Биологическая химия - часть 9

Т а б л и ц а 1.4. Аминокислотный состав некоторых природных белков, в процентах

Аминокислота

Белок

Аланин

Глицин

Валин

Лейцин

Изолейцин

Пролин

Фенилаланин

Тирозин

Триптофан

Серин

Треонин

Цистеин +

цистин

Метионин

Аргинин

Гистидин

Лизин

Аспарагиновая

кислота

Глутаминовая

кислота

Амидный азот

Саль-

мин

1,1

2,9

3,1

0

1,6

5,8

0

0

0

9,1

0

0

0

85,2

0

0

0

0

0

Гистон

(печень

телен-

ка)

7,6

5,8

5,5

9,1

4,6

3,4

3,5

3,9

–

4,1

6,4

–

0,9

14,8

2,3

11,7

5,5

10,3

0,7

Казеин

3,2

2,0

7,2

9,2

6,1

10,6

5,0

6,3

1,2

6,3

4,9

0,3

2,8

4,1

3,1

8,2

7,1

22,4

1,6

Альбу-

мин (сы-

воротка

челове-

ка)

–

1,6

7,7

11,0

1,7

5,1

7,8

4,7

0,2

3,3

4,6

6,3

1,3

6,2

3,5

12,3

9,0

17,0

0,9

γ-Гло-

булин

(чело-

века)

–

4,2

9,7

9,3

2,7

8,1

4,6

6,8

2,9

11,4

8,4

3,1

1,1

4,8

2,5

8,1

8,8

11,8

1,1

Пепсин

–

6,4

7,1

10,4

10,8

5,0

6,4

8,5

2,4

12,2

9,6

2,1

1,7

1,0

0,9

0,9

16,0

11,9

1,3

Инсу-

лин

4,5

4,3

7,7

13,2

2,8

2,5

8,8

13,0

0

5,2

2,1

12,5

–

3,1

4,9

2,5

6,8

18,6

1,4

Колла-

ген

9,5

27,2

3,4

–

5,6

15,1

2,5

1,0

0

3,4

2,3

0

0,8

8,6

0,7

4,5

6,3

11,3

0,7

и др.). Здесь будут рассмотрены общие цветные реакции для обнаружения

индивидуальных аминокислот и аминокислот, входящих в состав белков,

основанные на химической природе радикалов аминокислот (табл. 1.5).

Для открытия в биообъектах и количественного определения аминокис-

лот успешно применяется реакция их с нингидрином. На I стадии реакции

образуется восстановленный нингидрин за счет окислительного дезами-

нирования аминокислот (параллельно происходит декарбоксилирование

аминокислот):

На II стадии образовавшийся аммиак реагирует с эквимолярными

количествами окисленного и восстановленного нингидрина, образуя сине-

фиолетовый продукт, интенсивность окраски которого (при 570 нм) про-

порциональна количеству аминокислоты:

41

Аминокислота

Окисленный

нингидрин

Восстановленный

нингидрин

+

 СО

2

 +

 NH

3

 +

На основе нингидриновой реакции были разработаны методы количест-

венного определения аминокислот, в частности метод распределительной

хроматографии на бумаге, впервые внедренный в 1944 г. (А. Мартин

и Р. Синдж). Эта же реакция используется благодаря своей высокой

чувствительности в автоматическом анализаторе аминокислот. Впервые

такой прибор сконструировали Д. Шпакман, С. Мур и У. Стейн (рис. 1.7).

После разделения смеси аминокислот в колонках, заполненных специаль-
ными ионообменными смолами (сульфополистирольный катионит), ток

элюента из колонки поступает в смеситель, туда же поступает раствор
нингидрина; интенсивность образующейся окраски автоматически измеря-

ется на фотоэлектроколориметре и регистрируется самописцем. Этот метод

нашел широкое применение в клинической практике при исследовании
крови, мочи, спинномозговой жидкости. С его помощью за 2–3 ч можно

получить полную картину качественного состава аминокислот в биологи-

Т а б л и ц а 1.5. Реакции, используемые для идентификации и полуколичественного

определения аминокислот и белков

42

Реакция

Миллона

Ксантопротеи-

новая

Гопкинса-

Коула

Эрлиха

Сакагучи

Нитропрус-

сидная

Салливена

Паули

Фолина-

Чокалтеу

Реактивы

HgNO

3

 в азотной кислоте в при-

сутствии азотистой кислоты

Кипящая концентрированная

азотная кислота

Глиоксиловая кислота в кон-

центрированной серной кислоте

n-Диметиламинобензальдегид

в концентрированной хлорис-

товодородной кислоте

α-Нафтол и гипохлорит натрия

Нитропруссид натрия в разбав-

ленном растворе аммиака

1,2-Нафтохинон-4-сульфонат

натрия и бисульфит натрия

Диазотированная сульфанило-

вая кислота в щелочном раст-

воре

Фосфомолибденово-вольфра-

мовая кислота

Определяемая

аминокислота

Тирозин

Фенилаланин,

тирозин

Триптофан

Триптофан

Аргинин

Цистеин

Цистеин

Гистидин,

тирозин

Тирозин

Окраска

Красная

Желтая

Сине-фиоле-

товая

Синяя

Красная

Красная

»

»

Синяя

Рис. 1.7. Работа автоматического анализатора аминокислот (принципиальная схема

по Шпакману, Муру и Стейну).

1 - смеситель; 2 - фотоэлектроколориметр; 3 - самописец.

ческих жидкостях и выявить наличие в них необычных азотсодержащих

веществ, что имеет важное диагностическое и прогностическое значение.

Автоматические анализаторы аминокислот все время совершенствуют-

ся, повышаются чувствительность методов и скорость проведения анализа.

Так, в современных приборах высокоэффективной жидкостной хроматогра-

фии (ВЭЖХ) удается проводить анализ гидролизата белка за 45 мин,

определяя при этом концентрацию аминокислот в пикомолях (рис. 1.8).

Смесь аминокислот может быть успешно разделена также методом

электрофореза на бумаге. При рН 6,0 возможно хорошее разделение кислых

и основных аминокислот с нейтральными. В этом случае отрицательно

заряженные (кислые) аминокислоты будут двигаться к аноду, а положитель-

но заряженные – к катоду. Нейтральные аминокислоты остаются на линии

старта.

Для их разделения электрофорез обычно проводят при рН 1,8–2,0, когда

все они мигрируют к аноду с незначительным, но уловимым различием

в подвижности. После электрофореза местоположение аминокислот на

электофореграмме выявляют с помощью химических реакций, а после

элюции окрашенных продуктов определяют их количественно.

Рис. 1.8. ВЭЖХ аминокислот по

Цеху и Вольтеру. Разделение на

колонке (3 х 250 мм), наполнен-

ной ионообменной смолой – поли-

стиролдивинилбензолом. Концент-

рация аминокислот 500 пмоль/л,

реактив для детектирования –

флюорескамин, образующий с

аминогруппой сильно флюоресци-

рующее соединение.

1 - Асп; 2 - Тре; 3 - Сер; 4 - Глу; 5 - Гли;

6 - Ала; 7 - Цис; 8 - Вал; 9 - Мет; 10 -

Иле; 11

 - Лей; 12 - Тир; 13 - Фен; 14 -

Лиз; 15

 - Гис; 16 - Арг.

43

БУФЕР

НИНГИДРИН

КОЛОНК

А

Время, мин

1

100°

2

3

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ

Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков являются

высокая вязкость растворов, незначительная диффузия, способность к набу-

ханию в больших пределах, оптическая активность, подвижность в электри-

ческом поле, низкое осмотическое давление и высокое онкотическое давле-

ние, способность к поглощению УФ-лучей при 280 нм (это свойство,

обусловленное наличием в белках ароматических аминокислот, использует-

ся для количественного определения белков).

Белки, как и аминокислоты, амфотерны благодаря наличию свободных

NH

2

- и СООН-групп. Для них характерны все свойства кислот и оснований.

В зависимости от реакции среды и соотношения кислых и основных

аминокислот белки в растворе несут или отрицательный, или положитель-

ный заряд, перемещаясь к аноду или катоду. Это свойство используется при

очистке белков методом электрофореза.

Белки обладают явно выраженными гидрофильными свойствами. Раст-

воры белков имеют очень низкое осмотическое давление, высокую вязкость

и незначительную способность к диффузии. Белки способны к набуханию

в очень больших пределах. С коллоидным состоянием белков связан ряд

характерных свойств, в частности явление светорассеяния, лежащее в основе

количественного определения белков методом нефелометрии. Этот эффект

используется, кроме того, в современных методах микроскопии биологи-

ческих объектов. Молекулы белка не способны проникать через полупрони-

цаемые искусственные мембраны (целлофан, пергамент, коллодий), а также

биомембраны растительных и животных тканей, хотя при органических

поражениях, например, почек капсула почечного клубочка (Шумлянского-

Боумена) становится проницаемой для альбуминов сыворотки крови и по-

следние появляются в моче.

Молекулярная масса белков

Белки относятся к высокомолекулярным соединениям, в состав которых

входят сотни и даже тысячи аминокислотных остатков, объединенных

в макромолекулярную структуру. Молекулярная масса белков колеблется

от 6000 (нижний предел) до 1000000 и выше в зависимости от количества

отдельных полипептидных цепей в составе единой молекулярной структуры

белка. Такие полипептидные цепи получили название субъединиц. Их мол.

масса варьирует в широких пределах – от 6000 до 100000 и более.

Аминокислотный состав и последовательность аминокислот выяснены

для многих тысяч белков. В связи с этим стало возможным вычисление их

молекулярной массы химическим путем с высокой точностью. Однако для

огромного количества встречающихся в природе белков химическое строе-

ние не выяснено, поэтому основными методами определения молекулярной

массы все еще остаются физико-химические методы (гравиметрические,

осмометрические, вискозиметрические, электрофоретические, оптические и

др.). На практике наиболее часто используются методы седиментационного

анализа, гель-хроматография и гель-электрофорез. Определение молеку-

лярной массы белков методами седиментационного анализа проводят

в ультрацентрифугах *, в которых удается создать центробежные ускорения

* Впервые ультрацентрифуга была сконструирована шведским ученым Т. Сведбергом.

Прибор был снабжен оптической приставкой, способной периодически через равные промежут-

ки времени фотографировать процесс осаждения (седиментации) белковых частиц.

44