Биологическая химия - часть 11

Изоэлектрическая и изоионная точки белков

В изоэлектрической точке суммарный заряд белков, обладающих амфотер-

ными свойствами, равен нулю и белки не перемещаются в электрическом

поле. Зная аминокислотный состав белка, можно приближенно определить

изоэлектрическую точку (pI); pI является характерной константой белков.

Изоэлектрическая точка большинства белков животных тканей лежит в пре-

делах от 5,5 до 7,0, что свидетельствует о частичном преобладании кислых

аминокислот. Однако в природе имеются белки, у которых значения

изоэлектрических точек лежат в крайних значениях рН среды. В частности,

величина рI пепсина (фермент желудочного сока) равна 1, а сальмина

(основной белок из молоки семги) – почти 12.

В изоэлектрической точке белки наименее устойчивы в растворе и легко

выпадают в осадок. Изоэлектрическая точка белка в сильной степени

зависит от присутствия в растворе ионов солей; в то же время на ее

величину не влияет концентрация белка.

В химии белков существует понятие «изоионная точка белка». Раствор

белка называется изоионным, если он не содержит никаких других ионов,

кроме ионизированных остатков аминокислот белковой молекулы и ионов,

образующихся при диссоциации воды. Для освобождения белка от посто-

ронних ионов обычно его раствор пропускают через колонку, наполненную

смесью анионо- и катионообменников. Изоионной точкой данного белка

принято называть значение рН изоионного раствора этого белка:

где [Р] – молярная концентрация белка; Z – средний заряд молекулы. Со-

гласно этому уравнению, изоионная точка белка зависит от его концент-

рации. Очевидно, поэтому белок, за исключением случая, когда рI равно 7,

не может быть одновременно изоэлектрическим и изоионным.

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВ

Выяснение структурной организации белков считается одной из главных

проблем современной биохимии. Оно имеет важное научно-практическое

значение для понимания огромного разнообразия функций белков, выпол-

няемых ими в живых организмах. Белковые молекулы представляют собой

продукт полимеризации 20 различных мономерных молекул (аминокислот),

соединенных не хаотично, а в строгом соответствии с кодом белкового

синтеза (см. главу 14). Вопрос о том, каким образом соединяются между

собой многие десятки и сотни аминокислот в белковой молекуле, был

предметом пристального внимания многих лабораторий мира, занимав-

шихся химией белка.

Впервые А.Я. Данилевский (1888), изучая биуретовую реакцию, высказал

предположение о существовании во всех белковых веществах одинаковых

групп атомов и связей, аналогичных биурету NH

2

—СО—NH—СО—NH

2

.

Тем самым А.Я. Данилевский первый указал на связь —NH—СО—

(позднее получившую название пептидной связи) как на наиболее вероят-

ный способ соединения аминокислот в белковой молекуле.

Однако только Э. Фишер (1902) сформулировал полипептидную теорию

строения. Согласно этой теории, белки представляют собой сложные

полипептиды, в которых отдельные аминокислоты связаны друг с другом

пептидными связями, возникающими при взаимодействии α-карбоксильных

49

СООН- и α-NН

2

-групп аминокислот. На примере взаимодействия аланина

и глицина образование пептидной связи и дипептида (с выделением молеку-

лы воды) можно представить следующим уравнением:

Аналогичным способом к дипептиду могут присоединяться и другие

аминокислоты с образованием три-, тетра-, пентапептида и т.д. вплоть до

крупной молекулы полипептида (белка). Наименование пептидов склады-

вается из названия первой N-концевой аминокислоты со свободной NH

2

-

группой (с окончанием -ил, типичным для ацилов), названий последующих

аминокислот (также с окончаниями -ил) и полного названия С-концевой

аминокислоты со свободной СООН-группой. Например, пентапептид из

5 аминокислот может быть обозначен полным наименованием: глицил-

аланил-серил-цистеинил-аланин, или сокращенно Гли–Ала–Сер–Цис–Ала *.

Образование пептидных связей, например, из трех разных аминокислот

может быть представлено в виде следующей схемы:

Химический синтез полипептидов и современные физико-химические

методы исследования белков полностью подтвердили существование пеп-

тидных связей в структуре белка. Получены следующие экспериментальные

доказательства полипептидной теории строения белка.

1. В природных белках сравнительно мало титруемых свободных

СООН- и NH

2

-групп, поскольку абсолютное их большинство находится

в связанном состоянии, участвуя в образовании пептидных связей; титрова-

нию доступны в основном свободные СООН- и NН

2

-группы у N- и С-

концевых аминокислот пептида.

2. В процессе кислотного или щелочного гидролиза белка образуются

стехиометрические количества титруемых СООН- и NH

2

-групп, что свиде-

тельствует о распаде определенного числа пептидных связей.

* Синтез полипептидов (белков) в клетках живых организмов протекает значительно

сложнее с участием нуклеиновых кислот. Этот процесс детально рассматривается в главе 14.

50

Аланин

Глицин

Аланилглицин

Трипептид

N-концевая АМК

Пептидные связи

С-концевая АМК

Н

2

О

Н

2

О

Н

2

О

3. Под действием протеолитических ферментов (протеиназ) белки рас-

щепляются на строго определенные фрагменты, называемые пептидами,

с концевыми аминокислотами, соответствующими избирательности дейст-

вия протеиназ. Структура некоторых таких фрагментов неполного гидроли-

за доказана последующим химическим их синтезом.

4. Биуретовую реакцию (сине-фиолетовое окрашивание в присутствии

раствора сульфата меди в щелочной среде) дают как биурет, содержащий

пептидную связь, так и белки, что также является доказательством наличия

в белках аналогичных связей.

5. Анализ рентгенограмм кристаллов белков подтверждает полипептид-

ную структуру белков. Таким образом, рентгеноструктурный анализ при

разрешении 0,15–0,2 нм позволяет не только вычислить межатомные рас-

стояния и размеры валентных углов между атомами С, Н, О и N, но

и «увидеть» картину общего расположения аминокислотных остатков

в полипептидной цепи и пространственную ее ориентацию (конформацию).

6. Существенным подтверждением полипептидной теории строения бел-

ка является возможность синтеза чисто химическими методами полипеп-

тидов и белков с уже известным строением: инсулина – 51 аминокислотный

остаток, лизоцима – 129 аминокислотных остатков, рибонуклеазы – 124

аминокислотных остатка *. Синтезированные белки обладали аналогичны-

ми природным белкам физико-химическими свойствами и биологической

активностью.

Полипептидная теория строения не отрицает существования в молекуле

белка и других связей, включая ковалентные (например, дисульфидные

—S—S-связи) и нековалентные (например, водородные связи и др.). Они

будут рассмотрены далее.

Пептидные связи играют исключительную роль как в «архитектуре», так

и в функции белков. Поэтому следует указать на некоторые особенности

строения полипептидной цепи. Во-первых, это своеобразие расположения

атомов углерода и азота, находящихся примерно в одной плоскости,

и атомов водорода и радикалов, направленных к этой плоскости под углом

109°28'. Во-вторых, это своеобразие петидной связи. Расстояние между

атомами С и N в пептидной связи (равное 0,132 нм) является промежу-

точным между простой (ординарной) связью (связь —С—N—, равная

0,147 нм) и двойной связью (связь —C=N—, равная 0,125 нм). Это создает

предпосылки для осуществления по месту двойной связи таутомерных

перегруппировок и для образования енольной (лактимной) формы. Послед-

няя в свою очередь дает молекуле белка ряд преимуществ (повышение

реакционной способности, возникновение дополнительных возможностей

вращения и др.):

* Полный синтез рибонуклеазы осуществлен одновременно и независимо друг от друга

Б. Меррифилдом и Р. Хиршманом. Этот метод реализован в автоматическом синтезаторе

пептидов.

51

Лактамная (кетонная) форма

Лактимная (енольная) форма

Наконец, следует указать на своеобразие радикалов, которые являются

полифункциональными, несущими свободные NH

2

-, СООН-, ОН-, SH-

группы и, как было указано, определяют структуру (пространственную)

и многообразие функций молекул белка. Взаимодействуя с окружающими

молекулами растворителя (Н

2

О), функциональные группы (в частности,

NH

2

- и СООН-группы) ионизируются, что приводит к образованию анион-

ных и катионных центров белковой молекулы. В зависимости от соотноше-

ния ионов молекулы белка получают суммарный положительный (+) или

отрицательный (–) заряд с определенным значением изоэлектрической

точки.

Получены доказательства предположения К. Линдерстрёма-Ланга о су-

ществовании 4 уровней структурной организации белковой молекулы:

первичной, вторичной, третичной и четвертичной структуры. Техника совре-

менной белковой химии разработана настолько хорошо, что позволяет

в принципе расшифровать структурную организацию любого белка.

Первичная структура белка

К настоящему времени расшифрована первичная структура десятков тысяч

разных белков, что является несомненным достижением биохимии. Однако

это число ничтожно мало, если учесть, что в природе около 10

12

 разно-

образных белков. Под первичной структурой подразумевают порядок,

последовательность расположения аминокислотных остатков в полипеп-

тидной цепи. Зная первичную структуру, местоположение каждого остатка

аминокислоты, можно точно написать структурную формулу белковой

молекулы, если она представлена одной полипептидной цепью. Если

в состав белка входит несколько полипептидных цепей, объединенных

в одну белковую молекулу посредством дисульфидных связей и нековалент-

ных взаимодействий, или если одна полипептидная цепь содержит внутрен-

ние дисульфидные связи, то задача определения первичной структуры

несколько осложняется, так как необходимо предварительное разъединение

этих цепей и связей. Разъединение таких полипептидных цепей производят

с помощью денатурирующих агентов (растворы 8М мочевины или 6М

гуанидингидрохлорида), разрывающих нековалентные связи. Дисульфид-

ные связи разрушают путем окисления или восстановления (надмуравьиной

кислотой или β-меркаптоэтанолом соответственно), при этом образуются

свободные полипептиды, содержащие или остатки цистеиновой кислоты,

или цистеина:

Для определения первичной структуры отдельной, химически гомоген-

ной полипептидной цепи в первую очередь методами гидролиза выясняют

аминокислотный состав, точнее, соотношение каждой из 20 аминокислот

в образце гомогенного полипептида. Затем приступают к определению

химической природы концевых аминокислот полипептидной цепи, содержа-

щей одну свободную NH

2

-группу и одну свободную СООН-группу.

52