Биологическая химия - часть 122

одного и того же гена тропомиозина позволяет получить семь изоформных

белков, специфичных для разных групп мышц (гладких и поперечно-

полосатых) или для фибробластов и миобластов. В то же время известны

примеры формирования одного белкового продукта (например, олиго-

мерного фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы) при экспрессии двух

разных генов. Все эти данные свидетельствуют о том, что альтернативный

сплайсинг может играть существенную роль в функционировании генома

клеток высших организмов.

В нетранскрибируемых последовательностях генома перед экзон-

интронами открыты специфические участки, названные промоторами, а

также  э н х а н с е р а м и (повышающие уровень транскрипции) и силан-

серами (ослабляющие уровень транскрипции). При взаимодействии с

белками они выполняют функции регуляторных сигналов при транскрип-

ции. Этот способ регуляции широко используется клетками эукариот как

в процессах дифференцировки, так и при индукции репрессии (см. главу 14).

Нельзя не упомянуть об открытии  р и б о з и м о в , т.е. молекул РНК,

выступающих в качестве катализатора. Пожалуй, это единственные из

известных макромолекул, которые наделены как информационной, так

и каталитической функцией. Открытие каталитических РНК поколебало

само понятие «фермент». Оказалось, что некоторые РНК осуществляют

посттранскрипционный процессинг, катализируя самосплайсинг, т.е. участ-

вуют в разрезании и удалении интронов. Наделенные рядом свойств

истинных и эффективных катализаторов рибозимы участвуют в двух типах

реакций: в гидролизе (разрыве) фосфодиэфирной связи и в реакциях

трансэтерификации. В качестве субстрата могут служить, помимо собствен-

ного, предшественник (про-РНК) и другие молекулы РНК. Сейчас ин-

тенсивно изучается третичная структура рибозимов, а первичная и вторичная

структуры ряда из них уже расшифрованы. Эти исследования, несомненно,

интересные сами по себе, могут пролить свет и на пути развития биоло-

гической эволюции.

Для полного понимания молекулярных механизмов сложного процесса

биогенеза мРНК предстоит решить множество вопросов. В частности,

необходимо выделить в чистом виде и охарактеризовать белковые фак-

торы, принимающие участие в этой регуляторной системе. Далее следует

раскрыть механизмы узнавания промотора, терминации и антитерминации,

избирательного метилирования, а также тонкие молекулярные механизмы

регуляции сплайсинга. Решение указанных проблем будет, несомненно,

способствовать лучшему пониманию сущности механизмов регуляции

экспрессии генов эукариотических клеток в норме и при патологии.

Биогенез транспортных РНК

Транспортные РНК в клетке выполняют адапторную функцию при тран-

сляции информации мРНК в первичную структуру белка. Как было указано

в главе 3, в молекуле тРНК содержится 8–10% необычных («минорных»)

азотистых оснований в составе нуклеотидов. Молекулы тРНК как у

эукариот, так и у прокариот синтезируются в виде больших предшествен-

ников, часто содержащих последовательности более одной тРНК, которые

затем подвергаются нуклеолитическому процессингу при участии специ-

фических рибонуклеаз. Гены некоторых тРНК содержат вблизи участка

ДНК, ответственного за синтез антикодоновой петли, интронные после-

довательности (около 18 нуклеотидов). Эти участки также транскриби-

493

руются, поэтому процессинг тРНК включает, помимо удаления 18-членного

рибонуклеотидного интрона, также необходимый сплайсинг антикодоновой

области. Дальнейшая модификация включает присоединение триплета

ЦЦА и образование акцепторного участка (на 3'-конце молекулы), к

которому присоединяется аминокислота. Имеются данные, что метили-

рование предшественников тРНК у эукариот осуществляется в ядре, в то

время как ферментативные процессы удаления интрона и присоединения

триплета ЦЦА происходят, скорее всего, в цитоплазме. Помимо акцеп-

торного и антикодонового участков, тРНК содержит специфичные участки

узнавания для ферментов – аминоацил-тРНК-синтетаз, а также участки для

связывания с большими субчастицами рибосом (см. далее главу 14).

Биогенез рибосомных РНК

У прокариот синтез 23S, 16S и 5S рРНК осуществляется из более крупного

30S предшественника, получившего название прерибосомной РНК (пре-

рРНК). Под действием специфических нуклеаз и метилаз из этого общего

предшественника в результате процессинга сначала образуются проме-

жуточные рибосомные РНК, которые, подвергаясь дальнейшей нуклеазной

атаке и метилированию, превращаются в зрелые молекулы (рис. 13.6).

Для ряда эукариотических клеток доказана транскрипция двух вы-

сокомолекулярных рРНК (18S и 28S) и одной низкомолекулярной рРНК

(5,8S) из одного общего предшественника (45S); последний представляет

собой продукт генов рРНК, более тысячи копий которых содержит клетка.

Первичный транскрипт 45S рРНК высокометилирован, причем метили-

рованию в ядрышках подвергаются только те участки первичного транс-

крипта, из которых в процессе реакций процессинга образуются рРНК. Сам

механизм процессинга первичного транскрипта резко отличается от про-

цессинга гяРНК при образовании мРНК. Образовавшаяся, например, мо-

лекула 28S рРНК еще в ядрышке подвергается дальнейшему метили-

рованию, затем она взаимодействует с синтезированными в цитоплазме

рибосомными белками и формируется 60S рибосомная субчастица; 18S

рРНК аналогичным способом участвуют в формировании 40S рибосомной

субчастицы. Обе субчастицы стабильны в делящихся клетках и нестабильны

в неделящихся клетках.

Следует указать, что синтез РНК при участии ДНК-зависимой РНК-

полимеразы специфически тормозится антибиотиком актиномицином D,

который обладает способностью связываться водородными связями с ДНК

Рис. 13.6. Постсинтетическая модификация пре-рРНК прокариот (по Николову).

494

Пре-16S РНК

Пре-23S РНК

Пре-5S РНК

Пре-рРНК

Места эндо-

нуклеазной

атаки

16S РНК

тРНК

23S

РНК

5S

 РНК

тРНК

по месту остатков гуанина. Актиномицин D тормозит синтез РНК в ин-

тактных клетках. Он нашел широкое применение при определении про-

цессов, зависящих от транскрипции ДНК.

Синтез РНК на матрице РНК

ДНК-зависимая РНК-полимераза может осуществлять транскрипцию ДНК

нормальных клеток и ДНК-вирусов. Как же осуществляется синтез РНК

у тех вирусов, которые в геноме вместо ДНК содержат РНК? Оказывается,

в этих случаях вирусная РНК индуцирует образование в клетках хозяина

(например, у Е. coli) РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая участвует

в репликации вирусной РНК (отсюда второе название фермента – РНК-

репликаза). Фермент также используется нуклеозидтрифосфаты для син-

теза одноцепочечной вирусной РНК. Этот синтез должен пройти через

стадию образования репликативной формы. Следовательно, на I стадии

РНК-репликаза на матрице РНК-вируса специфически строит комплемен-

тарную, с противоположной полярностью цепь РНК. Последняя на II

стадии служит матрицей для синтеза РНК, совершенно однотипной ис-

ходной вирусной РНК. Обе стадии катализируются одним и тем же

ферментом, хотя в каждой из них участвуют различные белковые факторы.

Следует особо подчеркнуть, что, поскольку РНК-репликаза имеет от-

ношение только к вирусам, очевидно, на этом основании могут быть

разработаны эффективные антивирусные лекарственные препараты.

Синтез РНК из нуклеозиддифосфатов. М. Грюнберг-Манаго и С. Очоа

в 1955 г. в клетках Е. coli открыли особый фермент – полинуклеотид-фос-

форилазу. Этот фермент наделен способностью синтезировать in vitro

полимерную молекулу РНК из однотипных или разных рибонуклеозид-

дифосфатов (НДФ). Реакция, являющаяся обратимой, протекает по урав-

нению:

(НМФ)

n

 + НДФ –> (НМФ)

n+1

 + Н

3

РO

4

.

Рибонуклеозидтрифосфаты и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты не яв-

ляются субстратами фермента. Фермент не нуждается в матрице, однако

для синтеза необходима затравочная цепь РНК (НМФ)

n

 со свободной

3'-гидроксильной группой, к которой присоединяются остатки моно-

нуклеотидов. Образовавшаяся полимерная молекула РНК не имеет за-

данной специфической последовательности мононуклеотидов, но содержит

3'–>5' фосфодиэфирные связи, легко разрываемые рибонуклеазой. Отно-

сительно биологической роли этого фермента у бактерий предполагают,

что он катализирует, скорее всего, обратную реакцию – расщепление мРНК

с образованием нуклеозиддифосфатов.

Полученные в лаборатории С.С. Дебова данные свидетельствуют о

более широком распространении полирибонуклеотид-фосфорилазы в жи-

вых организмах, чем это признавалось ранее. Фермент открыт также

в клетках животных. Кроме того, получены экспериментальные дока-

зательства синтетической функции полинуклеотид-фосфорилазы. Вполне

правомерно допущение, что этот фермент может принимать участие в

синтезе коротких полирибонуклеотидов в клетках эукариот в норме и

в некоторых экстремальных условиях. Кроме того, в лабораторных ус-

ловиях фермент может найти применение для синтеза РНК-праймеров,

используемых далее при синтезе ДНК.

495

Проблемы генетической инженерии. Генетическая инженерия, по опре-

делению А.А. Баева, представляет собой систему экспериментальных

приемов, позволяющих создавать в лаборатории (в пробирке) искусствен-

ные биологические структуры. В качестве инструментов для генно-

инженерных операций применяются созданные самой природой ферменты:

одни из них рассекают молекулу ДНК в строго определенных участках

(рестриктазы), другие, напротив, сшивают разрозненные участки в еди-

ное целое (лигазы). Конечной целью генетической инженерии является

получение организмов (животных и растений) с новыми наследственными

свойствами с помощью лабораторных приемов. Для достижения этой пока

еще отдаленной цели необходимо проведение огромной работы на уровне

отдельного гена или генов. Ген, представленный определенным участком

ДНК и соответствующий определенному белку, можно или выделить из

другого организма, или синтезировать химическим либо биологическим

путем. Впервые в 1969 г. из Е. coli был выделен участок ДНК с геном,

ответственным за синтез фермента, катализирующего усвоение молочного

сахара (лактозы),– так называемый лактозный оперон. Химический синтез

гена аланиновой тРНК впервые осуществил Хар Гобинд Корана в 1970 г.

Состоящий из 72 нуклеотидов, этот ген, однако, лишен функциональной

активности, так как в клетках тРНК синтезируется не в готовом виде,

а в форме предшественника. Эти данные послужили для Кораны основой

для синтеза гена-предшественника тирозиновой тРНК (из 126 нуклеоти-

дов), хотя сама тирозиновая тРНК состоит из 85 нуклеотидов. Ввиду

громоздкости, а также недостаточной эффективности химического синтеза

в последние годы все большее место занимают биологические методы

синтеза генов при помощи  о б р а т н о й  т р а н с к р и п т а з ы (ревертазы).

Для этого необходимо иметь мРНК, с помощью которой можно вос-

произвести соответствующий ген. Синтезированы ДНК-копии на мРНК,

кодирующие синтез белка глобина (человека, кролика, мыши, голубя, утки),

иммуноглобулина, белка хрусталика глаза и др. Однако на этом пути

синтеза генов встречаются большие трудности, связанные с выделением из

огромного разнообразия клеточных мРНК, нужной для синтеза гена.

Следующий этап генетической инженерии – перенос генов в клетку –

осуществляется тремя способами: трансформацией (перенос генов

посредством выделенной из клеток и освобожденной от примесей ДНК),

т р а н с д у к ц и е й (перенос генов посредством вирусов) и  г и б р и д и з а ц и е й

клеток, полученных из разных организмов (высших животных, микро-

организмов и др.) (рис. 13.7, 13.8). Заключительный этап этих экспери-

ментов сводится к адаптации введенного гена в организме хозяина, но он

почти не зависит от искусства экспериментатора.

Исследования в области генетической инженерии могут служить основой

для решения практических задач здравоохранения и сельского хозяйства.

Полученные в лаборатории искусственные гены, помимо широкого ис-

пользования в микробиологической и фармацевтической промышленности

для приготовления кормового белка и лекарственных препаратов (инсулин,

интерферон, гормон роста, гормоны щитовидной железы, стимуляторы

иммунитета и др.), возможно, смогут применяться при лечении многих

наследственных заболеваний (их насчитывается около 5000), генетический

дефект которых точно известен пока только для небольшого числа (не более

50) болезней.

Первые попытки применения лактозного гена при галактоземии (на-

следственное заболевание, связанное с непереносимостью галактозы вслед-

ствие отсутствия фермента гексозо-1-фосфат-уридилилтрансферазы; см.

496