствует небольшое количе­ство активного трийодтиронина (Т3). В тканях-мишенях Т4 дейодируется в Т3, который представляет собой главную внутри­клеточную форму гормона. Это превращение происходит на плаз­матической мембране и в эндоплазматическом ретикулуме, и в раз­ных тканях варьирует по степени, будучи интенсивным в передней доле гипофиза и менее выраженным в печени и почках. Большая зависимость гипофиза от превращения циркулирующего в крови Т4 в Т3 могла бы определяться потребностью в быстром увеличе­нии гипофизарной продукции ТТГ при небольших изменениях в секреции Т4 щитовидной железой.

Большая часть циркулирующих в крови тиреоидных гормонов связана с белками плазмы: тироксинсвязывающим глобулином (ТСГ), тироксинсвязывающим преальбумином (ТСПА) и альбу­мином. Все они связывают Т4 более прочно, чем Т3, причем ТСГ переносит около 70% связанного Т4 плазмы; из остального коли­чества около 10% связано с ТСПА, а 20% с альбумином [111]. Как и в отношении стероидных гормонов, именно свободные тиреоидные гормоны ответственны за контроль активности клеток-мише­ней, и функция связывающих белков, помимо того, что они явля­ются резервуаром циркулирующего гормона, неясна. Интересной особенностью ТСПА является то, что он в некоторых отношениях напоминает клеточный рецептор тиреоидного гормона, в том числе присутствием предположительного ДНК-связывающего участка, богатого заряженными аминокислотами и триптофановыми остат­ками.

Рис. 4—29. Эффекты и вза­имопревращение Т4 и Т3 В клетках, реагирующих на поступление тиреоидных гормонов. Процесс актива­ции ядра зависит от связы­вания Т3 с ядерными ре­цепторами, а не от отдель­но существующих цито­плазматических рецепторов, как это имеет место в клет­ках-мишенях стероидных гормонов (Eberhardt и соавт. [111] в модификации).

Клеточные рецепторы тиреоидных гормонов

Хотя показано присутствие связывающих Т3 белков в цитоплазме, но они обладают относительно низким сродством по сравнению с ядерными участками, которые считаются в настоящее время ис­тинными рецепторами, ответственными за эффекты тиреоидных гормонов [112]. Так, в отличие от стероидных гормонов, тиреоидные гормоны, по-видимому, не нуждаются во взаимодействии с цитозольными рецепторами для последующей транслокации в ядро (рис. 4—29). Ядерные участки связывания Т3 обладают высоким сродством и низкой емкостью и ассоциированы с ядерными негистоновыми белками; их молекулярная масса после солюбилизации составляет примерно 50000 [111]. Они присутствуют во всех гормончувствительных тканях (печень, почки, сердце и гипофиз) и отсутствуют в тканях, не реагирующих на тиреоидные гормоны (семенники, селезенка), и, возможно, в тканях больных с семейной резистентностью к тиреоидным гормонам. Ядерное связывание мно­гочисленных аналогов Т3 тесно коррелирует с их биологической активностью, а вслед за насыщением рецепторов происходит уве­личение активности полимеразы и образования РНК.

Ядерные эффекты тиреоидных гормонов

Стимуляция ядерных процессов тиреоидными гормонами была впервые установлена Tata [114]; она включает повышенное обра­зование высокомолекулярных яРНК и мРНК, как и в случае сте­роидных гормонов. У животных с гипотиреозом скорость образова­ния как предшественника РНК, так и мРНК снижена на 40%, но она быстро восстанавливается до нормы после введения Т3. Поми­мо своих генерализованных эффектов на геном, Т3 оказывает так­же избирательное действие на мРНК, кодирующий a₂-макроглобулпн в печени и СТГ в клетках гипофиза. Вероятно, стимулирую­щее действие Т3 на активность других белков, таких, как митохон­дриальный фермент a-глицерофосфатдегидрогеназа (a-ГФД) и цитоплазматический маликфермент, также опосредуется повыше­нием синтеза специфических мРНК [ИЗ].

Общие особенности действия тиреоидных гормонов в разных тканях проявляются в разной степени как из-за видовой и ткане­вой специфичности эффектов, так и из-за индивидуальных разли­чий в зависимости между насыщенностью рецепторов и биологи­ческими реакциями. Так, влияния Т3 на a-ГФД и маликфермент заметно варьируют в разных тканях и у разных видов животных, причем каждая ткань, по-видимому, реагирует на Т3 индивидуаль­но [113]. Другой особенностью действия Т3 является его участие в мультигормональной регуляции синтеза мРНК. Это наглядно про­является на примере продукции a₂-макроглобулиновой мРНК, на которую влияют кортизол, андрогены и СТГ, равно как и Т3. Кор­тизол и Т3 оказывают также синергичное действие на синтез мРНК гормона роста в клетках гипофиза [114]. Наконец, метаболические факторы также модифицируют влияния Т3 на экспрессию отдель­ных генов, что проявляется особенно отчетливо при голодании и после введения углеводов. Так, индукция маликфермента под вли­янием Т3 зависит от приема углеводов и не происходит при голо­дании. Однако голодание не препятствует реакции a-ГФД на Т3, что опять-таки свидетельствует о значении местных клеточных факторов в проявлении эффектов тиреоидных гормонов [113]. Оче­видно, что большинство модуляций эффектов тиреоидных гормонов в отдельных тканях и в разных физиологических условиях могло бы происходить на пострецепторном уровне, реализуясь путем из­менения скорости синтеза и процессинга мРНК в ядре и их после­дующей трансляции в специфические белки в цитоплазме.

содержание   ..  1  2  3  4  5  6  7   ..