Биологическая химия - часть 121

симая РНК-полимераза, которая катализирует синтез всех типов клеточных

РНК.

РНК-полимераза Е. coli изучена наиболее подробно. Это олигомерный

фермент, состоящий из двух одинаковых α-субъединиц (мол. масса 36000),

двух разных β (β

1

 и β

2

)-субъединиц (мол. масса соответственно 151000

и 155000), ω-субъединицы (мол. масса 11000) и σ-субъединицы; общая мол.

масса фермента около 390000. Считают, что функция σ-субъединицы

(σ-фактор) – узнавание определенного участка на матрице ДНК, названного

промотором, к которому присоединяется РНК-полимераза. В результате

образуется так называемый открытый комплекс фермента с ДНК: двух-

цепочечная структура ДНК раскрывается («плавится»). Далее на одной из

нитей ДНК, как на матрице, синтезируется мРНК; синтез заканчивается

в определенной точке в конце гена или прерывается под действием особых

белков. Другим субъединицам фермента приписывают функцию инициации

биосинтеза РНК (α-субъединицам) и основную каталитическую функцию

(связывание субстратов и элонгация синтеза) – β-субъединицам. Кроме того,

открыт ряд белков, принимающих участие в механизме синтеза РНК

в клетке. В частности, исследуется природа репрессорных белков и белка-

терминатора (ρ-фактора). Последний обладает способностью обратимо

связываться с терминирующими участками ДНК (так называемые стоп-

сигналы транскрипции), выключая действие РНК-полимеразы. При от-

сутствии этого белка образуются исключительно длинные цепи РНК.

У эукариот открыты три разные РНК-полимеразы (I, II и III) с большой

молекулярной массой (от 500000 до 600000), каждая из которых наделена

специфической функцией. РНК-полимераза I ответственна за синтез только

рибосомных РНК (рРНК), точнее одного-единственного прерибосомного

РНК-транскрипта, предшественника 5,8S, 18S и 28S рРНК; фермент свя-

зывается с разными промоторными участками. РНК-полимераза II – основ-

ной фермент, катализирующий синтез матричной РНК (мРНК). Он наделен

способностью распознавать огромное множество промоторных участков,

многие из которых имеют специфические ключевые последовательности,

являющиеся местами (сайтами) связывания  т р а н с к р и п ц и о н н ы х бел-

ковых факторов. РНК-полимераза III катализирует преимущественно син-

тез транспортных РНК (тРНК), а также 5S рРНК и ряда других низко-

молекулярных РНК со специфической функцией. У эукариот работу РНК-

полимеразы обеспечивает множество регуляторных белков (факторы

транскрипции), объединенных вместе с ферментом в единый  т р а н с к р и п -

ц и о н н ы й  к о м п л е к с . В частности, открыты транскрипционные факторы

типа J, активные только в виде идентичных димеров (J1J1 или J2J2) или

разных димеров (J1J2); эти факторы кодируются отдельными генами и сами

запускают работу ряда генов, регулирующих клеточное деление. В ре-

зультате мутации генов, кодирующих синтез транскрипционных факторов,

резко повышается прочность связывания J-факторов с ДНК, что обычно

приводит к нерегулируемому опухолевому росту клеток.

Биогенез матричных РНК

Процесс образования молекулы мРНК на матрице ДНК – биогенез мРНК –

в прокариотических клетках представляется относительно простым и вклю-

чает главным образом транскрипцию соответствующего гена при участии

РНК-полимеразы. Во многих случаях первичным продуктом экспрессии

гена является молекула мРНК, уже способная к функционированию, т.е. у

489

прокариот транскрипция и трансляция являются сопряженными процес-

сами. Биосинтез тРНК у прокариот из первичного тРНК транскрипта

проходит стадию процессинга аналогично синтезу мРНК и тРНК у эука-

риот (см. далее).

Биогенез мРНК у эукариот существенно отличается не только ме-

ханизмом регуляции транскрипции, но и многоступенчатостью форми-

рования активной молекулы. До открытия феномена  с п л а й с и н г а (от

англ. splicing – созревание, сращивание) мРНК было известно, что многие

мРНК эукариот синтезируются в виде гигантских высокомолекулярных

предшественников (пре-мРНК), которые уже в ядре подвергаются пост-

транскрипционному процессингу. Предполагали, что процессинг включает

удаление длинных 5'- и 3'-концевых участков, которые якобы выполняют

регуляторные функции. Как оказалось, ген эукариот является не непрерыв-

ной, а мозаичной структурой, содержащей наряду с кодирующими

(экзоны) также некодирующие (интроны) последовательности. Фермент

РНК-полимераза катализирует транскрипцию как экзонов (от англ. exit –

выход, поскольку продукты транскрипции – участки мРНК – выходят из

ядра в цитоплазму и выполняют функцию матрицы в синтезе белка), так

и интронов с образованием гетерогенной ядерной РНК (гяРНК), назы-

ваемой также  п е р в и ч н ы м  т р а н с к р и п т о м . Термин «интроны» означает

вставочные, нетранслирующие последовательности нуклеотидов в ДНК

эукариот. Этот термин применим и к вставочным нуклеотидным после-

довательностям первичного РНК-транскрипта.

С открытием интрон-экзонного строения генов, характерного для

эукариотических клеток, начался новый этап исследований на пути реали-

зации генетической информации. Транскрипция гена, состоящего из че-

редующихся кодирующих и некодирующих нуклеотидных последователь-

ностей, обеспечивала полное его копирование и приводила к синтезу

РНК-предшественника. Поэтому было высказано предположение о су-

ществовании между транскрипцией и трансляцией еще одного важного

звена – образования пригодной для трансляции «зрелой» молекулы мРНК.

Этот этап получил название процессинга, или созревания, мРНК.

К настоящему времени считается установленным, что процессинг мРНК

включает три основных процесса: 1)  к э п и р о в а н и е – химическая моди-

фикация 5'-концевой последовательности мРНК; 2)  с п л а й с и н г – удаление

некодирующих интронных последовательностей из мРНК и сшивание

образующихся экзонов; 3)  п о л и а д е н и л и р о в а н и е – химическая модифи-

кация 3'-концевой последовательности мРНК (рис. 13.5).

В осуществлении каждого из указанных процесов специфическое участие

принимает ряд белков и нуклеиновых кислот, хотя конкретные моле-

кулярные механизмы этих превращений еще не полностью раскрыты. Все

три указанных процесса имеют важное значение в формировании зрелой

молекулы мРНК. Однако наибольший интерес исследователи проявляют

к выяснению молекулярного механизма сплайсинга, который должен

обеспечить, во-первых, постепенное и высокоточное вырезание интронов из

первичного транскрипта и, во-вторых, сшивание образующихся фрагмен-

тов – экзонов – «конец в конец». Любые отклонения или смещения границ

в процессе вырезания интронов и сшивания экзонов даже на один нуклеотид

могут привести не только к глубокому искажению смысла в кодирующих

последовательностях, но и к нарушению передачи генетической инфор-

мации и развитию патологии.

Последовательность нуклеотидов в молекуле мРНК обычно начинается

с пары 5'-ГУ и заканчивается парой АГ-3'. Эти последовательности,

490

Рис. 13.5. Биогенез мРНК у эукариот.

вероятнее всего, служат сайтами (местами) узнавания для ферментов

сплайсинга. Поскольку 5'-ГУ ... АГ-3' последовательности не открыты

в молекулах предшественников тРНК, было высказано предположение

о существовании по меньшей мере двух типов ферментов сплайсинга;

одного для мРНК и другого для тРНК. Имеются, кроме того, достоверные

данные о том, что интроны часто оказываются длиннее экзонов и что

внутри гена на интроны приходится значительно большая часть нуклеотид-

ных пар. Подсчитано, например, что ген овальбумина содержит 7 интронов,

в общей сложности насчитывающих 7700 пар оснований, в то время как

сформировавшаяся после сплайсинга мРНК насчитывает всего 1859 ос-

нований. Почти во всех эукариотических клетках синтезированные на

структурных генах первичные транскрипты подвергаются процессингу,

прежде чем выполнят свои уникальные функции в белковом синтезе. Во

многих случаях процессинг имеет место главным образом в ядре, хотя этот

процесс продолжается и после транспортировки молекул РНК из ядра

в цитоплазму: например, терминальные реакции полиаденилирования и

метилирования остатков нуклеозидов.

Химический смысл кэпирования сводится к присоединению остатка

7-метилгуанозина посредством трифосфатной группы к 5'-концу молекулы

транскрипта, метилированию 2'-ОН-группы первого и второго нуклеотидов

на 5'-конце мРНК. Полиаденилирование 3'-конца первичного транскрипта

включает ряд стадий и участие эндонуклеазы и полиаденилатполимеразы.

Эндонуклеаза расщепляет мРНК вблизи специфической сигнальной после-

довательности (5')ААУААА(3'), отличающейся высокой консерватив-

ностью. Полиаденилатполимераза синтезирует поли-А-конец (от 20 до 250

нуклеотидов) начиная с точки распада.

Функции 5'-кэп и 3'-поли-А раскрыты недостаточно полно. Показано,

что 5'-кэп, соединяясь со специфическим белком, принимает участие в свя-

491

Интроны

Экзоны

ДНК

Транскрипция

5'-Кэпирование

Кэп

Первичный

транскрипт

3'мРНК

мяРНК

Расщепление

3'-Полиаденилирование

Сплайсинг

Кэп

Поли-А

Зрелая мРНК

зывании мРНК с рибосомой, способствуя инициации синтеза белка. До-

пускают, что основное назначение 5'-кэп и поли-А – защита мРНК от

энзиматического распада. Известно также, что не все цитоплазматические

мРНК содержат участки поли-А на 3'-концах и что в цитоплазме клеток

животных происходит как присоединение, так и удаление участка поли-А из

молекулы мРНК. Следует отметить, что размер молекулы цитоплазма-

тической мРНК даже после удаления 3'-поли-А оказывается все же намного

большим, чем требуется для синтеза кодируемого белка. В частности,

размер мРНК белка глобина (эритроциты кролика) составляет 550 нуклео-

тидов, в то же время кодирующий участок состоит из 430 нуклеотидов

(размер поли-А – 40 нуклеотидов). Другой пример: размер мРНК тяжелого

иммуноглобулина (из клеток миеломы мышей) составляет 1800 нуклеотид-

ных остатков, а кодирующая часть – 1350 нуклеотидов (размер поли-

А – 150–200 нуклеотидов). Интересно, что большинство указанных про-

цессов, если не все, могут регулироваться независимо, изменяя уровень

экспрессии гена. Более того, даже после завершения формирования мРНК

изменения ее стабильности могут оказывать существенное влияние на

экспрессию гена.

В последние годы интенсивно исследуются структура и назначение

нетранслируемых участков генов – интронов. Они различаются по числу,

размерам и топографии. Показано, например, что ген сывороточного

альбумина хотя и содержит всего 6 интронов, но на их долю приходится до

80% этого гена; интроны имеют размеры от 90 до 20000 нуклеотидных пар.

Ген коллагена содержит более 50 интронов. Исключение составляют лишь

гены, кодирующие гистоны, не содержащие интронных структур. Раз-

личают 4 класса интронов. Первый класс открыт как в ядерных, так

и в митохондриальных генах, кодирующих рибосомные рРНК; второй

класс интронов открыт в первичных транскриптах митохондриальных

матричных мРНК. Оказалось, что оба эти класса интронов не нуждаются

ни в источнике энергии, ни в участии ферментов, но наделены способностью

самосплайсинга. Третий – самый большой класс интронов обнаружен в

первичных транскриптах ядерных мРНК, подвергающихся созреванию.

Сплайсинг требует наличия комплекса белков и особой группы клеточных

РНК, названных малыми ядерными РНК (мяРНК). Выделено и охарак-

теризовано 5 групп богатых уридином мяРНК, соответственно обозна-

чаемых U1, U2, U4, U5 и U6, размерами от 100 до 200 нуклеотидов.

Комплексы мяРНК и белков, названные малыми ядерными нуклеопро-

теинами, объединяются в единую систему – сплайсосому, координиру-

ющую весь процесс сплайсинга. Предполагают, что мяРНК соединяются

с обеими концами интрона, способствуя формированию специфической

конформации, необходимой для узнавания ее участвующими в процессе

ферментами, сближению двух экзонов, удалению интронов и воссоеди-

нению кодирующих экзонов. Четвертый класс интронов открыт в ряде

тРНК. Сплайсинг этой группы интронов требует доставки энергии и

присутствия эндонуклеаз и лигаз, катализирующих соответственно разрыв

фосфодиэфирных связей с 5'- и 3'-концов интрона и соединяющих два

экзона.

Укажем также на весьма интересные и новые данные о существовании

в структуре мРНК-предшественника, помимо экзонов и интронов, особых,

так называемых альтернативно сплайсируемых, последовательностей. Вы-

явлены примеры неоднозначного протекания сплайсинга для ряда генов.

Результат альтернативного сплайсинга – появление нескольких продуктов

при экспрессии одного гена. Так, получены доказательства, что экспрессия

492