Биологическая химия - часть 28

несколько вперед, укажем, что в процессе превращения (окисления) глю-

козы в организме до СО

2

 и Н

2

О участвует последовательно около 15

различных ферментов (см. главу 10).

Биологические катализаторы, т.е. ферменты, как оказалось, не вызы-

вают в отличие от неорганических катализаторов каких-либо побочных

реакций и не участвуют в реакциях, невозможных по термодинамическим

условиям; и те, и другие катализаторы только ускоряют химические

реакции, обычно протекающие очень медленно. Примером может служить

реакция расщепления перекиси водорода на кислород и воду, медленно

протекающая в отсутствие катализатора. При добавлении мелкораздроб-

ленной платины скорость этой реакции резко возрастает:

Эта же реакция будет протекать намного быстрее в присутствии фермен-

та каталазы, содержащейся, в частности, в эритроцитах, причем образуются

те же конечные продукты распада перекиси водорода.

Таким образом, можно считать установленным, что ферменты ката-

лизируют ряд химических реакций, аналогичных химическим реакциям,

катализируемым неорганическими веществами. Более того, считается ус-

тановленным, что любую из протекающих в живых организмах (или

клетках) химическую реакцию можно в принципе осуществить вне орга-

низма (или вне клетки), если экспериментатору удается выделить соот-

ветствующий фермент (или систему ферментов), катализирующий данную

реакцию, и создать оптимальные условия для его действия.

Горизонты энзимологии. В литературе появляются работы, в которых

делаются попытки прогнозирования дальнейшего развития энзимологии на

ближайшее десятилетие. Перечислим основные направления исследований

энзимологии будущего. Во-первых, это исследования более тонких деталей

молекулярного механизма и принципов действия ферментов в соответствии

с законами классической органической химии и квантовой механики,

а также разработка на этой основе теории ферментативного катализа.

Во-вторых, это изучение ферментов на более высоких уровнях (надмоле-

кулярном и клеточном) структурной организации живых систем, причем не

столько отдельных ферментов, сколько ферментных комплексов в сложных

системах. В-третьих, исследование механизмов регуляции активности и

синтеза ферментов и вклада химической модификации в действие фермен-

тов. В-четвертых, будут развиваться исследования в области создания

искусственных низкомолекулярных ферментов – синзимов (синтетические

аналоги ферментов), наделенных аналогично нативным ферментам высокой

специфичностью действия и каталитической активностью, но лишенных

побочных антигенных свойств. В-пятых, исследования в области инже-

нерной энзимологии (белковая инженерия), создание «гибридных» ката-

лизаторов, сочетающих свойства ферментов, антител и рецепторов, а также

создание биотехнологических реакторов с участием индивидуальных фер-

ментов или полиферментных комплексов, обеспечивающих получение и

производство наиболее ценных материалов и средств для народного хо-

зяйства и медицины. Наконец, исследования в области медицинской эн-

зимологии, основной целью которых является выяснение молекулярных

основ наследственных и соматических болезней человека, в основе развития

которых лежат дефекты синтеза ферментов или нарушения регуляции

активности ферментов.

117

2Н

2

O

2

Платина

(или каталаза)

2Н

2

O + O

2

.

ХИМИЧЕСКАЯ ПРИРОДА ФЕРМЕНТОВ

В настоящее время получены неопровержимые экспериментальные дока-

зательства белковой природы ферментов *.

Трудно сейчас представить, что не только Р. Вильштеттер еще в 1926 г.

отрицал принадлежность ферментов к белкам или к какому-либо извест-

ному классу органических веществ, но и совсем недавно высказывались

сомнения на этот счет. Поводом для сомнений являлись опыты, в которых

хотя и были получены ферментативно активные растворы, но белок не мог

быть обнаружен при помощи качественных цветных реакций. Объясняется

это тем, что концентрация фермента даже при высокой удельной актив-

ности оказывалась ниже пороговой чувствительности химического теста на

белок.

О белковой природе ферментов свидетельствует факт инактивирования

(потеря активности) ферментов брожения при кипячении, установленный

еще Л. Пастером. При кипячении наступает необратимая денатурация

белка-фермента. Фермент при этом теряет присущее ему свойство ка-

тализировать химическую реакцию. Точно так же белки при кипячении

денатурируются и теряют свои биологические свойства (антигенные, гор-

мональные, каталитические). Под влиянием различных физических и хи-

мических факторов (воздействие УФ- и рентгеновского излучения, ультра-

звука, осаждение минеральными кислотами, щелочами, алкалоидными

реактивами, солями тяжелых металлов и др.) происходит денатурация

ферментов, так же как и белков.

Ферменты при гидролизе, как и белки, распадаются на аминокислоты,

что, бесспорно, служит веским доказательством белковой природы фер-

ментов **.

Интересные данные, указывающие на белковую природу ферментов,

были получены в лаборатории И.П. Павлова. При определении пере-

варивающей способности желудочного сока была обнаружена прямая

зависимость между этой способностью и количеством белка в соке. В связи

с этим было сделано заключение, что пепсин желудочного сока является

белком.

Вескими доказательствами белковой природы фермента являются его

получение в чистом виде и выделение в форме кристаллов белка. К настоя-

щему времени получено более 1000 кристаллических ферментов. Структура

многих из них изучена детально при помощи современных методов химии

белков и молекулярной физики [методами рентгеноструктурного анализа,

ядерного магнитного резонанса (ЯМР), электронного парамагнитного ре-

зонанса (ЭПР) и др.].

Ферменты, как и все белки, обладают рядом свойств, характерных для

высокомолекулярных соединений: амфотерностью (могут существовать

в растворе в виде анионов, катионов и амфионов); электрофоретической

подвижностью благодаря наличию в них положительных и отрицательных

зарядов, а в изоэлектрической точке не обнаруживают подвижности в

электрическом поле. Ферменты неспособны к диализу через полупрони-

* Единственным исключением из этого положения является обнаружение у молекулы ряда

предшественников РНК ферментативной активности, получившей название рибозима и ка-

тализирующей самосплайсинг, т.е. отщепление интронных нетранслируемых последователь-

ностей от предшественника РНК (см. главу 13).

** Некоторые ферменты, помимо белковой части, содержат небелковый компонент,

образуя молекулу сложного белка (см. далее).

118

цаемые мембраны. При помощи диализа их растворы можно освободить от

низкомолекулярных примесей. Как и белки, они легко осаждаются из

водных растворов при низких температурах методами высаливания или

осторожным добавлением ацетона, этанола и других веществ и при этом не

теряют своих каталитических свойств.

Подобно белкам, ферменты имеют большую молекулярную массу – от

десятков тысяч до нескольких миллионов (табл. 4.1).

Т а б л и ц а 4.1. Молекулярная масса ферментов

Фермент

Рибонуклеаза

Цитохром с

Трипсин

Пепсин

Гексокиназа

Щелочная фосфатаза

Молекулярная

масса

13700

15000

23800

32100

45000

80000

Фермент

Лактатдегидрогеназа

Альдолаза

Каталаза

Глутаматдегидрогеназа

Уреаза

Пируватдегидрогеназа

(комплекс)

Молекулярная

масса

140000

142000

248000

336000

480000

4500000

Ферменты оказывают высокоспецифическое действие, что также дока-

зывает их белковую природу, поскольку белки в иммунологическом отно-

шении отличаются крайне высокой специфичностью. Наконец, прямым

доказательством белковой природы ферментов является лабораторный

синтез первого фермента – рибонуклеазы, осуществленный в 1969 г. в ла-

боратории Б. Меррифилда в Нью-Йорке *.

Этот автоматический синтез на твердой фазе состоял в последова-

тельном включении всех 124 аминокислотных остатков в строгом соот-

ветствии с последовательностью аминокислот (с первичной структурой)

естественного фермента – рибонуклеазы поджелудочной железы **.

Искусственно синтезированный фермент не отличался от природной

рибонуклеазы по химическим, каталитическим и иммунологическим тес-

там.

Принимая во внимание перечисленные обстоятельства, при получении

ферментов в чистом виде и при их хранении следует учитывать одно важное

свойство белков, а именно стабильность, которая определяется рядом

факторов. Одним из общих правил при работе с ферментами является

оптимальная температура, обычно соответствующая температуре тела,

а для препаративных целей – использование температуры около 0°С.

Следует, однако, иметь в виду, что несколько ферментов, весьма

чувствительных к пониженной температуре, в частности митохондриальный

фермент (АТФаза), катализирующий распад АТФ, при 0°С подвергается

инактивации, в то время как при комнатной температуре остается стабиль-

ным. Большинство ферментов сохраняет стабильность при рН 6,0–8,0, хотя

имеются исключения. Для препаративных целей часто прибегают к обезво-

* Полную первичную структуру панкреатической рибонуклеазы расшифровали в 1955 г.

С. Мур и У. Стейн.

** Осуществлен также искусственный синтез второго фермента – лизоцима, состоящего из

118 аминокислотных остатков.

119

живанию фермента (удаление воды) в вакууме из замороженного раствора

(метод получил название «лиофилизация»). Осаждение из раствора фер-

ментов спиртом или ацетоном также проводят при низкой температуре,

поскольку при комнатной температуре эти процедуры приводят к почти

полной потере ферментативной активности. Для стабилизации фермента

часто пользуются хелатообразующими агентами: например, к ферменту

добавляют этилендиаминтетраацетат (ЭДТА):

ЭДТА может связывать нежелательные примеси (следы ионов тяжелых

металлов: меди, свинца, ртути и др. – в реактивах), тормозящие активность

фермента. Одно из непременных условий сохранения стабильности фер-

ментов – хранение их в высушенном или замороженном состоянии (в усло-

виях холода). Многие ферменты стабильны в виде суспензии в концентри-

рованных растворах сульфата аммония.

СТРОЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ

В природе существуют как простые, так и сложные ферменты. Первые

целиком представлены полипептидными цепями и при гидролизе распа-

даются исключительно на аминокислоты. Такими ферментами (простые

белки) являются гидролитические ферменты, в частности пепсин, трипсин,

папаин, уреаза, лизоцим, рибонуклеаза, фосфатаза и др. Большинство

природных ферментов относится к классу сложных белков, содержащих,

помимо полипептидных цепей, какой-либо небелковый компонент (кофак-

тор), присутствие которого является абсолютно необходимым для ката-

литической активности. Кофакторы могут иметь различную химическую

природу и различаться по прочности связи с полипептидной цепью. Если

константа диссоциации сложного фермента настолько мала, что в растворе

все полипептидные цепи оказываются связанными со своими кофакторами

и не разделяются при выделении и очистке, то такой фермент получает

название  х о л о ф е р м е н т а (холоэнзим), а кофактор – п р о с т е т и ч е с к о й

группы, рассматривающейся как интегральная часть молекулы фермента.

Полипептидную часть фермента принято называть  а п о ф е р м е н т о м .

В литературе до сих пор употребляются и другие наименования компо-

нентов сложных ферментов, в частности «фермент-протеид», «белковый

компонент» (апофермент), «кофермент» (коэнзим) и «простетическая груп-

па». Под  к о ф е р м е н т о м часто подразумевают дополнительную группу,

легко отделяемую от апофермента при диссоциации. Предполагают, что

простетическая группа может быть связана с белком ковалентными и неко-

валентными связями. Так, в молекуле ацетилкоэнзим-А-карбоксилазы ко-

фактор биотин ковалентно связан с апоферментом посредством амидной

связи (см. главу 7). С другой стороны, химические связи между кофакто-

рами и пептидными цепями могут быть относительно слабыми (например,

водородные связи, электростатические взаимодействия и др.). В таких

случаях при выделении ферментов наблюдается полная диссоциация обеих

частей, и изолированый белковый компонент оказывается лишенным фер-

120