Биологическая химия - часть 119

репликации у Е. coli), фактор С – функцию стабилизатора всего реплика-

ционного комплекса.

В генетической инженерии с целью получения белков в достаточных

количествах и с заданными свойствами (например, для генотерапии наслед-

ственных и соматических болезней) широкое применение получили эндо-

нуклеазы  р е с т р и к т а з ы , катализирующие расщепление молекулы двух-

цепочечной ДНК по специфическим нуклеотидным последовательностям

внутри цепи. Рестриктазы узнают определенные 4–7-членные последова-

тельности, вызывая, таким образом, разрывы в определенных сайтах цепи

ДНК. При этом образуются не случайные последовательности, а фраг-

менты ДНК строго определенной структуры с липкими концами (ре-

комбинантные ДНК), используемые далее для конструирования гибридных

молекул и получения генно-инженерной, биотехнологической продукции

(например, инсулина, гормона роста, интерферона, вакцин против вируса

гепатита В, СПИДа и др.).

Общий механизм синтеза ДНК. Основываясь на данных о двухспираль-

ной антипараллельной структуре, химическом составе ДНК (см. главу 3)

и значении «активированной» формы энергии для биосинтеза полимерных

молекул, А. Корнберг еще в 1955 г. указал на возможность синтеза ДНК

энзиматическим путем в бесклеточной системе в присутствии изолиро-

ванной из Е. coli ДНК-полимеразы и предшественников дезоксирибонук-

леозидтрифосфатов. Реакция, практически осуществленная в 1967 г., сво-

дится к синтезу новой молекулы ДНК:

Химический смысл полимеризации состоит в том, что свободная

3'-гидроксильная группа матрицы атакует α-фосфатную группу соответ-

ствующего присоединяемого нуклеозидтрифосфата (определяется природой

азотистого основания затравки), при этом происходят отщепление остатка

пирофосфата и образование фосфодиэфирной связи. Далее свободный

3'-гидроксил вновь присоединенного нуклеотида атакует α-фосфатную

группу следующего нуклеозидтрифосфата, и таким путем продолжается

процесс полимеризации, идущий в направлении 5'–>3', антипараллельно

матрице, оканчивающейся 5'-фосфатом:

Реакция требует присутствия одноцепочечной ДНК или в крайнем

случае небольшого полидезоксирибонуклеотида. В деталях выяснено зна-

чение предобразованной ДНК в механизмах действия ДНК-полимераз:

481

n

1

 dАТФ

n

2

 dГTФ

n

3

 dЦТФ

n

4

 dТТФ

Mg

2+

; ДНК-матрица

ДНК-полимераза

Д

Н

К

dАМФ n

1

dГМФ n

2

dЦMФ n

3

dTMФ n

4

+ (n

1

 + n

2

 + n

3

 + n

4

)РР

i

ДНК-полимераза

+

 PP

i

ДНК служит не только затравкой, но и матрицей, на которой фермент

комплементарно и антипараллельно синтезирует дочернюю цепь ДНК. Это

можно представить в виде схемы:

Были предприняты другие подходы к выяснению механизма поли-

меразной реакции. В лаборатории А. Корнберга был открыт фаг (φХ174,

содержащий одноцепочечную кольцевую ДНК. Эту молекулу использовали

в качестве матрицы в ДНК-полимеразной реакции и получили биоло-

гически активную ДНК фага, использовав фермент ДНК-лигазу, обла-

дающую способностью катализировать соединение (сшивку) концов раз-

рывов в молекуле ДНК. Было показано, что в процессе репликации

одноцепочечная ДНК фага (φХ174 проходит стадию образования двухцепо-

чечной кольцевой ДНК. Применив ряд остроумных подходов, А. Корнберг

и сотр. в опытах in vitro создали искусственную молекулу фага φХ174,

обладающую способностью поражать (инфицировать) Е. coli, вызывая ли-

зис бактерии. Последовательность событий может быть представлена на

схеме, где исходная молекула кольцевой ДНК фага φХ174 обозначена

плюсом (+), а вновь синтезируемая молекула – минусом (–) (рис. 13.1).

М. Мезельсон и Ф. Сталь показали полуконсервативный механизм реп-

ликации ДНК, включающий образование дочерних молекул ДНК, в каждой

из которых сохраняется лишь одна родительская цепь (рис. 13.2; 13.3).

Сложность процесса репликации ДНК объясняется тем, что обе цепи

реплицируются одновременно, хотя имеют разное направление (5'–>3'

и 3'–>5'); кроме того, рост дочерних цепей также должен происходить

в противоположных направлениях. Элонгация каждой дочерней цепи может

осуществляться только в направлении 5'–>3'. Р. Оказаки высказал пред-

положение, подтвержденное экспериментальными данными, что синтез

одной из дочерних цепей осуществляется непрерывно в одном направлении,

в то время как синтез другой дочерней цепи происходит прерывисто, путем

соединения коротких фрагментов (в честь автора названы фрагментами

Оказаки), в свою очередь синтезирующихся в противоположном направ-

лении (рис. 13.4).

Как видно, синтез ведущей цепи ДНК идет всегда в направлении 5'–>3',

соответствующем направлению движения репликационной вилки. Сохраняя

правило синтеза дочерних молекул ДНК 5'–>3', синтез на второй цепи

родительской ДНК идет в направлении, противоположном движению

репликационной вилки. В зависимости от типа клетки фрагменты Оказаки

482

dТТФ

dЦТФ

dАТФ

dГТФ

ДНК-полимераза

+ 4PP

i

А

Г

Т

Ц

А

Т

Г

Ц

Т

А

Ц

Г

Рис. 13.1. Роль ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы в синтезе кольцевой одноцепочеч-

ной ДНК фага φХ174.

имеют разные размеры – от нескольких сот до нескольких тысяч нуклеоти-

дов (150–200 у эукариот и 1000–2000 у бактерий).

Получены доказательства, что образование каждого фрагмента Оказаки

требует наличия короткого затравочного комплементарного праймера –

участка РНК, синтез которого катализируется праймазой. Затем при учас-

тии ДНК-полимеразы III синтезируются длинные участки ДНК. РНК-

затравки далее вырезаются при участии ДНК-полимеразы I, а свободные

места их (бреши) замещаются (достраиваются) комплементарными дез-

оксирибонуклеотидами под действием той же ДНК-полимеразы I; наконец,

сшивание разъединенных участков отстающей цепи осуществляется при

помощи ДНК-лигаз. Подобный механизм челночного синтеза ДНК легко

объясняет фактические данные о накоплении коротких фрагментов ДНК

у Е. coli во время репликации ДНК.

Особенности репликации ДНК у эукариот. Репликация ДНК у эукариот,

по существу аналогичная репликации ДНК у прокариот, имеет ряд

особенностей. Например, вместо одной точки репликации в ДНК эукариот

имеются специфические точки «начала», так называемые автономно

реплицирующие последовательности (около 300 нуклеотидных пар); в

дрожжевой клетке таких элементов около 400. Кроме того, скорость

движения репликационной вилки у эукариот (примерно 50 нуклеотидов

483

ДНК-полимераза

ДНК-лигаза

Эндонуклеаза

нагревание

Синтезированная

молекула ДНК

Кольцевая

одноцепочечная

ДНК фага φХ174

Образование

незамкнутой

комплементарной

ДНК

Замыкание

кольца

Разрыв в

исходной
цепи ДНК

Денатурация

исходной
(+) ДНК

ДНК-полимераза

ДНК-лигаза

Эндонуклеаза

нагревание

Использование

новой молекулы

ДНК в качестве

матрицы

Замыкание

цепи

Разрыв
в (–) цепи

Денатурация

(–) цепи

Новая синтетическая

кольцевая ДНК,

идентичная исходной

ДНК фага φХ174

Рис. 13.2. Полуконсерватив-
ная репликация ДНК in vitro.
Каждая из двух цепей родитель-

ской ДНК служит матрицей для

синтеза дочерних молекул ДНК.

1 - родительская молекула; 2 -

дочерние молекулы (первая гене-

рация); 3 - дочерние молекулы

(вторая генерация).

Рис. 13.3. Основные этапы репликации ДНК (схема).

484

1

2

3

ДНК-гираза

ДНК-хеликаза

rер-белок

ДНК-связывающие белки

Ведущая цепь

Праймасома

Комплекс белков

dnaB и dnaC

Праймер

ДНК-полимераза III

Праймаза

Удаление праймера

Фрагменты

Оказаки

ЦНК-полимераза I

ДНК-лигаза

Отстающая цепь