Биологическая химия - часть 30

Таблица 4.2. Последовательность аминокислотных остатков, расположенных вокруг

серина в молекулах ряда эстераз и протеиназ (по Малеру и Кордесу)

Фермент

Химотрипсин

Трипсин

Тромбин

Эластаза

Бутирилхолинэстераза

Ацетилхолинэстераза

Алиэстераза печени

Щелочная фосфатаза (E. coli)

Субтилизин (В. subtilis)

Протеаза (Aspergillius orizae)

Фосфоглюкомутаза

Фосфорилаза

Последовательность остатков

аминокислот вокруг серина

—Гли—Асп—Сер—Гли—Гли—

—Гли—Асп—Сер—Гли—Про—Вал—

—Асп—Сер—Гли—

—Асп—Сер—Гли—

—Гли—Глу—Сер—Ала—

—Глу—Сер—Ала—

—Гли—Глу—Сер—Ала—Гли—Гли—

—Тре—Асп—Сер—Ала—Сер—Ала—

—Гли—Тре—Сер—Мет—Ала—

—Тре—Сер—Мет—Ала—

—Тре—Ала—Сер—Гис—Асп—

—Глн—Иле—Сер—Вал—Apг—

Предполагают, что формирование активного центра фермента начи-

нается уже на ранних этапах синтеза белка-фермента (см. главу 14) на

рибосоме, когда линейная одномерная структура пептидной цепи превра-

щается в трехмерное тело строго определенной конфигурации. Образо-

вавшийся белок приобретает информацию совершенно нового типа, а

именно функциональную (в частности, каталитическую). Любые воздейст-

вия, приводящие к денатурации, т.е. нарушению третичной структуры,

приводят к искажению или разрушению структуры активного центра

и соответственно потере ферментом каталитических свойств. Если при

подходящих внешних условиях удается восстановить нативную трехмерную

структуру белка-фермента (ренатурировать его), то восстанавливается и его

каталитическая активность. Это было показано впервые на примере рибо-

нуклеазы поджелудочной железы (см. рис. 1.13).

Помимо активного центра, в молекуле фермента может присутствовать

также  а л л о с т е р и ч е с к и й  ц е н т р (или центры) (от греч. allos – другой,

иной и steros – пространственный, структурный), представляющий собой

участок молекулы фермента, с которым связываются определенные, обыч-

но низкомолекулярные, вещества (эффекторы, или модификаторы), мо-

лекулы которых отличаются по структуре от субстратов. Присоединение

эффектора к аллостерическому центру изменяет третичную и часто также

четвертичную структуру молекулы фермента и соответственно конфигу-

рацию активного центра, вызывая снижение или повышение энзимати-

ческой активности. Ферменты, активность каталитического центра которых

125

Рис. 4.4. Схематическое изображе-
ние аллостерического фермента,

состоящего из двух протомеров,
соединенных по типу гетерологи-
ческой («голова»-«хвост») ассо-
циации (по Кошленду).
S – субстрат; М

1

 – модификатор, связы-

вающийся в активном центре; М

2

 – мо-

дификатор, связывающийся в аллосте-

рическом центре (эффектор).

подвергается изменению под влиянием аллостерических эффекторов, свя-

зывающихся с аллостерическим центром, получили название аллосте-

р и ч е с к и х  ф е р м е н т о в *.

Отличительной особенностью ряда аллостерических ферментов является

наличие в молекуле олигомерного фермента нескольких активных центров

и нескольких аллостерических регуляторных центров, пространственно

удаленных друг от друга. В аллостерическом ферменте каждый из двух

симметрично построенных протомеров содержит один активный центр,

связывающий субстрат S, и один аллостерический центр, связывающий

эффектор М

2

, т.е. 2 центра в одной молекуле фермента (рис. 4.4). Получены

доказательства, что для субстрата аллостерические ферменты, помимо

активного центра, содержат и так называемые эффекторные центры; при

связывании с эффекторным центром субстрат не подвергается катали-

тическому превращению, однако он влияет на каталитическую эффектив-

ность активного центра. Подобные взаимодействия между центрами, свя-

зывающими лиганды одного типа, принято называть  г о м о т р о п н ы м и

в з а и м о д е й с т в и я м и , а взаимодействия между центрами, связывающими

лиганды разных типов, – г е т е р о т р о п н ы м и  в з а и м о д е й с т в и я м и .

Таким образом, приведенные сведения о химической природе активного

центра и аллостерических участках свидетельствуют о том, что в энзима-

тическом катализе, как и в реакции связывания субстрата, участвует не

ограниченная и небольшая часть фермента, как предполагалось ранее,

а значительно большая часть молекулы белка-фермента. Этими обстоя-

тельствами, вероятнее всего, можно объяснить большие размеры и объем-

ность трехмерной структуры молекулы фермента; эти же обстоятельства

следует учитывать в программах создания искусственных низкомолеку-

лярных аналогов ферментов (синзимов), обладающих свойствами на-

тивных ферментов (см. ранее).

ИЗОФЕРМЕНТЫ

Изоферменты, или изоэнзимы,– это множественные формы фермента, ка-

тализирующие одну и ту же реакцию, но отличающиеся друг от друга по

физическим и химическим свойствам, в частности по сродству к субстрату,

* Ряд авторов рекомендуют пользоваться термином  « р е г у л я т о р н ы й центр» (ре-

гуляторный фермент) для ферментов, обладающих регуляторными функциями, поскольку

в этом случае якобы отпадает необходимость уточнения наличия на поверхности фермента

особого центра для связывания эффектора.

126

Рис. 4.5. Модели строения
некоторых олигомерных фер-
ментов.
а - молекула глутаматдегидроге-

назы, состоящая из 6 протоме-

ров (общая мол. м. 336000); б -

молекула РНК-полимеразы; в -

половина молекулы каталазы;

г - молекулярный комплекс пи-

руватдегидрогеназы.

максимальной скорости катализируемой реакции (активности), электро-

форетической подвижности или регуляторным свойствам.

В живой природе имеются ферменты, молекулы которых состоят из двух

и более субъединиц, обладающих одинаковой или разной первичной,

вторичной или третичной структурой. Субъединицы нередко называют

протомерами, а объединенную олигомерную молекулу – мультимером (рис.

4.5; см. главу 1).

Считают, что процесс олигомеризации придает субъединицам белков

повышенную стабильность и устойчивость по отношению к действию

денатурирующих агентов, включая нагревание, влияние протеиназ и др.

Однако на нынешнем этапе знаний нельзя ответить однозначно на вопрос

о существенности четвертичной структуры для каталитической активности

ферментов, поскольку пока отсутствуют методы, позволяющие в «мягких»

условиях разрушить только лишь четвертичную структуру. Применяемые

обычно методы жесткой обработки (экстремальные значения рН, высокие

концентрации гуанидинхлорида или мочевины) приводят к разрушению не

только четвертичной структуры, но и вторичной и третичной структур

стабильного олигомерного фермента, протомеры которого оказываются

денатурированными и, как следствие этого, лишенными биологической

активности.

Следует указать на отсутствие ковалентных, главновалентных связей

между субъединицами. Связи в основном являются нековалентными,

поэтому такие ферменты довольно легко диссоциируют на протомеры.

Удивительной особенностью таких ферментов является зависимость актив-

ности всего комплекса от способа упаковки между собой отдельных

субъединиц. Если генетически различимые субъединицы могут сущест-

вовать более чем в одной форме, то соответственно и фермент, образо-

ванный из двух или нескольких типов субъединиц, сочетающихся в разных

127

а

12,5 нм

б

~9,

5

 н

м

в

г

количественных пропорциях, может существовать в нескольких сходных, но

не одинаковых формах. Подобные разновидности фермента получили

название изоферментов (изоэнзимов или, реже, изозимов). В частности,

если фермент состоит из 4 субъединиц двух разных типов – Н и М (сер-

дечный и мышечный), то активный фермент может представлять собой

одну из следующих комбинаций: НННН, НННМ, ННММ, НМММ,

ММММ, или Н

4

, Н

3

М, Н

2

М

2

, НМ

3

, М

4

, соответствующую изоферментам

ЛДГ

1

, ЛДГ

2

, ЛДГ

3

, ЛДГ

4

 и ЛДГ

5

. При этом синтез Н- и М-типов

осуществляется различными генами и в разных органах экспрессируется

по-разному.

В одних случаях субъединицы имеют почти идентичную структуру

и каждая содержит каталитически активный участок (например, β-галакто-

зидаза, состоящая из 4 субъединиц). В других случаях субъединицы ока-

зываются неидентичными. Примером последних может служить трипто-

фансинтаза, состоящая из 2 субъединиц, каждая из которых наделена

собственной (но не основной) энзиматической активностью, однако, только

будучи объединенными в макромолекулярную структуру, обе субъединицы

проявляют триптофансинтазную активность.

Термин «множественные формы фермента» применим к белкам, ка-

тализирующим одну и ту же реакцию и встречающимся в природе в орга-

низмах одного вида. Термин «изофермент» применим только к тем мно-

жественным формам ферментов, которые появляются вследствие гене-

тически обусловленных различий в первичной структуре белка (но не

к формам, образовавшимся в результате модификации одной первичной

последовательности).

Одним из наиболее изученных 4 ферментов, множественность форм

которого детально изучена методом гель-электрофореза, является ЛДГ,

катализирующая обратимое превращение пировиноградной кислоты в мо-

лочную. Пять изоферментов ЛДГ образуются из 4 субъединиц примерно

одинакового размера, но двух разных типов. Поскольку Н-протомеры несут

более выраженный отрицательный заряд при рН 7,0–9,0, чем М-про-

томеры, изофермент, состоящий из 4 субъединиц Н-типа (Н

4

), при электро-

форезе будет мигрировать с наибольшей скоростью в электрическом поле

к положительному электроду (аноду). С наименьшей скоростью будет

продвигаться к аноду изофермент М

4

, в то время как остальные изо-

ферменты будут занимать промежуточные позиции. Следует подчеркнуть,

что изоферменты ЛДГ, обладая почти одинаковой ферментативной актив-

ностью, различаются некоторыми физико-химическими свойствами: мо-

лекулярной массой, электрофоретической подвижностью, отношением к ак-

Рис. 4.6. Распределение и относитель-

ные количества изоферментов ЛДГ

в различных органах. Экстракты на-

несены на линию, отмеченную над-

писью «Старт». При заданных усло-

виях опыта (рН) 4 изофермента ЛДГ

движутся к аноду, а один (ЛДГ

5

) –

к катоду. Красным цветом выделены

основные изоформы ЛДГ для данно-

го органа.

128

ЛДГ

1

ЛДГ

2

ЛДГ

3

ЛДГ

4

ЛДГ

5

Сердце Почки

Печень Мышцы

Старт