Биологическая химия - часть 31

тиваторам и ингибиторам и др., однако для каждой ткани в норме

характерно свое соотношение форм (изоферментный спектр) ЛДГ. Напри-

мер, в сердечной мышце преобладает Н

4

, т.е. ЛДГ

1

, а в скелетных мышцах

и печени – М

4

 (ЛДГ

5

) (рис. 4.6). Эти обстоятельства широко используют

в клинической практике, поскольку изучение появления изоферментов ЛДГ

(и ряда других ферментов) в сыворотке крови может представлять интерес

для дифференциальной диагностики органических и функциональных по-

ражений органов и тканей. По изменению содержания изоферментов

в сыворотке крови можно судить как о топографии патологического

процесса, так и о степени поражения органа или ткани.

МУЛЬТИМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ

Особую группу ферментов составляют надмолекулярные (или мульти-

молекулярные) ферментные комплексы, в состав которых входят не

субъединицы (в каталитическом отношении однотипные протомеры), а раз-

ные ферменты, катализирующие последовательные ступени превращения

какого-либо субстрата. Отличительными особенностями подобных муль-

тиферментных комплексов являются прочность ассоциации ферментов

и определенная последовательность прохождения промежуточных стадий

во времени, обусловленная порядком расположения каталитически актив-

ных (различных) белков в пространстве («путь» превращения в пространст-

ве и времени). Типичными примерами подобных мультиферментных комп-

лексов являются пируватдегидрогеназа и α-кетоглутаратдегидрогеназа, ка-

тализирующие соответственно окислительное декарбоксилирование пиро-

виноградной и α-кетоглутаровой кислот в животных тканях (см. главу 10),

и синтетаза высших жирных кислот (см. главу 11). Молекулярные массы

этих комплексов в зависимости от источника их происхождения варьируют

от 2,3•10

6

 до 10•10

6

. Ассоциация отдельных ферментов в единый недиссо-

циирующий комплекс имеет определенный биологический смысл и ряд

преимуществ. В частности, при этом резко сокращаются расстояния, на

которые молекулы промежуточных продуктов должны перемещаться при

действии изолированных ферментов. Ряд таких мультиферментных комп-

лексов, иногда называемых ферментными ансамблями, структурно связан

с какой-либо органеллой (рибосомы, митохондрии) или с биомембраной

и составляет высокоорганизованные надмолекулярные системы, обеспе-

чивающие жизненно важные функции, например тканевое дыхание (перенос

электронов от субстратов к кислороду через систему дыхательных фер-

ментов).

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

Структура и функции ферментов, а также механизм их действия почти

ежегодно подробно обсуждаются на многих международных симпозиумах

и конгрессах. Важное место отводится рассмотрению структуры всей

молекулы фермента и ее активных центров, молекулярному механизму

действия различных типов ферментов, общей теории энзиматического

катализа. Тем не менее до сих пор нет полной ясности по двум кардиналь-

ным проблемам энзимологии: чем вызваны специфичность действия и вы-

сокая каталитическая эффективность ферментов?

До установления химической природы ферментов гипотезы о механизме

их действия опирались на исследования кинетики и модельные опыты

химического гомогенного катализа. Повышение скорости химических реак-

129

ций под действием ферментов объясняли следующим: а) активированием

субстрата в результате образования адсорбционных или молекулярных,

обратимо диссоциирующих фермент-субстратных комплексов; б) цепным

механизмом реакций с участием радикалов или возбужденных молекул.

Оказалось, что цепные механизмы реакции не играют существенной роли

в биологическом катализе. После установления химической природы фер-

ментов подтвердилось представление, выдвинутое более 80 лет назад

В. Анри, Л. Михаэлисом и М. Ментен, о том, что при энзиматическом

катализе фермент Е соединяется (в принципе обратимо) со своим субстра-

том S, образуя нестойкий промежуточный фермент-субстратный комплекс

ES, который в конце реакции распадается с освобождением фермента

и продуктов реакции Р. Благодаря высокому сродству связывания и обра-

зованию ES-комплекса резко возрастает число молекул субстрата, всту-

пающих в реакции. Эти представления легли в основу теории «ключа-

замка» Э. Фишера, которую иногда называют теорией «жесткой матрицы».

Таким образом, жесткая структура активного центра оказывается комп-

лементарной молекулярной структуре субстрата, обеспечивая тем самым

высокую специфичность фермента.

Л. Михаэлис не только постулировал образование промежуточного

фермент-субстратного ES-комплекса, но и рассчитал влияние концентрации

субстрата на скорость реакции. В процессе реакции различают несколько

стадий: присоединение молекулы субстрата к ферменту, преобразование

первичного промежуточного соединения в один или несколько последова-

тельных (переходных) комплексов и протекающее в одну или несколько

стадий отделение конечных продуктов реакции от фермента. Это можно

схематически проиллюстрировать следующими примерами:

В реакциях анаболизма, например А + В —> АВ, фермент может соединяться

как с одним, так и с другим субстратом или обоими субстратами:

В реакциях катаболизма, например АВ —> А + В:

На рис. 4.7 представлена схема образования промежуточного фер-

мент-субстратного комплекса. Если фермент в активном центре содержит

кофермент, то предполагается образование тройного комплекса (рис. 4.8).

Фермент вступает во взаимодействие с субстратом на очень короткий

период, поэтому долгое время не удавалось показать образование такого

комплекса. Прямые доказательства существования фермент-субстратного

комплекса были получены в лабораториях Д. Кейлина и Б. Чанса. В на-

стоящее время экспериментальные и математические методы кинетики,

термодинамики и статической механики химических реакций позволяют

130

а) АВ

 + Е

 –>

 ABE

б)

 АВЕ

 –>

 А + BE

в) ВЕ

 –>

 В + Е

(а

 + б + в): АВ + Е

 –>

 А + В + Е

Рис. 4.7. Образование не-

стойкого фермент-субст-

ратного комплекса со-

гласно теории Э. Фишера

«ключ-замок».

Рис. 4.8. Функция кофер-

мента (по А. Кантарову и

Б. Шепартцу).

Рис. 4.9. Образование не-

ковалентных связей меж-

ду ферментом и субстра-

том (схема).

131

Фермент

Активный

комплекс

Фермент

Субстрат

Продукты

реакции

Субстрат

Апофермент

Кофермент

Активный

комплекс

Субстрат

определить для ряда ферментативных реакций кинетические и термоди-

намические показатели, в частности константы диссоциации промежуточ-

ных фермент-субстратных комплексов, константы скорости и равновесия их

образования.

В образовании фермент-субстратных комплексов участвуют водородные

связи, электростатические и гидрофобные взаимодействия, а в ряде случаев

также ковалентные, координационные связи (рис. 4.9). Информация о при-

роде связей между субстратом и связывающим участком активного центра

фермента может быть получена методами ЭПР и ЯМР, а также методами

УФ- и ИК-спектроскопии.

Для каталитической активности фермента существенное значение имеет

пространственная структура, в которой жесткие участки α-спиралей че-

редуются с гибкими, эластичными линейными отрезками, обеспечиваю-

щими динамические изменения белковой молекулы фермента. Этим изме-

неням придается большое значение в некоторых теориях ферментативного

катализа. Так, в противоположность модели Э. Фишера «ключ-замок»

Д. Кошлендом была разработана теория  « и н д у ц и р о в а н н о г о соответ-

ствия», допускающая высокую конформационную лабильность молекулы

белка-фермента и гибкость и подвижность активного центра. Эта теория

была основана на весьма убедительных экспериментах, свидетельствующих

о том, что субстрат индуцирует конформационные изменения молекулы

фермента таким образом, что активный центр принимает необходимую для

связывания субстрата пространственную ориентацию. Иными словами,

фермент только в присутствии (точнее, в момент присоединения) субстрата

будет находиться в активной (напряженной) Т-форме в отличие от неактив-

ной R-формы (рис. 4.10). На рис. 4.10 видно, что присоединение субстрата

S к ферменту Е, вызывая соответствующие изменения конформации актив-

ного центра, в одних случаях приводит к образованию активного комплек-

са, в других – неактивного комплекса вследствие нарушения пространствен-

ного расположения функциональных групп активного центра в проме-

жуточном комплексе. Получены экспериментальные доказательства нового

положения о том, что постулированное Д. Кошлендом «индуцированное

соответствие» субстрата и фермента создается не обязательно изменениями

Рис. 4.10. Изменения структуры активного центра фермента, вызванные субстра-

том, согласно модели «индуцированного соответствия» Д. Кошленда.

А, В, С - функциональные группы активного центра; 1 - активный комплекс; 2 - неактивный

комплекс.

132