Биологическая химия - часть 120

Рис. 13.4. Схематическое изображение непрерывного и прерывистого синтеза цепей

ДНК при репликации.

в секунду) почти в 10 раз ниже, чем у E. coli. Для репликации ДНК генома

человека из одной-единственной точки с подобной скоростью потребо-

валось бы более 500 ч; вместо этого репликация генома человека проис-

ходит в обоих направлениях и одновременно из множества точек (мно-

жество «начал» репликации), вовлекая от 30000 до 330000 пар оснований.

Репликация продолжается до тех пор, пока не будут синтезированы две

дочерние молекулы ДНК, в каждой из которых содержится одна ро-

дительская цепь (см. рис. 13.4). Таким образом, множественность точек

«начала» репликации ДНК, вероятнее всего, является общим правилом для

всех клеток эукариот.

Как было указано, инициация биосинтеза дочерних цепей ДНК требует

предварительного синтеза на матрице ДНК необычного затравочного

олигорибонуклеотида, названного праймером, со свободной гидроксильной

группой у С-3' рибозы. Этот короткий олигорибонуклеотид синтезируется

комплементарно на матрице ДНК при участии особого фермента – прай-

мазы, наделенной РНК-полимеразной активностью.

Предполагают, что именно с этой точки концевого 3'-гидроксила рибозы

праймера начинается истинный синтез лидирующей дочерней цепи ДНК,

комплементарной родительской. Синтез начинается с реакции между

3'-ОН-группой концевого рибонуклеотида праймера и α-фосфатной группой

первого дезоксирибонуклеотидтрифосфата в строгом соответствии с

комплементарностью родительской цепи ДНК, при этом освобождается

пирофосфат. В дальнейшем этот фрагмент РНК, комплементарно при-

соединенный к новообразованной цепи ДНК, разрушается под действием

ДНК-полимеразы I, и возникшая брешь застраивается олигодезоксирибо-

нуклеотидом при помощи той же ДНК-полимеразы I. Вполне допустимо

485

Родительская ДНК

Направление движения

репликационной вилки

Лидирующая

цепь

Фрагменты

Оказаки

Отстающая цепь

Матричная цепь ДНК

Праймер (олигорибо-

нуклеотид)

Направление синтеза

предположение, что синтез праймера из олигорибонуклеотида имеет глу-

бокий биологический смысл, поскольку в этом случае могут устраняться

ошибки, неизбежно возникающие при инициации репликации ДНК.

Этапы биосинтеза ДНК. Предложен ряд моделей механизма биосинтеза

ДНК с участием указанных ранее ферментов и белковых факторов, однако

детали некоторых этапов этого синтеза еще не выяснены. Основываясь

главным образом на данных, полученных в опытах in vitro, предполагают,

что условно механизм синтеза ДНК у Е. coli может быть подразделен на три

этапа; инициацию, т.е. начало, элонгацию, т.е. продолжение, и терми-

нацию, т.е. завершение (прекращение) синтеза. Каждый из этих этапов

требует участия специфических ферментов и белковых факторов.

Этап I –  и н и ц и а ц и я биосинтеза ДНК – является началом синтеза до-

черних нуклеотидных цепей; в инициации участвует минимум восемь

хорошо изученных и разных ферментов и белков. Первая фаза – это, как

указано ранее, ферментативный биосинтез на матрице ДНК необычного

затравочного олигорибонуклеотида (праймера) со свободной гидроксиль-

ной группой у С-3' рибозы. При инициации к цепям ДНК последовательно

присоединяются ДНК-раскручивающие и ДНК-связывающие белки, а за-

тем комплексы ДНК-полимераз и праймаз (см. рис. 13.3). Инициация

представляется единственной стадией репликации ДНК, которая весьма

тонко и точно регулируется, однако детальные механизмы ее до сих пор не

раскрыты и в настоящее время интенсивно исследуются.

Этап II –  э л о н г а ц и я синтеза ДНК – включает два кажущихся оди-

наковыми, но резко различающихся по механизму синтеза лидирующей

и отстающей цепей на обеих материнских цепях ДНК. Синтез лидирующей

цепи начинается с синтеза праймера (при участии праймазы) у точки начала

репликации, затем к праймеру присоединяются дезоксирибонуклеотиды под

действием ДНК-полимеразы III; далее синтез протекает непрерывно, следуя

шагу репликационной вилки. Синтез отстающей цепи, напротив, протекает

в направлении, обратном движению репликационной вилки и начинается

фрагментарно. Фрагменты всякий раз синтезируются раздельно, начиная

с синтеза праймера, который может переноситься с готового фрагмента при

помощи одного из белковых факторов репликации в точку старта био-

синтеза последующего фрагмента противоположно направлению синтеза

фрагментов. Элонгация завершается отделением олигорибонуклеотидных

праймеров, объединением отдельных фрагментов ДНК при помощи

ДНК-лигаз и формированием дочерней цепи ДНК. Нельзя исключить,

однако, возможности сопряженного и согласованного механизма синтеза

лидирующей и отстающей цепей ДНК при участии полимераз и всего

комплекса праймасом.

Этап III –  т е р м и н а ц и я синтеза ДНК – наступает, скорее всего, когда

исчерпана ДНК-матрица и трансферазные реакции прекращаются. Точ-

ность репликации ДНК чрезвычайно высока, возможна одна ошибка на

10

10

 трансферазных реакций, однако подобная ошибка обычно легко

исправляется за счет процессов репарации.

Синтез ДНК на матрице РНК. Выдающимся достижением биохимии

нуклеиновых кислот является открытие в составе онковирусов (вирус

Раушера и саркомы Рауса) фермента  о б р а т н о й  т р а н с к р и п т а з ы , или

р е в е р т а з ы (РНК-зависимая ДНК-полимераза), катализирующего био-

синтез молекулы ДНК на матрице РНК. Накоплены данные о том, что

многие РНК-содержащие онкогенные вирусы, получившие наименование

онкорнавирусов, содержат ревертазу в составе покровных белков. Фермент

открыт также во многих клетках прокариотов и эукариотов, в частности

486

в лейкозных клетках, пролиферирующих тканях, включая эмбриональные

ткани. Ревертаза онкорнавирусов содержит ионы Zn

2 +

 и активируется

катионами Мn

2+

 и Mg

2 +

. Предполагают, что синтез ДНК на матрице РНК

происходит в 3 этапа. На I этапе фермент ревертаза синтезирует на матрице

вирусной РНК комплементарную цепь ДНК, что приводит к формиро-

ванию гибридной молекулы. Второй этап – разрушение исходной вирусной

РНК из комплекса гибридной молекулы под действием РНКазы. Наконец,

на III этапе на матрице цепи ДНК комплементарно синтезируются новые

цепи ДНК. Ревертазной активностью обладают и ДНК-полимеразы: на-

пример, фермент из Е. coli способен катализировать синтез ДНК на матрице

рРНК.

Открытие обратной транскриптазы имеет большое значение не только

для выяснения закономерностей процесса малигнизации, но и для всей

науки о живом, поскольку указывает на возможность передачи наслед-

ственной информации от РНК на ДНК, не подчиняясь основному постулату

(поток информации идет только в одном направлении):

ДНК –> РНК –> Белок.

В настоящее время можно дополнить эту основную схему передачи

генетической информации в живой клетке и представить ее в более полной

форме:

На схеме стрелки вокруг ДНК и РНК указывают на возможность

молекул копировать самих себя в живых системах при участии соот-

ветствующих ферментов. Как знать, не станем ли мы свидетелями откры-

тия принципиальной возможности поворота стрелки и на следующей

стадии – от белка на РНК, что могло происходить на Земле при зарождении

первичных живых существ?

Биосинтез РНК

Поток генетической информации называется экспрессией генов. Он вклю-

чает процесс транскрипции – биосинтез матричных РНК (как и других типов

клеточных РНК) на молекуле ДНК, и процесс трансляции – биосинтез белка

на мРНК, т.е. генетическая информация ДНК реализуется путем програм-

мированного через мРНК синтеза белков, определяющих в конечном счете

фенотипические признаки живых организмов. Подсчитано, что около

90–95% ДНК E. coli экспрессируется в мРНК, хотя большая часть послед-

ней не кодирует синтеза белка; небольшая часть ДНК кодирует синтез двух

других клеточных РНК, т.е. рРНК и тРНК. Транскрипция, несмотря на

кажущуюся схожесть с репликацией, в частности химическим механизмом,

направлением синтеза и использованием матрицы, отличается рядом осо-

бенностей: не требует синтеза праймера, использует не всю молекулу ДНК,

а только ее отдельные короткие сегменты (отдельные гены или группы

генов) и, наконец, требует наличия только одной из цепей ДНК в качестве

матрицы, которая полностью сохраняется (при репликации ДНК она

сохраняется наполовину). Геном каждой клетки человека состоит из 3,5•10

9

487

ДНК

Репликация

Транскрипция

Обратная

транскрипция

РНК

Репликация

Трансляция

Белок

пар оснований; они могут обеспечить кодирование более 1,5•10

6

 пар генов.

Однако имеющиеся данные о количестве и разнообразии белков в ор-

ганизме человека (около 100000) свидетельствуют о том, что значительная

часть генома человека не транскрибируется и соответственно не пере-

водится на аминокислотную последовательность белков. Известно также,

что определенная часть нетранслируемого генома человека выполняет

регуляторную функцию в процессе экспрессии генов. В молекуле ДНК

различают, кроме уникальных неповторяющихся последовательностей, со-

держащих кодирующие гены, также множество повторяющихся после-

довательностей (повторы), биологический смысл которых до сих пор неясен

(см. далее).

Современные представления о механизме синтеза РНК в клетках в зна-

чительной степени обязаны открытию в 1960 г. в двух лабораториях США

(Дж. Хервиц и С. Вейс) особого фермента – РНК-полимеразы, катализи-

рующей синтез РНК из свободных нуклеозидтрифосфатов. Фермент тре-

бует наличия ионов Mg

2+

 или Мn

2+

 и одновременного присутствия всех

4 типов рибонуклеозидтрифосфатов (АТФ, ГТФ, ЦТФ и УТФ). Самым

удивительным свойством фермента оказалось то, что для включения

нуклеотидов в РНК необходимо обязательное присутствие предобразо-

ванной ДНК-матрицы *. При тщательном изучении механизма синтеза

РНК при участии РНК-полимеразы, называемой также ДНК-зависимой

РНК-полимеразой (транскриптазой), было установлено, что молекула

предобразованной ДНК, необходимая для реакции полимеризации, пол-

ностью определяет последовательность рибонуклеотидов во вновь син-

тезированной молекуле РНК. Другими словами, на матрице ДНК компле-

ментарно строится полирибонуклеотид, являющийся копией первичной

структуры ДНК, с той только разницей, что вместо тимидилового нуклео-

тида ДНК в РНК включается уридиловый нуклеотид. Реакция синтеза РНК

в общем виде может быть представлена следующим образом:

В синтезируемой молекуле РНК отдельные мононуклеотиды, как и

в ДНК, связаны между собой 3'-5'-фосфодиэфирными мостиками. Кроме

того, сам механизм действия фермента РНК-полимеразы во многом совпа-

дает с таковыми ДНК-полимеразы: синтез также идет в направлении 5'–>3',

цепь РНК имеет полярность, противоположную цепи предобразованной

ДНК. Однако выявлены и существенные различия. РНК-полимераза Е. coli

предпочтительнее функционирует в присутствии нативной двухцепочечной

ДНК; в опытах in vitro обе цепи ДНК копируются РНК-полимеразой; in

vivo транскрибируется, вероятнее всего, только одна цепь ДНК. Пред-

полагают, что РНК-полимераза связывается с одной цепью нативной ДНК

в определенной точке, вызывая расплетение биспиральной структуры на

ограниченном участке, где и происходит синтез РНК. Данные свиде-

тельствуют, что у E. coli, скорее всего, имеется единственная ДНК-зави-

* Позже были открыты также ферменты (преимущественно в составе оболочек фагов

и у ряда бактерий), катализирующие синтез РНК на матрице РНК.

488

n

1

 АТФ

n

2

 ГТФ

n

3

 ЦТФ

n

4

 УТФ

Мg

2+

; ДНК-матрица

РНН-полимераза

Р

Н

К

АМФ

 n

1

ГМФ n

2

ЦМФ

 n

3

УМФ n

4

+ (n

1

 + n

2

 + n

3

 + n

4

)РР

i