Биологическая химия - часть 123

Рис. 13.7. Схематическое изображение двух способов введения генов в клетку –

трансформации и трансдукции (по А. А. Баеву).

Рис. 13.8. Получение гибридной молекулы, содержащей одновременно ДНК вируса
SV40, ДНК фага λ, и галактозный оперон (схема по  А . А . Баеву).

Под действием эндонуклеазы R

1

 Е. coli кольцевые ДНК разрываются в одной точке, в резуль-

тате образуются линейные нити. Под действием другого фермента - экзонуклеазы (из фага)

укорачиваются нити ДНК с противоположных концов. Далее при помощи фермента концевой

трансферазы наращиваются нити ДНК, причем у одной ДНК новые концы состоят из

адениловых (А), у другой - из тимидиловых (Т) остатков. При смешивании молекул концевые

остатки А и Т образуют комплементарные пары, замыкая линейные молекулы в кольца.

Вначале эти кольца содержат 4 разрыва, которые затем закрываются при участии еще одного

фермента - ДНК-лигазы.

Трансформация

Трансдукция

ДНК

ДНК

вируса

Белковая
оболочка

вируса

Вирус

Ядро

мРНК

ДНК
клетки

Фермент

Вирус

SV40

Фаг

λ

Галактозный

оперон

Эндонуклеаза R

1

Экзонуклеаза

Концевая

трансфераза

А

А

Т

Т

ДНК-полимераза

ДНК-лигаза

Гибридная молекула

(с 4 разрывами)

Гибридная молекула,

замкнутая в кольцо

главу 10) вселяют надежду на реальные практические возможности гене-

тической инженерии, хотя вполне обоснованы тревога и опасения, свя-

занные с вмешательством человека в сферу тончайших биологических

процессов наследственного аппарата целостного организма. В последние

годы, после бурного периода расцвета, в генетической инженерии наблю-

дается некоторый спад, обусловленный недостаточностью знаний о струк-

туре и функционировании генома клеток эукариот. Переход от иссле-

дований на клетках прокариот к исследованиям на клетках эукариот

оказался затруднен рядом технических сложностей вследствие мозаич-

ности  с т р у к т у р ы генов последних. В частности, открытие эк-

зонов и интронов в  г е н о м е , явления сплайсинга (формирование зрелой

матричной РНК) указывает на необходимость соблюдения высочайшей

точности процедуры вырезания необходимого гена из ДНК генома со-

ответствующими рестриктазами. В противном случае могут быть получены

не структурные транслируемые гены, а интроны или участки экзонов, не

кодирующие белок. После того как были разработаны методы искусствен-

ного синтеза и сшивки отдельных участков молекулы ДНК, появилась

возможность конструирования и создания новых, неизвестных ранее в

природе организмов с заранее заданными свойствами. Современная

биотехнология явилась логическим развитием этого направления науки. Она

сложилась на основе фундаментальных достижений биохимии, генетики

и микробиологии, открыв широкие возможности для создания новых

сортов растений, новых пород животных и т.п. Учитывая исключительную

важность биотехнологии для народного хозяйства, в 1985 г. в нашей стране

был создан и успешно работает межотраслевой научно-технический ком-

плекс (МНТК) «Биоген». Комплекс был призван обеспечить создание

и организацию промышленного производства новых биологически ак-

тивных веществ и препаратов для медицины, ветеринарии, растениеводства

на основе прогрессивных биотехнологических методов, в том числе методов

клеточной и генетической инженерии.

Распад нуклеиновых кислот

Полимерные молекулы нуклеиновых кислот расщепляются в тканях

преимущественно гидролитическим путем при участии специфических фер-

ментов, относящихся к нуклеазам. Различают эндонуклеазы, разрывающие

внутренние межнуклеотидные связи в молекулах ДНК и РНК, вызывающие

деполимеризацию нуклеиновых кислот с образованием олигонуклеотидов,

и экзонуклеазы, катализирующие гидролитическое отщепление концевых

мононуклеотидов от ДНК и РНК или олигонуклеотидов. Помимо гидро-

литических нуклеаз, имеются ферменты, катализирующие распад нуклеино-

вых кислот, например, посредством трансферазной реакции. Они ката-

лизируют перенос остатка фосфорной кислоты от 5'-го углеродного атома

рибозы одного мононуклеотида ко 2'-му углеродному атому соседнего

мононуклеотида, сопровождающийся разрывом межнуклеотидной связи

и образованием фосфодиэфирной связи между 2'-м и 3'-м углеродными

атомами рибозы одного и того же мононуклеотида. К настоящему времени

открыты группы нуклеаз, катализирующие распад ДНК и РНК.

Дезоксирибонуклеазы I катализируют разрыв внутренних фосфодиэфир-

ных связей в одной из двух цепей молекулы ДНК между 3'-м углеродным

атомом дезоксирибозы и остатком фосфата с образованием низкомоле-

кулярных олигодезоксирибонуклеотидов:

498

ДНК + (n–1) Н

2

O –> n-Олигодезоксирибонуклеотиды.

Среди продуктов реакции открыты также моно- и динуклеотиды. Ти-

пичными представителями этих ферментов являются ДНКазы поджелу-

дочной железы. Одна из них (ДНКаза I) была получена в чистом виде,

расшифрована последовательность всех ее 257 аминокислотных остатков.

Фермент наиболее активен при рН 6,8–8,0, активируется двухвалентными

ионами Mg

2+

 и Мn

2+

 и ингибируется конечными продуктами фермен-

тативной реакции – олигонуклеотидами.

Дезоксирибонуклеазы II вызывают деполимеризацию молекулы ДНК

в результате парных разрывов фосфодиэфирных связей обеих цепей ДНК

с образованием более крупных олигодезоксирибонуклеотидов. Предста-

вителем их является ДНКаза II, выделенная из селезенки, имеющая мол.

массу 38000 и состоящая из 343 аминокислотных остатков. В составе этой

ДНКазы открыт глюкозамин. Фермент также активируется ионами ме-

таллов, ингибируется анионами; его оптимум рН между 5,5 и 5,8.

Помимо этих ферментов, открыты (преимущественно у микроорга-

низмов) еще экзодезоксирибонуклеазы, гидролизующие фосфодиэфирные

связи молекулы ДНК с отщеплением концевых 5'-дезоксирибонуклеотидов.

Например, из E. coli выделено четыре таких фермента, обозначаемых

экзодезоксирибонуклеазами I, II, III и IV.

Рестриктазы – ферменты ДНКазного типа действия – катализируют

распад чужеродной (в основном фаговой) ДНК в строго определенных

участках молекулы, имеющих структуру палиндромов. Из E. coli выделены

и охарактеризованы две такие рестриктазы, обозначаемые EcoRI и EcoRII

соответственно. Рестриктазы оказывают строго специфическое действие,

поэтому они используются для расшифровки последовательности нуклео-

тидных остатков в ДНК фагов и вирусов. Кроме того, это уникальное

свойство рестриктаз находит все большее практическое применение в

генетической инженерии при «вырезании» определенных фрагментов ДНК

и «встраивании» их в геном бактериальной ДНК (получение рекомби-

нантных ДНК). В результате клетке передается ряд не свойственных ей

прежде наследственных признаков. Теоретическое и главным образом

практическое значение подобных исследований трудно переоценить. Сви-

детельством огромного интереса к проблемам генетической инженерии

является создание и успешное выполнение в институтах Российской АН

и лабораторий ряда стран совместной комплексной программы – проекта

«Рестриктазы».

Многие сотни рестриктаз выделены в очищенном состоянии и уже

являются коммерческими препаратами.

Из ферментов, катализирующих гидролитический распад РНК, наиболее

изучены рибонуклеазы I. Они гидролизуют фосфодиэфирные связи внутри

молекулы РНК. Выделенная из поджелудочной железы многих животных

РНКаза состоит из 124 аминокислотных остатков во всех случаях, хотя

ферменты несколько различаются последовательностью аминокислотных

остатков; выяснена также третичная структура ряда РНКаз (см. главу 4).

Получен в гомогенном состоянии из плесневого гриба рода Aspergillus

фермент гуанилрибонуклеаза, катализирующая эндонуклеолитическое рас-

щепление РНК.

Из ферментов, осуществляющих распад ДНК и РНК не по гидро-

литическому пути, следует назвать полинуклеотид-фосфорилазу и группу

ДНК-гликозидаз. В настоящее время подробно изучены физико-химические

свойства и биологическая роль микробной полинуклеотид-фосфорилазы

499

в лаборатории С.С. Дебова; в той же лаборатории фермент открыт

в животных тканях.

Механизм действия фермента сводится к переносу нуклеотидных ос-

татков с РНК на неорганический фосфат, при этом образуется рибо-

нуклеотиддифосфат (РДФ):

РНК +

 Н

3

РО

4

 —>

 (РНK)

n–1

 +

 РДФ

Предполагают, что in vivo фермент катализирует распад клеточных

РНК, преимущественно мРНК, до нуклеозиддифосфатов, участвуя тем

самым в регуляции концентрации клеточного неорганического фосфата.

Следует указать еще на одну не менее важную уникальную функцию

полинуклеотид-фосфорилазы – способность фермента катализировать в

опытах in vitro синтез из свободных нуклеозиддифосфатов (НДФ) поли-

рибонуклеотидов с заданной последовательностью. Этот фермент сыграл

выдающуюся роль в расшифровке кода белкового синтеза в лабораториях

лауреатов Нобелевской премии С. Очоа и М. Ниренберга (см. главу 15).

Открыта группа ДНК-гликозидаз, участвующих в реакциях отщепления

модифицированных пуриновых и пиримидиновых оснований (например,

урацила, образующегося при дезаминировании остатка цитозина в одной из

цепей ДНК).

Таким образом, ДНК-гликозидазы выполняют важную функцию в

процессах репарации (восстановление структуры) молекулы ДНК.

В результате последовательного действия разнообразных клеточных

экзо- и эндонуклеаз нуклеиновые кислоты подвергаются распаду до стадии

рибо- и дезоксирибонуклеозид-3'- и 5'-фосфатов. Дальнейший распад об-

разовавшихся продуктов связан с ферментативными превращениями моно-

нуклеотидов *, нуклеозидов и далее свободных азотистых оснований. На

I этапе гидролиза действуют 3'- и 5'-нуклеотидазы, катализирующие гидро-

литический распад мононуклеотидов до свободных нуклеозидов с от-

щеплением неорганического фосфата соответственно от С-3' или С-5'

атомов углеводного остатка. На II этапе происходит перенос остатка

рибозы от нуклеозида на свободную фосфорную кислоту с образованием

рибозо-1-фосфата и свободного азотистого основания.

Распад пуриновых нуклеозидов

Образовавшиеся при гидролизе пуриновые нуклеозиды – аденозин и гуано-

зин – подвергаются ферментативному распаду в организме животных

вплоть до образования конечного продукта – мочевой кислоты, которая

выводится с мочой из организма. У человека, приматов, большинства

животных, птиц и некоторых рептилий мочевая кислота является конечным

продуктом пуринового обмена. У других рептилий и некоторых млеко-

питающих мочевая кислота расщепляется до аллантоина и у рыб – до

аллантоиновой кислоты и мочевины. Последовательность всех этих пре-

вращений, катализируемых специфическими ферментами, можно предста-

вить в виде следующей схемы:

* АМФ может подвергаться в животных тканях обратимому дезаминированию в

инозиновую кислоту.

500