Биологическая химия - часть 29

ментативной активности, пока не будет добавлен извне недостающий

кофактор. Именно к подобным изолированным низкомолекулярным орга-

ническим веществам применим термин «кофермент», типичными предста-

вителями которых являются витамины В

1

, В

2

, В

6

, РР, содержащие кофер-

менты. Известно также, что и простетические группы, и коферменты

активно включаются в химические реакции, выполняя функции промежу-

тоных переносчиков электронов, атомов водорода или различных функцио-

нальных групп (например, аминных, ацетильных, карбоксильных). В подоб-

ных случаях кофермент рассматривают в качестве второго субстрата, или

косубстрата.

Роль кофермента (Ко) в качестве переносчика, например, атомов водо-

рода может быть представлена в виде схемы, где SH – субстрат, КоЕ – хо-

лофермент, А – акцептор протона:

Субстрат подвергается окислению, отдавая электроны и протоны,

а КоЕ – восстановлению, принимая электроны и протоны. В следующей

полуреакции восстановленный КоЕН может отдавать электроны и протоны

на какой-либо другой промежуточный переносчик электронов и протонов

или на конечный акцептор (см. главу 9).

Коэнзим, кофактор, простетическая группа – двусмысленный биохими-

ческий жаргон. До сих пор продолжается терминологический спор, по-

скольку часто определения «коэнзим», «кофактор» и «простетическая груп-

па» рассматриваются через призму их роли в реакциях энзиматического

(ферментативного) катализа. Следует, однако, считаться с тем неоспо-

римым фактом, что во многих случаях небелковые органические молекулы,

как и ионы металлов, абсолютно необходимы белковому компоненту при

выполнении определенной биологической функции, не имеющей отношения

к биокатализу. Несомненно, имеют значение также тип и характер связи

небелкового компонента с молекулой белка. Поэтому очевидно, что ко-

фактором может служить любой фактор, абсолютно необходимый для

выполнения белком его каталитической или любой другой биологической

роли. С другой стороны, коферментом может быть любой небелковый

фактор, который непосредственно вовлечен в реакцию энзиматического

катализа. Кофактор, который непосредственно не участвует в акте ката-

лиза, не является коэнзимом. В то же время простетическую группу

(ковалентно связанный небелковый компонент, необходимый для опреде-

ленной функции) можно назвать коферментом, если она непосредственно

участвует в энзиматической реакции. Простетическая группа, которая не

вовлечена в акт катализа, но функционально является существенным как

для фермента, так и для некаталитического белка, может быть названа

кофактором. И наконец, кофактор и кофермент, непрочно связанные (или

слабо связанные) с ферментом или белком, тем не менее не классифи-

цируются в качестве простетических групп.

Многие двухвалентные металлы (Mg

2+

, Мn

2+

, Са

2+

), как будет пока-

зано далее, также выполняют роль кофакторов, хотя они не относятся ни

к коферментам, ни к простетическим группам. Известны примеры, когда

ионы металлов прочно связаны с белковой молекулой, выполняя функции

121

SH

S

КoЕ

КоЕН

AH

A

простетической группы. В частности, очищенный фермент, катализирую-

щий окисление аскорбиновой кислоты (витамин С) в дезоксиаскорбиновую

кислоту, содержит 8 атомов меди на одну молекулу; все они настолько

прочно связаны с белковой молекулой, что даже не обмениваются с ионо-

обменными смолами и не отделяются методом диализа. Более того,

с помощью метода электронного парамагнитного резонанса показано

участие ионов меди в промежуточном переносе электронов. Интересно

отметить, что свободные ионы меди также наделены каталитической

активностью при окислении аскорбиновой кислоты, однако эта активность

повышается во многие тысячи раз, если ионы меди соединяются с апофер-

ментом в единый комплекс – холофермент.

Данные о важнейших коферментах и простетических группах ферментов,

включая их наименования и структуру, химическую природу витамина,

входящего в их состав, и характер выполняемой биохимической функции

в метаболизме, детально рассмотрены в главах 7 и 9–13.

Получены доказательства кофакторной функции в ферментативных

реакциях и ряда других биологически активных соединений, не относящихся

к витаминам: HS-глутатиона, АТФ, липоевой кислоты, производных ну-

клеозидов (уридинфосфат, цитидинфосфат, фосфоаденозинфосфосульфат),

порфиринсодержащих веществ и др. Сюда же могут быть отнесены тРНК,

которые в составе ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз принимают ак-

тивное участие в транспорте аминокислот в рибосоме, где осуществляется

синтез белка (см. главу 14).

Следует отметить одну отличительную особенность двухкомпонентных

ферментов: ни кофактор отдельно (включая большинство коферментов), ни

сам по себе апофермент каталитической активностью не наделены, и только

их объединение в одно целое, протекающее не хаотично, а в соответствии

с программой их структурной организации, обеспечивает быстрое про-

текание химической реакции.

Активный центр ферментов

При изучении механизма химической реакции, катализируемой фермента-

ми, исследователя всегда интересует не только определение промежуточных

и конечных продуктов и выяснение отдельных стадий реакции, но и природа

тех функциональных групп в молекуле фермента, которые обеспечивают

специфичность действия фермента на данный субстрат (субстраты) и высо-

кую каталитическую активность. Речь идет, следовательно, о точном

знании геометрии и третичной структуры фермента, а также химической

природы того участка (участков) молекулы фермента, который обеспе-

чивает высокую скорость каталитической реакции. Участвующие в фер-

ментативных реакциях молекулы субстратов часто имеют небольшие раз-

меры по сравнению с молекулами ферментов, поэтому было высказано

предположение, что при образовании фермент-субстратных комплексов

в непосредственный контакт с молекулой субстрата, очевидно, вступает

ограниченная часть аминокислот пептидной цепи. Отсюда возникло пред-

ставление об  а к т и в н о м центре фермента. Под активным центром

подразумевают уникальную комбинацию аминокислотных остатков в мо-

лекуле фермента, обеспечивающую непосредственное связывание ее с мо-

лекулой субстрата и прямое участие в акте катализа (рис. 4.2). Установлено,

что у сложных ферментов в состав активного центра входят также просте-

тические группы.

В активном центре условно различают так называемый  к а т а л и т и -

122

Рис. 4.2. Активный центр фер-
мента (схема) (по Малеру и

Кордесу).
Темные полосы - участки полипеп-

тидной цепи фермента; R - амино-

кислотные остатки и их порядковые

номера (с N-конца).

ч е с к и й центр, непосредственно вступающий в химическое взаимодейст-

вие с субстратом, и  с в я з ы в а ю щ и й центр, или  к о н т а к т н у ю («якор-

ную»)  п л о щ а д к у , которая обеспечивает специфическое сродство к субст-

рату и формирование его комплекса с ферментом. В свою очередь молекула

субстрата также содержит функционально различные участки: например,

субстраты эстераз или протеиназ – одну специфическую связь (или группу

атомов), подвергающуюся атаке со стороны фермента, и один или несколь-

ко участков, избирательно связываемых ферментом.

Получены экспериментальные доказательства наличия в активном цент-

ре химотрипсина двух остатков гистидина и остатка серина, схематически

представленных в трехмерной структурной модели предшественника этого

фермента (рис. 4.3). Выявление химической природы и вероятной топогра-

фии групп активного центра – проблема первостепенной важности. Она

сводится к определению природы аминокислот, их последовательности

и взаиморасположения в активном центре. Для идентификации так назы-

ваемых существенных аминокислотных остатков используют специфиче-

ские ингибиторы ферментов (часто это субстратподобные вещества или

аналоги коферментов), методы «мягкого» (ограниченного) гидролиза в со-

четании с химической модификацией, включающей избирательное окисле-

ние, связывание, замещение остатков аминокислот и др.

При помощи методов ингибиторного анализа были предприняты по-

пытки установить закономерности состава и структуры активных центров

у ферментов, относящихся к разным группам. В частности, при использо-

123

Связывающий

центр

Каталити-

ческий

центр

Активный центр

Молекула химотрипсина

Рис. 4.3. Гипотетическая модель тре-

тичной структуры молекулы пред-
шественника химотрипсина (по Ней-

рату).
Цветом выделены остатки серина и гисти-

дина; стрелкой обозначено место отщеп-

ления N-концевого участка полипептид-

ной цепи.

вании диизопропилфторфосфата (ДФФ), принадлежащего к так называе-

мым нервным ядам, наблюдается полное выключение активного центра

холинэстеразы – фермента, катализирующего гидролиз ацетилхолина на

холин и уксусную кислоту. Оказалось, что этот ингибитор имеет близкое

структурное сходство с ацетилхолином и подобно ему взаимодействует

с ОН-группой остатка серина в активном центре. Вызывая фосфори-

лирование серина в активном центре ряда других ферментов, ДФФ также

инактивирует их действие:

Показано, что ДФФ избирательно фосфорилирует в каждом чувстви-

тельном к нему ферменте только один остаток серина, наделенный

функциональной активностью. Учитывая этот механизм действия ДФФ,

сделаны попытки определения природы аминокислот в окружении «ка-

талитического» остатка серина у ряда ферментов (табл. 4.2).

Из данных табл. 4.2 видно, что ферменты, сходные по типу действия,

хотя и различаются специфичностью, могут иметь почти одинаковую

последовательность аминокислотных остатков в тех участках, которые

примыкают к остатку серина, несущему функционально активную гидро-

ксильную группу. Существенное значение ОН-группы серина для акта

катализа было доказано, кроме того, химическим ее блокированием или

удалением, когда эстеразы полностью лишались ферментативной актив-

ности.

124

Активный фермент

ДФФ

Неактивный фермент