Биологическая химия - часть 10

(g), превышающие в 200000 и более раз ускорение земного притяжения.

Обычно вычисляют молекулярную массу по скорости седиментации моле-

кул белка или седиментационному равновесию. По мере перемещения

молекул от центра к периферии образуется резкая граница растворитель-

белок (регистрируется автоматически). Оптические свойства растворителя

и белка используются при определении скорости седиментации; последнюю

выражают через константу седиментации s, которая зависит как от массы,

так и от формы белковой частицы:

где v – скорость перемещения границы растворитель-белок, см/с; ω – угло-

вая скорость ротора, рад/с; r – расстояние от центра ротора до середины

ячейки с раствором белка, см. Константа седиментации имеет размерность

времени (ее выражают в секундах). Величина константы седиментации,

равная 1•10

–13

 с, условно принята за единицу и названа  с в е д б е р г о м (S).

Значения констант седиментации большинства белков лежат в пределах

1–50 S, хотя в ряде случаев эти значения превышают 100 S.

Для вычисления молекулярной массы (М), помимо константы седимен-

тации, необходимы дополнительные сведения о плотности растворителя

и белка и другие согласно уравнению Сведберга:

где R – газовая постоянная, эрг/(моль•град); Т – абсолютная температура

(по шкале Кельвина); s – константа седиментации; ρ – плотность раствори-

теля; v – парциальный удельный объем молекулы белка; D - коэффициент

диффузии.

Определение молекулярной массы белков методом ультрацентрифуги-

рования требует много времени и сложной и дорогостоящей аппаратуры.

Поэтому в последние годы разработаны два более простых метода (гель-

хроматография и электрофорез). При использовании гель-хроматографии

в первую очередь требуется откалибровать колонку. Для этого через

колонку с сефадексом пропускают несколько белков с известными молеку-

лярными массами и строят график, откладывая значения логарифмов

молекулярной массы против их элюционных объемов, которые находят, как

показано на рис. 1.9.

Известно, что между логарифмом молекулярной массы белка, имеюще-

го сферическую форму, и элюционным объемом существует прямая зависи-

мость. Поэтому легко определить молекулярную массу исследуемого белка,

зная его объем элюции. Второй разновидностью этого метода является

тонкослойная гель-хроматография. Длина пробега белка (в миллиметрах)

Рис. 1.9. Измерение объема элюции (V

Э

).

45

Концентраци

я

V

Э

мл

Рис. 1.10. Зависимость между длиной

пробега белковых частиц при гель-хро-

матографии в тонком слое сефадекса

Г-150 (сверхтонкого) и их молекуляр-

ными массами (в полулогарифмической

системе координат).

1 - рибонуклеаза; 2 - химотрипсиноген; 3 -

яичный альбумин; 4 - сывороточный альбу-

мин; 5 - γ-глобулин; Х - белок с неизвестной

молекулярной массой.

через тонкий слой сефадекса находится в логарифмической зависимости от

молекулярной массы белка (рис. 1.10).

Гель-хроматография, кроме простоты и быстроты, имеет дополнитель-

ное преимущество: не требуется выделять белок в чистом виде, так как

примеси других белков не мешают определению, поскольку каждый из них

проходит через колонку со свойственной ему скоростью, определяемой

молекулярной массой. Это обстоятельство широко используется в энзимо-

логии, когда оказывается возможным определение молекулярной массы

даже очень небольшого количества фермента в присутствии других белков,

не обладающих аналогичной каталитической активностью.

При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле для

определения молекулярной массы белков также строят график зависимости

между логарифмом молекулярной массы калибровочных белков и подвиж-

ностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем, определив

подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу (рис. 1.11).

Электрофорез проводят в присутствии детергента додецилсульфата натрия,

так как только в этом случае наблюдается прямая пропорциональная

зависимость между молекулярной массой и подвижностью белков. Белки

с четвертичной структурой при этих условиях распадаются на субъединицы,

поэтому метод находит широкое применение для определения молекуляр-

ной массы субъединиц белка.

Рис. 1.11. Зависимость между молеку-

лярной массой и относительной подвиж-

ностью белка при диск-электрофорезе

в полиакриламидном геле в присутствии

додецилсульфата натрия (в полулогариф-

мической системе координат).

1 - сывороточный альбумин; 2 - яичный альбу-

мин; 3 - пепсин; 4 - химотрипсиноген; 5 - мио-

глобин; 6 - цитохром с; Х - белок с неизвест-

ной молекулярной массой.

46

Длин

а пробега

, м

м

Молекулярная масса x 10

–4

Молекулярна

я масс

а х

 10

–4

Относительная подвижность

Недавно предложен новый масс-спектрометрический метод (так назы-

ваемый лазерный десорбционно-ионизационный метод), позволяющий оп-

ределять молекулярную массу небольших пептидов (вазопрессин, инсулин)

и крупных биополимерных молекул и, кроме того, структуру биомолекул.

Форма белковых молекул

О величине и форме белковых молекул раньше судили по данным ультра-

центрифугирования, двойного лучепреломления и диффузии. Эти данные

указывали на существование в природе глобулярных (шарообразных) и

фибриллярных (нитевидных) белков. В настоящее время общие представле-

ния о форме белковых молекул в основном подтвердились, однако только

современные методы исследования позволили установить детали прост-

ранственной конфигурации (трехмерной структуры) белковых молекул.

Благодаря применению сканирующей микроскопии и рентгеноструктурного

анализа (высокое разрешение, порядка 0,2–0,3 нм) удалось в деталях

расшифровать не только полную пространственную структуру, форму, но

и степень асимметрии белковых молекул во всех трех измерениях. Оказа-

лось, что даже глобулярные белки крови (гемоглобин, альбумины и гло-

булины) являются асимметричными в указанных измерениях. Следует

отметить, что не только физико-химические, но и биологические свойства

белков (в свободном или в связанном друг с другом или с другими

биополимерами состоянии) определяются их пространственной структурой.

Денатурация белков

Природные белковые тела наделены определенной, строго заданной прост-

ранственной конфигурацией и обладают рядом характерных физико-хими-

ческих и биологических свойств при физиологических значениях темпера-

туры и рН среды. Под влиянием различных физических и химических

факторов белки подвергаются свертыванию и выпадают в осадок, теряя

нативные свойства. Таким образом, под денатурацией следует понимать

нарушение общего плана уникальной структуры нативной молекулы белка,

преимущественно ее третичной структуры, приводящее к потере характер-

ных для нее свойств (растворимость, электрофоретическая подвижность,

биологическая активность и т.д.). Большинство белков денатурирует при

нагревании их растворов выше 50–60°С.

Внешние проявления денатурации сводятся к потере растворимости,

особенно в изоэлектрической точке, повышению вязкости белковых раство-

ров, увеличению количества свободных функциональных SH-групп и изме-

нению характера рассеивания рентгеновских лучей. Наиболее характерным

признаком денатурации является резкое снижение или полная потеря

белком его биологической активности (каталитической, антигенной или

гормональной). При денатурации белка, вызванной 8М мочевиной или

другим агентом, разрушаются в основном нековалентные связи (в частно-

сти, гидрофобные взаимодействия и водородные связи). Дисульфидные

связи в присутствии восстанавливающего агента меркаптоэтанола разры-

ваются, в то время как пептидные связи самого остова полипептидной цепи

не затрагиваются. В этих условиях развертываются глобулы нативных

белковых молекул и образуются случайные и беспорядочные структуры

(рис. 1.12).

При непродолжительном действии и быстром удалении денатурирую-

щих агентов возможна ренатурация белка с полным восстановлением

47

Рис. 1.12. Денатурация бел-
ковой молекулы (схема).
а - исходное состояние; б - начи-

нающееся обратимое нарушение

молекулярной структуры; в - не-

обратимое развертывание поли-

пептидной цепи.

Рис. 1.13. Денатурация и ре-
натурация рибонуклеазы (по
Анфинсену).
а - развертывание (мочевина +

меркаптоэтанол); б - повторное

свертывание.

исходной трехмерной структуры и нативных свойств его молекулы

(рис. 1.13), включая биологическую активность. Таким образом, при дена-

турации белковая молекула полностью теряет биологические свойства,

демонстрируя тем самым тесную связь между структурой и функцией. Для

практических целей иногда используют процесс денатурации в «мягких»

условиях, например при получении ферментов или других биологически

активных белковых препаратов в условиях низких температур в присутст-

вии солей и при соответствующем значении рН *. При лиофилизации

белков (высушивание в вакууме путем возгонки влаги из замороженного

состояния) для предотвращения денатурации часто пользуются химически-

ми веществами (простые сахара, глицерин, органические анионы).

* Процесс денатурации используется в медицинской практике: при отравлениях сулемой

или другими солями тяжелых металлов пострадавшему в качестве «противоядия» дают

молоко или раствор яичного белка.

48

а

б

в

а

б