содержание   ..  1  2  3  4  5  ..

Глава 4. 

ДЕЙСТВИЕ ГОРМОНОВ: РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИИ КЛЕТОК-МИШЕНЕЙ БЕЛКОВЫМИ, ТИРЕОИДНЫМИ И СТЕРОИДНЫМИ ГОРМОНАМИ

ВВЕДЕНИЕ: ОБЩИЕ АСПЕКТЫ ДЕЙСТВИЯ ГОРМОНОВ

Все формы биологической регуляции основаны на взаимодейст­вии между комплементарными молекулами, приводящем к изме­нению свойств и функции одного или обоих лигандов. Этот тип-передачи молекулярной информации в законченном виде исполь­зуется рецепторами гормонов и регуляторными ферментами — системами, обладающими многими общими чертами. Действительно, большинство «рецепторов» гормонов и трансмиттеров непо­средственно или косвенно сопряжено с ферментными белками, усиливающими эффект связывания лиганда путем передачи его на последующие метаболические и биосинтетические этапы. В са­мом простом смысле, гемоглобин выполняет роль рецептора кис­лорода и служит одним из многих связывающих и/или транспорт­ных белков, обеспечивающих распределение небольших молекул в организме. В плазме обнаружено огромное число связывающих белков для циркулирующих лигандов, в том числе стероидные и тиреоидные гормоны, а также металлы, липиды и витамины. Свя­зывание лигандов с такими белками, как правило, не изменяет активности молекул носителя, которые служат главным образом резервуаром, а иногда средством транспорта гормональных и дру­гих лигандов. Такие связывающие белки поэтому аналогичны ре­цепторам только по своим «распознавательным» свойствам.

Особенностью клеточных рецепторов гормонов, если не счи­тать их локализации в чувствительных к гормонам тканях, яв­ляется способность связывать природные или синтетические гор­мональные лиганды с высокой специфичностью и активиро­вать реакции, опосредуемые и детерминируемые эффекторными системами клетки-мишени. Способность распознавать и активиро­вать означает, что для перевода внешних сигналов в реакции клетки-мишени рецепторная молекула должна обладать двумя отдельными участками или конформациями. Существование таких связывающих и активирующих доменов в рецепторных белках доказывается данными исследования разнообразных гормональных рецепторов, расположенных как в цитоплазме, так и на плазма­тической мембране клеток-мишеней.

Рис. 4—1. Общие механизмы действия гормонов на клетки-мишени.

КЛАССЫ ДЕЙСТВИЯ ГОРМОНОВ И ДОМЕНЫ ГОРМОНАЛЬНОГО КОНТРОЛЯ

Эволюция механизмов гормонального контроля в многоклеточных организмах обусловила развитие двух четко определенных регу­ляторных систем, интегрирующих функции клеток-мишеней эн­докринных воздействий (рис. 4—1). Более широко распростра­нена система, контролируемая стероидными гормонами, которые регулируют ферменты, определяющие метаболическую и секретор­ную активность огромного числа периферических тканей. Эти от­носительно неполярные и гидрофобные гормоны секретируются надпочечниками и половыми железами и разносятся кровью в связанном с белками плазмы виде, чтобы сохранять эффективную концентрацию свободного стероида во внеклеточной жидкости. Свободные стероиды, по-видимому, диффундируют во все клетки, но оказывают свое метаболическое действие только на ткани-ми­шени, обладающие специфическими внутриклеточными связываю­щими белками. Эти внутриклеточные рецепторы в свою очередь опосредуют влияние стероида на ядерные процессы, определяю­щие синтез белка. В некоторых клетках эффекты стероидов про­являются синтезом регуляторных ферментов, контролирующих метаболические реакции, что подтверждается действием кортико­стероидов на углеводный и белковый обмен. В других, более спе­циализированных, тканях стероиды ответственны за клеточную дифференцировку и образование специфических белков, высво­бождаемых в кровь или утилизируемых местно для вторичных процессов, что наблюдается в репродуктивных тканях, находя­щихся под контролем половых стероидов. Как правило, стероиды надпочечников индуцируют образование ферментов, контролиру­ющих внутриклеточные метаболические функции, тогда как по­ловые стероиды стимулируют также синтез белков, секретируемых клеткой-мишенью и участвующих в механизме размножения. Эти две крайности значительно перекрываются, и многие эффекты по­ловых стероидов оказываются связанными с регуляцией внутри­клеточных метаболических процессов в периферических тканях-мишенях. Анализ действия половых стероидов, таких, как эстра­диол и прогестерон, на синтез белков яйцеводов, в том числе на овальбумин и авидин, привел к существенному прогрессу в по­нимании молекулярной биологии эффектов стероидных гормо­нов.

Свойства и действия тиреоидных гормонов во многих отноше­ниях аналогичны таковым стероидов, несмотря на их очевидное сходство с пептидными гормонами и аминокислотными трансмит­терами. Тиреоидные гормоны, например, обладают липофильными свойствами, что более характерно для стероидов, чем для пептид­ных гормонов с их гидрофильной природой. Подобно этому, тиреоидные гормоны в крови в основном связаны со специфическими белками плазмы и диффундируют в свои клетки-мишени через небольшой пул свободного внеклеточного гормона. Тиреоидные гор­моны также действуют путем связывания с внутриклеточными рецепторами и, подобно стероидам, оказывают в основном свое действие путем регуляции ядерных процессов, что приводит к изменению биосинтетической и метаболической активности клет­ки-мишени [2].

В отличие от преимущественно ядерных эффектов стероидных и тиреоидных гормонов, действие пептидных гормонов опосредо­вано рецепторами клеточной поверхности, регулирующими фер­ментные системы плазматической мембраны и цитоплазмы. Это справедливо и в отношении простых трансмиттерных молекул, таких, как катехоламины и ацетилхолин, и в отношении многих пептидных, белковых и гликопротеиновых гормонов. Такие мо­лекулы взаимодействуют со специальными участками плазмати­ческой мембраны, которые распознают и связывают регулятор­ные лиганды [3]. Специфическое связывание с этими рецептора­ми клеточной поверхности изменяет активность связанных с мембраной эффекторных ферментов, которые, контролируя мемб­ранные и/или цитоплазматические процессы, опосредуют тем са­мым острые и долговременные изменения функции клетки-мишени. В некоторых тканях-мишенях, таких, как зависимые от ги­пофиза периферические эндокринные органы (надпочечники, щитовидная и половые железы), от действия пептидных гормо­нов зависит сохранение клеточной дифференцировки и функции. В этом смысле, тропные гормоны гипофиза (АКТГ, ТТГ, ФСГ) обладают некоторым функциональным сходством с половыми сте­роидами, поддерживающими дифференцированное состояние и секреторную активность гормонзависимых клеток-мишеней. Дру­гие пептидные гормоны, такие, как инсулин, пролактин и СТГ, по своей функции больше напоминают стероидные гормоны над­почечников, так как вызывают быстрые и долговременные изме­нения метаболических процессов, а не обеспечивают дифферен­цировку клеток-мишеней.

Приведенные обобщения относительно метаболических эффек­тов стероидных, тиреоидных и пептидных гормонов, удобны для широкой функциональной классификации гормональных эффек­тов, но не следует упускать из виду областей перекрывания био­химических функций этих разных классов лигандов. По существу гормоны представляют собой циркулирующие «сигналы» или ин­формационные посылки, которые, будучи узнанными и связан­ными соответствующими поверхностными или внутриклеточными рецепторами, вызывают запрограммированные реакции своих кле­ток-мишеней. Проводить общее различие между стероидными и тиреоидными гормонами, с одной стороны, и пептидными гормо­нами, с другой, как регуляторами «ядерных» и «цитоплазмати­ческих» процессов соответственно удобно для дифференцирова­ния крайних особенностей действия этих лигандов. В то же время известно, что стероидные и тиреоидные гормоны оказывают и вне-ядерное действие, а некоторые пептидные гормоны влияют, по-ви­димому, и на экспрессию генов. В связи с этим с позиций спо­собности регулировать метаболическую активность клетки и вы­зывать функциональные реакции на стимуляцию, два общих класса гормонов не имеют абсолютных различий.

РЕЦЕПТОРЫ ПЕПТИДНЫХ ГОРМОНОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Пептидные гормоны и молекулы трансмиттеров оказывают свое действие на клетки-мишени, связываясь прежде всего со специ­фическими, обладающими высоким сродством, рецепторными участками на плазматической мембране. Существование таких ре­цепторов обнаружено прямыми исследованиями по связыванию радиоактивных лигандов в огромном числе клеток-мишеней пеп­тидных гормонов и нейротрансмиттеров. В некоторых тканях на­сыщенность специфических связывающих мест меченым гормо­ном коррелирует с активацией характерных для клеток-мишеней реакций, что указывает на биологическую значимость таких мест в качестве рецепторов гормонов. В других тканях пептидные ре­цепторы идентифицированы условно только по высокому сродству и специфичности связывания биологически активных форм гормональных гомологов. Применение конкурентных антагонистов (если они существуют), блокирующих как связывание гормона, так и последующую реакцию клетки-мишени, позволило получить дополнительные доказательства биологической значимости нескольких гормональных рецепторов. Некоторые рецепторные места, например для ацетилхолина и катехоламинов, охаракте­ризованы с помощью меченых антагонистов. Относительно низ­кое сродство ацетилхолиновых рецепторов к холинергическим ли­гандам или низкая концентрация специфических b-адренергиче­ских мест на клетках-мишенях создают трудности для характеристики этих рецепторов путем исследований с примене­нием меченых агонистов.

Рис. 4—2. Концепция, предложенная Sutherland, согласно которой гормону отводят роль первого медиатора, а цАМФ (или другим веществам) — вто­рого (внутриклеточного) медиатора, с помощью которого осуществляется действие пептидных гормонов (Sutherland, Robison[4] в модификации).

Мнение о клеточной мембране как о месте действия пептид­ных гормонов сформировалось на основании наблюдений Suther­land, согласно которым взаимодействие катехоламинов с плазма­тической мембраной эритроцитов голубя приводит к активации аденилатциклазы [4]. После этого было показано, что многие пеп­тидные гормоны связываются с рецепторами плазматической мембраны и влияют на локализованную в ней активность, такие, как аденилатциклаза или механизмы ионного транспорта (рис. 4—2). О поверхностной локализации рецепторов пептидных гормонов свидетельствует и тот факт, что кратковременное воз­действие гормона вызывает длительную реакцию клеток-мишеней, которую можно отнести за счет связанного гормона, а также спо­собность специфических антисывороток быстро прекращать дей­ствие пептидных гормонов in vitro. Известно также, что ферменты или другие агенты, влияющие на мембранные белки и липиды, модифицируют или ликвидируют способность пептидных гормонов стимулировать аденилатциклазу. Наиболее веские доказательства локализации рецепторов пептидных гормонов на плазматической мембране были получены в авторадиографических исследованиях и прямых опытах по связыванию меченых биологически активных гормонов с препаратами мембран или интактными клетками. Эти подходы позволили точно выяснить локализацию и параметры связывания клеточных рецепторных участков, а также их функ­циональную связь с реакциями клетки-мишени.

Способность пептидных гормонов взаимодействовать с клет­ками-мишенями (или наоборот) должна зависеть от присутствия специфических участков связывания на плазматической мембране (рецепторов), которые извлекают несущие информацию молекулы из внеклеточной жидкости. Так, «осведомленность» клеток пуч­ковой зоны коры надпочечников в отношении гипофизарных ре­гулирующих влияний определяется концентрацией и профилем секреции АКТГ, поступающего к надпочечным железам. Чрез­вычайно низкие концентрации (около 10~¹⁰ M) гипофизарных гормонов в крови при миллионнократном избытке других белков требуют, чтобы рецепторы клеток-мишеней обладали как высокой специфичностью (позволяющей узнавать гормон), так и высоким сродством к гормону (позволяющим связывать его при низкой концентрации). Хорошо изученный класс рецепторов для «тради­ционных» пептидных гормонов (таких, как тропные пептиды ги­пофиза и гормоны желудочно-кишечного тракта) пополнился ана­логичными участками для местных и дистантных трансмиттерных молекул (таких, как ацетилхолин, катехоламины и простаглан­дины), а позднее и для группы, состоящей примерно из 20 нейропептидов (как ранее известных, так и недавно обнаруженных), которые регулируют, по-видимому, функцию периферической и центральной нервной системы. Это огромное число «пептидных» гормонов характеризуется высоким зарядом и относительной гидрофильностью, отсутствием значительного связывания с белками плазмы и способностью связываться со специфическими распо­знающими участками на открытой области рецепторных молекул. встроенных в плазматическую мембрану клеток-мишеней.

Считают, что другая специализированная область внутренней, ассоциированной с мембраной, части рецепторов пептидных гор­монов взаимодействует с внутримембранной частью эффекторных молекул или ферментов, таких, как аденилатциклаза, чей ката­литический домен доступен с внутренней, цитоплазматической, поверхности клеточной мембраны. Хотя в настоящее время из­вестно, что многие пептидные гормоны после связывания с по­верхностными рецепторами все же проникают в клетку, первона­чальное взаимодействие с наружной поверхностью плазматической мембраны является необходимым условием стимуляции реакций клеток-мишеней, поскольку внутриклеточное введение пептидных гормонов не вызывает характерных реакций таких клеток. За связыванием гормона с поверхностным рецептором наступает активация одной или более мембранных эффекторных систем, определяющая изменения в механизмах транспорта и распреде­ления ионов, а также активацию цитоплазматических процессов, которые регулируют функцию клетки-мишени. Многие из этих этапов активации включают, по-видимому, фосфорилирование мембранных или цитоплазматических белков, что приводит к из­менению ферментативных функций, ответственных за транспорт пли метаболизм молекул, играющих важную роль в клеточной активности. Главным мембранным ферментом, регулируемым пеп­тидными гормонами, является аденилатциклаза, катализирующая образование цАМФ, необходимого для процессов фосфорилирова­ния, возникающих при стимуляции клетки-мишени. К другим мембранным ферментам, на активность которых влияет гормон-рецепторное взаимодействие, относятся ферменты, участвующие в кругообороте инозитола, метилтрансферазы, принимающие уча­стие в метилировании фосфолипидов, а также фосфолипазы, от­ветственные за деацилирование мембранных фосфолипидов. По­следний процесс служит источником образования предшественни­ков (таких, как арахидоновая кислота) простагландинов, тромбо­ксанов, простациклинов и других активных метаболитов. На­блюдались также гормональные влияния на Na+, К+-зависимую АТФазу, связанную с мембраной протеинкиназу и катехол-О-метилтрансферазу. Таким образом, на уровне плазматической мемб­раны гормоны индуцируют множество процессов, участвующих в интегрированных реакциях клеток-мишеней на активацию рецеп­торов гомологичным лигандом.

ХАРАКТЕРИСТИКА РЕЦЕПТОРОВ ПЕПТИДНЫХ ГОРМОНОВ

Исследования по связыванию, проводимые с помощью меченных радиоактивными атомами гормонов, позволили выявить некоторые характерные особенности, свойственные рецепторам многих пеп­тидных гормонов. Универсальной чертой рецепторов является их способность распознавать и связывать соответствующие химические передатчики или гормоны в присутствии избытка молекул других видов. Это свойство легко проявляется в присутствии ме­ченого гормона как избирательная реакция связывания с высоким сродством, которая приводит к образованию специфического гормонрецепторпого комплекса. За последние несколько лет такие взаимодействия наблюдались во многих гормончувствительных тканях. Во многих исследованиях наличие специфических связы­вающих мест в соответствующих тканях-мишенях принимали за  доказательство присутствия гормональных рецепторов. Специфи­ческие связывающие места обнаружены также в клетках, кото­рые не принято считать клетками-мишенями, например рецепто­ры инсулина и СТГ в лимфоцитах, рецепторы пролактина в пе­чени и надпочечниках. Если учитывать, что правильное представление о рецепторах предполагает присутствие не только распознающего, но и запускающего реакцию компонента, то под такое определение не подходят рецепторы, для которых функцио­нальная реакция пока остается не выясненной, а также рецепто­ры, которые выделены, солюбилизированы или расположены на нереагирующих клеточных компонентах. Таким образом, рецептор характеризуется специфическим связыванием лиганда и способ­ностью передавать регуляторный сигнал, если даже дистальные элементы реакции отсутствуют или неидентифицированы.

Наиболее полное представление о рецепторе пептидного гор­мона включает двоякие функциональные свойства: поверхностное распознавание и трансляцию гормонрецепторного взаимодействия в специфическую биологическую реакцию. Независимо от того, является ли клеточной реакцией секреция пептидов, стероидогенез, сокращение или транспорт ионов, механизмы, опосредующие гормональный эффект, обычно включают изменение кальциевых потоков и метаболизма циклических нуклеотидов. На мембранных фракциях или интактных клетках многих тканей-мишеней наблю­дали зависимость между связыванием гормона и биохимическими реакциями. Корреляция между насыщенностью рецепторов и ак­тивностью аденилатциклазы продемонстрирована на препаратах мембран многих гормончувствительных клеток, например клеток надпочечника в случае действия АКТГ, печени в случае действия глюкагона, почек при добавлении вазопрессина, эритроцитов птиц под влиянием катехоламинов, семенных канальцев в присутствии ФСГ, а также семенников и яичников в присутствии ЛГ и ХГЧ. В интактных тканях и изолированных клетках-мишенях связы­вание гормона также коррелировало с синтезом и высвобождени­ем цАМФ [6]. Корреляцию связывания гормона с последующими клеточными реакциями наблюдали в отношении инсулина и окис­ления глюкозы в жировых клетках или транспорта аминокислот в тимоцитах, катехоламинов и транспорта натрия в эритроцитах,. ЛГ и продукции андрогенов семенниками, а также ангиотензи­на II и продукции альдостерона клетками клубочковой зоны над­почечника.

Иногда полагают, что гормональными рецепторами следует называть только те связывающие места ткани, которые можно отождествить с определенной биохимической реакцией. Однако» специфическое связывание меченых лигандов при условии соблю­дения адекватных требований к методике его определения все-же является веским указанием на присутствие гормональных ре­цепторов. К таким требованиям относятся использование мече­ного гормона с отчетливой биологической активностью (получен­ного с помощью монойодирования или тритирования), точная оценка неспецифического связывания и исключение связывания с разрушающими или другими ферментативными активностями, присутствующими в тканевых фракциях. Большинство рецепторов пептидных гормонов проявляет высокую специфичность по отно­шению к биологически активным гормонам или их производным,, высокое сродство связывания, характеризующееся константами; равновесия ассоциации порядка 10⁹—10¹¹ М~¹, и насыщаемость при относительно низких концентрациях гормона. Последние свой­ства соответствуют низкой концентрации гормональных рецепто­ров в ткани-мишени, которая составляет обычно всего несколько» тысяч мест на клетку. Реакция связывания всегда зависит от тем­пературы, отличается высокой скоростью и в бесклеточных пре­паратах обычно обратима. В интактных клетках недавно был об­наружен необратимый компонент связывания гормона, и для тромбина и фактора роста эпидермиса (ФРЭ) было показано ко­валентное присоединение лиганда к рецептору. Точное опре­деление констант связывания и термодинамических свойств ре­цепторов часто затрудняется тем, что в опытах по связыванию, проводимых in vitro при физиологических температурах, может иметь место деградация гормона и рецептора. В условиях же, свойственных экспериментам in vivo, также трудно изучать ки­нетические и связывающие свойства рецепторов гормонов. На скорость ассоциации и диссоциации гормона большое влияние оказывает температура, а кругооборот молекул гормона в местах рецепции при характерных для организма условиях температуры и перфузии изучен недостаточно.

Белковая природа рецепторов полипептидных гормонов на плазматической мембране доказывается их расщеплением под действием различных протеолитических ферментов и пептидаз. На многие рецепторы влияет также фосфолипаза, что указывает на содержание в них важного фосфолипидного компонента или на роль ассоциации с фосфолипидной структурой мембраны в проявлении связывающей активности. Сообщалось, что некото­рые рецепторы (для инсулина, ЛГ и ТТГ) содержат углеводные компоненты, иногда влияющие на связывающую активность. От­дельные рецепторы, такие, как рецепторы ЛГ, ФСГ и пролактина, для сохранения своей биологически активной конформации тре­буют присутствия дисульфидных групп.

Физико-химическая характеристика рецепторов пептидных гор­монов затрудняется в результате их относительной нераствори­мости, что свойственно многим белкам, содержащимся в мембра­не. В нескольких тканях из клеток и клеточных частиц удалось выделить рецепторы с помощью ограниченного ферментативного расщепления или инкубации в условиях, способствующих высво­бождению поверхностных белков. Однако растворимые гормональ­ные рецепторы для физико-химического анализа получают обыч­но путем экстрагирования из мембранных фракций и гомогенатов с помощью неионных детергентов, таких, как тритон Х-100 и люброл. Растворение плазматических мембран детергентами обыч­но приводит к утрате функционального сопряжения между гормонсвязывающими местами и ассоциированными с мембраной ак­тивностями, такими, как аденилатциклаза. Однако после удаления детергента наблюдается частичное восстановление гормонстимулируемой активности аденилатциклазы, а иногда после экстраги­рования из тканевых фракций неионными детергентами солюбилизированная аденилатциклаза сохраняет чувствительность к гор­мону. В настоящее время из клеточных мембран экстрагированы специфические места связывания ацетилхолина, ангиотензина II, инсулина, глюкагона, ЛГ — ХГЧ, ФСГ, пролактина и» гормона роста [8].

Переформированные гормонрецепторные комплексы, образуе­мые путем насыщения тканей-мишеней меченым гормоном, мож­но легко экстрагировать с помощью обработки неионными детергентами. Такие гормонрецепторные комплексы обычно более ста­бильны в растворе, чем свободные, или «ненагруженные» рецепторы, и создают некоторые преимущества для физической характеристики. Яичниковые рецепторы ЛГ, предварительно ме­ченные in vivo путем инъекции радиоактивного гонадотропина, обладают теми же самыми физическими свойствами, что и гор­монрецепторные комплексы, образуемые путем метки нераство­римых фракций in vitro до солюбилизации. Некоторые свободные рецепторы и гормонрецепторные комплексы анализировали с по­мощью гельфильтрации и центрифугирования в градиенте плот­ности, и их молекулярная масса колебалась от 150 000 до 400 000.

Большинство солюбилизированных детергентом рецепторов при физическом анализе обнаруживают свойства молекул удлиненной формы с относительно большими для их констант седиментации (6,5—9,08) гидродинамическими радиусами в 6—7 нм. Эти свой­ства во многом обусловлены гликопротеиновой природой и выра­женной асимметрией рецепторной молекулы, но отчасти могли бы объясняться и связыванием детергента с солюбилизированным белком. Очистку солюбилизированных детергентом гормональных рецепторов производили с помощью соответствующих методик фракционирования, а также аффинной хроматографии на гель-лигандных комплексах. Обычно такая очистка ограничена; глав­ное исключение составляет холинергический рецепторный белок из ткани электрических органов некоторых рыб. С помощью аффинной хроматографии очищали также изолированные рецепторы инсулина, ЛГ — ХГЧ и пролактина. Хотя выход был весьма небольшим, но очищенные рецепторы оказались относительно ста­бильными и сохраняли высокое сродство и специфичность связы­вания гормональных лигандов. Этим методом тестикулярные ре­цепторы ЛГ были очищены примерно в 15000 раз, т. е. до 50% гомогенности белка. Наиболее высоко очищенный препарат ре­цептора ЛГ мигрирует при SDS-гель-электрофорезе в виде одного-компонента с молекулярной массой около 90 000, что свидетель­ствует о том, что экстрагированный детергентом рецептор пред­ставляет собой димер, состоящий из двух близких субъединиц [6]. Рецепторы пролактина и СТГ из ткани молочной железы и печени также были очищены с помощью аффинной хроматогра­фии, причем было показано, что антитела, полученные к очи­щенным рецепторам пролактина, ингибируют биологическое дей­ствие этого гормона на его ткани-мишени [9]. Для анализа струк­турных особенностей, определяющих связывание гормона и активацию ассоциированных с мембраной ферментных систем, которые опосредуют его действие, необходима очистка больших количеств рецепторных мест.

Рис. 4—3. «Плавающий рецептор»—двухстепенная физическая модель взаи­модействия пептидного гормона с рецептором и активации аденилатцикла­зы в клеточной мембране.

РЕЦЕПТОРЫ ПЕПТИДНЫХ ГОРМОНОВ И КОМПОНЕНТЫ МЕМБРАНЫ

Хотя термин «рецептор» удобен для описания связывающих ком­понентов мембраны, с которыми взаимодействует гормон, исполь­зование его означает отсутствие сведений о специфических хи­мических структурах, участвующих в реакции связывания. Если взаимодействующий участок вещества или лиганда известен, то точнее было бы при описании использовать его структуру, а не термин «рецептор». Рецепторы можно характеризовать по их спе­цифической «узнающей» и связывающей функциям или, более широко, по тем изменениям, которые приводят к развертыванию специфической биологической реакции. Для объяснения механиз­мов, с помощью которых связывание с рецептором приводит к модификации мембранных ферментов, предложено несколько ги­потез. На смену первоначальной точке зрения, согласно которой гормональные рецепторы структурно объединены с аденилатцик­лазой и играют роль регуляторной субъединицы фермента, при­шли другие, точнее соответствующие данным о жидкой природе клеточных мембран.

Гипотеза мобильного рецептора, предложенная для объясне­ния механизма модуляции аденилатциклазы в клеточной мембра­не гормонрецепторным взаимодействием [10], основана на пред­положении, что рецепторные и ферментные белки представляют собой отдельные и разные молекулы (рис. 4—3). Считают, что связывание гормона с рецептором повышает сродство последнего к другим мембранным компонентам, участвующим в активации аденилатциклазы. Такая двухстепенная модель гормонрецепторного взаимодействия с аденилатциклазой согласуется с возмож­ностью латеральной диффузии молекул рецепторов и фермента в жидком матриксе плазматической мембраны. Она объясняет также отсутствие аддитивности в активации аденилатциклазы многочисленными гормонами в определенных клетках и модуля­цию независимых мембранных процессов одним гормоном, если предположить, что его комплекс с рецептором обладает сродством не к одной, а к нескольким регуляторным молекулам. Мобиль­ность гормональных рецепторов в жидком матриксе мембраны могла бы также иметь значение для активации аденилатциклазы в эпителиальных клетках, обладающих морфологической поляр­ностью, например в кишечнике, почках, печени и мочевом пузы­ре. Наконец, конкурентные антагонисты пептидных гормонов представляются молекулами, сохраняющими сродство связывания с рецепторами, но лишенные способности вызывать изменения конформации и реактивности последних, необходимые для акти­вации аденилатциклазы.

Хотя рецепторные места для гормонов, по-видимому, физиче­ски отделены от аденилатциклазы, эти две молекулы обладают очевидной тесной функциональной связью, подтверждающей пред­положения о рецепторе как о регуляторном участке аденилат­циклазного комплекса. В некоторых тканях соответствие между концентрацией гормональных рецепторов и активностью адени­латциклазы свидетельствует о существовании тесно связанного рецепторциклазного комплекса в мембранах клеток-мишеней. За­висимость гормональной активации аденилатциклазы от фосфо-липидов, наблюдаемая в некоторых мембранных и солюбилизированных препаратах, указывает на необходимость сопрягающего компонента липидной природы для ассоциации этих двух активностей. Изучение взаимоотношений между специфическими гор­мональными рецепторами и активностью аденилатциклазы в раз­ных физиологических условиях и на разных стадиях развития также выявило тесную корреляцию между обоими параметрами. Так, появление рецепторов гонадотропина в семенниках плода тесно связано с приобретением клетками способности реагировать изменением уровня цАМФ на стимуляцию ЛГ и способности син­тезировать тестостерон [11]. Более того, десенситизация клеток-мишеней путем воздействия агонистов часто сопровождается од­новременной утратой гормончувствительной аденилатциклазы ц гормональных рецепторов. Опыты с десенситизацией обнаружили также уменьшение общей активности имеющейся аденилатцикла­зы, что указывает на инактивацию значительной части аденилат­циклазы при насыщении рецепторов гормонами. Такие временные и количественные корреляции между двумя активностями под­черкивают тесную физическую связь рецепторов пептидных гор­монов с аденилатциклазой в клеточной мембране.

Более современные модели пытаются учитывать функциональ­ную сложность аденилатциклазной системы, содержащей не ме­нее трех участков, с которыми реагируют отдельные лиганды, изменяя активность фермента. К ним относятся участок, взаимо­действующий с гормоном, каталитический или ферментативный участок, реагирующий с Mg-АТФ, и промежуточный регулятор­ный участок, взаимодействующий преимущественно с гуаниловыми нуклеотидами. Изучение влияния гуаниловых нуклеотидов на активацию печеночной аденилатциклазы глюкагоном показало, что аденилатциклазный комплекс существует в различных формах, которые могут переходить друг в друга при согласованном дей­ствии гормона и гуанилового нуклеотида [12]. После этого ана­логичные эффекты ГТФ наблюдали на многих гормончувстви­тельных тканях. Синтетические аналоги ГТФ, устойчивые к фер­ментативному гидролизу, также стимулируют большинство аденилатциклазных систем, что указывает на роль гуаниловых нуклеотидов в качестве аллостерических активаторов аденилат­циклазы. Один из таких аналогов Gpp (NH) p активирует адени­латциклазу, взаимодействуя с тем же самым участком, с которым реагирует и ГТФ. В некоторых тканях связывание меченого Gpp (NH) p с клеточными мембранами коррелирует со степенью активации аденилатциклазы. Сочетанное воздействие гормона и-Gpp (NH) p вызывает длительную активацию аденилатциклазы,. причем в очень многих тканях животных Gpp (NH) p повышает как исходную, так и стимулированную гормоном активность это­го фермента. Такие эффекты ГТФ и его аналогов свидетельству­ют о том, что регуляция взаимодействия между нуклеотидами и каталитическим участком аденилатциклазы составляет общую» черту действия пептидных гормонов (рис. 4—4).

Рис. 4—4. Трехкомпонентная мо­дель системы гормональный ре­цептор (Р) — аденилатциклаза. Гормон-рецепторный комплекс мо­дулирует ГТФ-связывающую ак­тивность гуанилнуклеотид регу­ляторной субъединицы (ГНРС), в свою очередь активирующей аденилатциклазу (АЦ). Вызыва­емая гормоном (Г) активация комплекса ГТФ-ГНРС прекра­щается после гидролиза ГТФ на регуляторной субъединице или вблизи ее.

Действие гуаниловых нуклеотидов на аденилатциклазу часто сопровождается уменьшением связывающей способности соответ­ствующих мест рецепции гормона. Как ГТФ, так и Gpp (NH) p-уменьшают сродство рецепторов к глюкагону, ангиотензину II и? катехоламинам, повышая константу скорости диссоциации гормон-рецепторного комплекса. Причина зависимости сродства рецепто­ров от действия гуаниловых нуклеотидов на активность фермен­та неясна, но влияние на связывание гормона могло бы пред­ставлять собой эффект, отдельный от активации аденилатциклазы.

ПРИРОДА ГОРМОНРЕЦЕПТОРНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

Известно, что связывание пептидных гормонов с их рецепторами на плазматической мембране клеток обусловлено как гидрофоб­ными, так и электростатическими взаимодействиями. О значении гидрофобных эффектов в связывании пептидного гормона с рецептором свидетельствуют температурные влияния на процесс связывания. Для некоторых пептидов, таких, как АКТГ и ангио­тензин II, показана и роль электростатических взаимодействий в связывании с рецепторами. В связывании АКТГ рецепторами надпочечников важную роль играет основной участок молекулы гормона; на связывание ангиотензина II с надпочечниковыми рецепторами также сильно влияет основность N-концевого амино­кислотного остатка. Процессы активации, обусловленные связы­ванием гормона, в свою очередь могут зависеть от электростати­ческих эффектов. Так, низкие концентрации полилизина стиму­лируют аденилатциклазу и стероидогенез в надпочечниках и клетках Лейдига, по-видимому, путем электростатического взаи­модействия с анионными группами плазматической мембраны.

Дальнейшему выяснению роли гидрофобных взаимодействий в рецепторном связывании способствовали рентгенодифракпионные исследования трехмерной структуры инсулина и глюкагона [13]. В молекуле инсулина относительно постоянный участок поверх­ности, определяющий биологическую активность, содержит много гидрофобных аминокислотных остатков. Предполагают, что свя­зывание инсулина с его рецептором—это процесс, аналогичный димеризации, обусловленный аддитивными эффектами гидрофоб­ных взаимодействий и водородных связей. Влияние модификации специфических аминокислотных остатков на биологическую ак­тивность и рецепторное связывание коррелирует с изменением конформации молекулы инсулина, и для полного связывания с рецептором необходимо несколько аминокислотных остатков ин­сулина.

В отличие от инсулина, имеющего относительно ригидную структуру, определяющую нужное для рецепторного связывания трехмерное расположение аминокислот, молекула глюкагона об­ладает удлиненной и чрезвычайно гибкой структурой. Подобно инсулину молекулы глюкагона легко агрегируют под действием гидрофобных связей, образуя в этом случае трехмерную структу­ру. При тех низких концентрациях глюкагона, которые присут­ствуют в крови, этот гормон, вероятно, циркулирует в виде мономера, имеющего случайную конформацию. Предполагают, что биологически активной конформацией является спиральная струк­тура, взаимодействующая с рецептором двумя гидрофобными уча­стками, расположенными на каждом конце спирали, и что для активации аденилатциклазы существенное значение имеет круп­ная аминоконцевая часть молекулы.

Эти наблюдения свидетельствуют о том, что молекулы как инсулина, так и глюкагона в процессе отложения в гранулах ас­социируются с помощью своих гидрофобных участков; связыва­ние их с рецепторами также определяется преимущественно гид­рофобными взаимодействиями. Существование двух гидрофобных участков, впервые обнаруженное в мономере глюкагона, было отмечено и в молекулах секретина и вазоактивного интестинального пептида. Некоторые меньшие по размерам молекулы, такие, как тиротропин-рилизинг гормон, рилизинг-гормон лютеинизиру­ющего гормона, ангиотензин II и брадикинин, также обладают двойной симметрией. Это позволило предположить, что симмет­ричные свойства пептидных последовательностей отражаются в структуре рецепторов и что такие пептиды связываются с двумя сходными или идентичными субъединицами рецептора. Две субъ­единицы недавно были обнаружены в рецепторах ЛГ, инсулина и ангиотензина II, тогда как рецептор ацетилхолина состоит из нескольких субъединиц. Такая состоящая из субъединиц струк­тура гормональных рецепторов могла бы отражать их общее свой­ство, связанное с эволюцией симметрии и внутренней гомологии пептидных гормонов, равно как и с возникновением кооператив­ных взаимодействий при контакте с рецепторами.

Процессы, обусловливающие окончание гормонрецепторного взаимодействия in vivo, выяснены недостаточно. Хотя реакция связывания может, конечно, быть обратимой, но, в соответствии с законом действия масс, механизм, определяющий продолжи­тельность активации рецептора в интактной клетке, по-видимому, отличается от простой диссоциации. Можно было бы предполо­жить разрушение высвобождающегося из комплекса с рецепто­ром гормона, но разрушение большинства гормонов изолирован­ными клетками-мишенями не зависит от взаимодействия с ре­цепторами. Кроме того, гормон, который специфически связывается тканями-мишенями, после элюции с рецепторов пол­ностью сохраняет свою биологическую активность. Это свойство можно использовать для очистки радиоактивных гормонов с по­мощью аффинной хроматографии на осажденных рецепторах, что­бы выделить биологически активные молекулы из меченых гор­мональных препаратов. Как будет показано далее, часть гормон-рецепторных комплексов инактивируется или разрушается в живых клетках в ходе процессов, включающих интернализацию и лизосомный катаболизм.

НАСЫЩЕННОСТЬ РЕЦЕПТОРОВ И АКТИВАЦИЯ РЕАКЦИЙ КЛЕТОК-МИШЕНЕЙ

Большинство исследований, посвященных результатам гормонрецепторных взаимодействий, свидетельствуют о том, что актива­ция аденилатциклазы и реакций клеток-мишеней является функ­цией насыщенности рецепторов. Во многих тканях, однако, срод­ство связывания рецепторов оказывается меньшим, чем концентрация гормона требуемая для развития полумаксимальной биологической реакции, а полная биологическая реакция называ­ется насыщением небольшой части имеющихся рецепторов. Даже в тех случаях, когда все большее насыщение рецепторов сопро­вождается ростом реакций в широких пределах связывания гор­мона, степень реакции обычно непропорциональна числу занятых рецепторов. Кроме того, известно, что многие гормоны способны стимулировать продукцию гораздо большего количества цАМФ, чем это необходимо для индукции максимальной биологической реакции в клетке-мишени. Такие наблюдения привели к выводу, что многие гормончувствительные ткани характеризуются «запа­сом» или «избытком» рецепторов, или «рецепторным резервом», что аналогично ситуации, описанной Stephenson при изучении тканей, чувствительных к лекарственным веществам [14]. Несом­ненно, что такие рецепторные участки клетки не являются лиш­ними; предполагают, что они играют роль резервуара поверхност­ных рецепторов, обеспечивающего возможность повышения чув­ствительности клеток-мишеней к активирующему влиянию низких концентраций гормона. Таким образом, высокая плотность по­верхностных рецепторов могла бы способствовать быстрой ассо­циации и достижению критических или пороговых уровней на­сыщенности, обусловливающих активацию клетки-мишени.

Рис. 4—5. Связывание гормо­на, образование цАМФ и про­дукция стероидов при стиму­ляции клеток половых желез и надпочечников тропным гор­моном.

1 — реакция (например, продук­ция стероида); 2 — связанный гормон: 3 — цАМФ.

Важно подчеркнуть, что термин «запас» применяется в отно­сительном смысле и что степень избыточности рецепторов может варьировать в зависимости от регистрируемой биологической ре­акции. Например, в отношении активации аденилатциклазы ред­ко наблюдается «запас» рецепторов, поскольку существует четкая корреляция между связыванием и активностью аденилатциклазы, хотя иногда может встречаться и нелинейная зависимость между насыщенностью рецепторов и реакцией фермента. Подобно этому, связывание гормона с интактными клетками-мишенями обычно сопровождается прогрессирующим увеличением продукции цАМФ, и большинство тканей не содержит избытка рецепторов, который не был бы сопряжен с аденилатциклазой. Однако при регистрации более «дистальных» реакций, таких, как мышечное сокращение, стероидогенез, окисление глюкозы, липолиз и транспорт ионов, часто обнаруживается, что максимальная биологическая реакция воспроизводится при насыщении только небольшой фракции по­пуляции рецепторов (рис. 4—5). Совершенно очевидно, что от­носительно большой пул рецепторов в мембране клетки-мишени должен облегчать активацию малого их числа (необходимого для достижения порога индукции клеточной реакции).

Избыток рецепторов легче всего установить путем непосред­ственного изучения связывания меченых гормонов с интактными плетками- и тканями-мишенями. Это особенно заметно в интер­стициальных клетках семенников, где достаточно насытить менее 1% общей популяции рецепторов, чтобы вызвать полную актива­цию стероидогенеза и продукции тестостерона [15]. Однако в тех же самых клетках дальнейшее связывание меченого гонадотропи­на сопровождается прогрессированием роста продукции и высво­бождения цАМФ. Это свидетельствует о том, что большинство или даже все связывающие места, выявляемые при взаимодейст­вии с радиоактивным гормоном, являются функционально актив­ными рецепторами, способными стимулировать активность адени­латциклазы и образованием цАМФ.

В некоторых тканях связывание гормона и последующая био­логическая реакция тесно сопряжены во всем диапазоне насыщен­ности рецепторов. Так, насыщенность рецепторов ангиотензина II в клубочковой зоне коры надпочечников коррелирует с увеличе­нием стероидогенеза и продукции альдостерона во всем диапазо­не связывания гормона. Пусть даже зависимость между связы­ванием ангиотензина II и продукцией альдостерона и нелинейна, но такая корреляция указывает на отсутствие «запаса» рецепто­ров в отношении стероидогенеза в клетках этого типа [16]. По­добно этому, на изолированных клетках вилочковой железы на­блюдали тесную корреляцию между связыванием инсулина и сти­муляцией транспорта аминокислот. Возможно, существуют широкие колебания зависимости между насыщенностью рецепто­ров и специфической реакцией клеток в разных тканях-мишенях от одной крайности в случае интерстициальных клеток семенни­ков, полная активация которых происходит при минимальной на­сыщенности рецепторов, до другой — почти непрерывной зависи­мости между насыщенностью и реакциями, что встречается в клетках клубочковой зоны коры надпочечников и вилочковой же­лезы. В клетках одного типа, например жировых клетках, повы­шение степени насыщения рецепторов при воздействии инсулина вызывает последовательный ряд реакций. Угнетение липолиза в этом случае происходит при очень низкой насыщенности рецеп­торов, стимуляция обмена глюкозы оказывается максимальной при насыщении всего 2—3% рецепторов, а стимуляция транспор­та аминокислот и синтеза белка наблюдается при высокой сте­пени насыщенности рецепторов [17].

Как правило, в тех случаях, когда связывание гормона и био­логические реакции тесно коррелируют между собой, именно ре­цепторы лимитируют активацию клеток-мишеней. Если же име­ется «запас» рецепторов, лимитирующими являются более «ди­стальные» элементы; лимитирующий этап при этом в случае ре­акций, опосредуемых цАМФ, локализуется, по-видимому, на уров­не активации протеинкиназ.

РЕГУЛЯЦИЯ РЕЦЕПТОРОВ ПЕПТИДНЫХ ГОРМОНОВ

Способность клеток-мишеней реагировать на изменение окружа­ющей концентрации лигандов изменением количества и/или срод­ства поверхностных рецепторов установлена в отношении очень многих гормонзависимых тканей [18]. Саморегуляция мембранных рецепторов, впервые показанная в отношении поверхностных антигенов, обнаружена в клетках, испытывающих воздействие многих лигандов, в том числе нейротрансмиттеров, пептидов, бел­ковых и гликопротеиновых гормонов, а также поверхностно-мо­дулирующих факторов, например лектинов и иммуноглобулинов. Во многих клетках-мишенях наблюдали феномен десенситизации клеточных реакций под влиянием лигандов-агонистов, причем в некоторых случаях это коррелировало с потерей рецепторных участков, или «снижающей регуляцией». Механизм регуляции ре­цепторов гомологичными лигандами связан, вероятно, с мобиль­ным поведением рецепторов пептидных гормонов в плазматиче­ской мембране. Мобильность гормональных рецепторов становит­ся очевидной при их взаимодействии с эффекторными белками мембраны, такими, как аденилатциклаза, а также при вызывае­мом лигандами образовании «пятен» или «нашлепок» рецепторов. Изучение судьбы рецепторов в процессе регуляции со стороны лигандов обнаружило способность пептидных гормонов проникать в свои клетки-мишени, что противоречило прежнему представле­нию о незначительной роли интернализации в действии белковых гормонов. В настоящее время установлено, что эффекты гормо­нальной стимуляции клеток-мишеней включают сложные цепи процессов, которые не только обусловливают характерную кле­точную реакцию, но и регулируют отдельные компоненты самого механизма активации, а также изменяют реакцию на последую­щую стимуляцию гормонами.

ОБЩИЕ АСПЕКТЫ РЕГУЛЯЦИИ РЕЦЕПТОРОВ

Многие рецепторы пептидных гормонов регулируются гомологич­ным гормоном, а иногда и другими гормонами. Повышение кон­центрации гормона обычно приводит к уменьшению числа соот­ветствующих рецепторов, что впервые было показано в отноше­нии инсулиновых рецепторов печени и культивируемых лимфоцитов [19]. Такая «снижающая регуляция» инсулиновых рецепторов встречается при ожирении у человека и при генети­ческом или индуцированном ожирении у грызунов и отражает, по-видимому, влияние избытка инсулина в крови на число своих рецепторов. По всей вероятности, эта потеря рецепторов являет­ся общим результатом повышения уровня инсулина в крови, со­провождающего инсулинрезистентные состояния. Обратный эф­фект, т. е. увеличение числа инсулиновых рецепторов в условиях сниженной секреции инсулина, наблюдали в печени хомяков и крыс с диабетом. Другими примерами «снижающей регуляции» рецепторов гомологичными гормонами служат взаимодействие СТГ, тиротропин-рилизинг гормона (ТРГ), катехоламинов, гона­дотропинов и глюкагона со своими рецепторами. Рецепторы неко­торых пептидных гормонов, таких, как пролактин и ангиотен­зин II, могут и увеличиваться в числе после воздействия повы­шенных концентраций гормона, но в таких случаях правилом является все же потеря рецепторов клеточной поверхностью. Некоторые рецепторы, особенно инсулиновые, при воздействии повышенных концентраций лиганда проявляют отрицательную кооперативность. Если это встречается и в физиологических усло­виях, то данный феномен мог бы служить еще одной формой ре­гуляции рецепторов, при которой частичная насыщенность их приводит к снижению сродства остальных связывающих мест с острым уменьшением чувствительности клеток-мишеней при уве­личении концентрации инсулина.

Важным фактором регуляции рецепторов является неполная обратимость реакции связывания, т. е. неполная диссоциация комплекса, образующегося в начальной фазе взаимодействия гор­мона с рецептором. При анализе гормонрецепторного взаимодей­ствия традиционно применяют методы, основанные на допущении обратимости образования комплекса, но данные кинетических ис­следований часто свидетельствуют о том, что гормонрецепторный комплекс, быстро диссоциируя вначале, затем распадается гораз­до медленнее и неполностью. Это указывает на появление таких конформационных изменений рецептора после начального взаи­модействия с гормоном, которые обусловливают более прочное связывание лиганда, что можно представить следующим уравне­нием: Г+ Р « Г•Р ® Г•Р .

Одна из форм связывания с более высоким сродством обуслов­ливается взаимодействием занятых рецепторов с компонентами аденилатциклазной системы, причем гуаниловые нуклеотиды мо­гут обеспечивать обратимость этого связывания. Такое состояние повышенного сродства наблюдали после связывания лиганда с рецепторами катехоламинов, глюкагона, простагландина Е, дофа­мина и мускариновых соединений [20]. Другая форма прочного связывания, которое становится все менее обратимым, характерна для рецепторов инсулина, ФРЭ, пролактина и ЛГ и отражает, по-видимому, предварительный этап по отношению к процессу интернализации гормонрецепторного комплекса. В любом случае длительная занятость недиссоциирующим лигандом всегда яв­ляется потенциальной причиной функциональной потери рецеп­торов и должна учитываться при исследовании их регуляции. По­мимо уменьшения числа связывающих мест, длительная заня­тость рецептора лигандом повышает вероятность разрушения или каких-либо иных процессов изменения и разрушения гормонрецепторных комплексов. К таким процессам могло бы относиться проникновение этих комплексов в толщу клеточной мембраны или «сбрасывание» их с клеточной поверхности, но современные данные свидетельствуют в пользу эндоцитоза и последующего лизосомного разрушения интернализованных гормонрецепторных комплексов.

Процессы роста клеток, движения и распознавания коорди­нируются супрамолекулярным комплексом поверхностных рецеп­торов и субмембранных фибриллярных структур, с помощью ко­торых изменения (поверхностная модуляция) конформации, подвижности и распределения рецепторов приводят к изменениям сопряженных цитоплазматических компонентов. Эти структурные взаимодействия, по всей вероятности, определяют образование конгломератов (кластеризация, возникновение «пятен» и «нашле­пок») рецепторов под действием перекрестно-связываемых аген­тов, таких, как двухвалентные антитела и мультивалентные лектины. Моновалентные лиганды, такие, как гормоны, также могут вызывать перераспределение рецепторов на клеточной мембране с кластеризацией мест связывания, образующих конгломераты на поверхности клеток. Такая кластеризация является, вероятно, важным фактором последующей интернализации гормонрепептор­ных комплексов, но может быть и существенным моментом ост­рой фазы гормонального эффекта (рис. 4—6). Так, двухвалент­ные антитела к рецепторам инсулина в изолированных адипоци­тах могут как связываться с рецептором, так и оказывать инсулиноподобное действие, тогда как моновалентные фрагменты антител Fab связываются с рецептором, но не вызывают биоло­гической реакции. Добавление анти-F (аb`)₂-антисыворотки перекрестно связывает рецептор Fab и восстанавливает инсулинопо­добное действие антитела [21]. Эти эффекты указывают на то, что перекрестное связывание или микроагрегация рецепторов представляет собой важный этап инсулиноподобных влияний ан­тирецепторных антител и, вероятно, также действия самого ин­сулина. Такое представление согласуется с данными о мобильно­сти инсулиновых рецепторов и их способности образовывать клас­теры на клеточной мембране, а также об инсулиноподобных эффектах некоторых лектинов.

Рис. 4—6. Распределение гормонрецепторных комплексов в мембране клет­ки-мишени при действии пептидного гормона.

содержание   ..  1  2  3  4  5  ..