Биологическая химия - часть 12

Методы определения N-концевой аминокислоты

Для определения природы N-концевой аминокислоты предложен ряд мето-

дов, в частности метод  С э н д ж е р а (F. Sanger), основанный на реакции

арилирования полипептида 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ), что при-

водит к образованию окрашенного в желтый цвет 2,4-динитрофенильного

производного N-концевой аминокислоты *. Раствор полипептида обраба-

тывают ДНФБ, который взаимодействует со свободной NH

2

-группой

N-концевой аминокислоты пептида.

После кислотного гидролиза продукта реакции – динитрофенилпептида

только одна N-концевая аминокислота оказывается связанной с реактивом

в виде 2,4-динитрофениламинокислоты (стабильной при гидролизе). В отли-

чие от других образовавшихся при гидролизе полипептида свободных

аминокислот она желтого цвета. Ее идентифицируют методом хромато-

графии.

Для определения N-концевой аминокислоты значительно более широко

применяется  ф е н и л т и о г и д а н т о и н о в ы й  м е т о д  Э д м а н а благодаря

своей высокой чувствительности и возможности многократного использо-

вания в одной и той же пробе. Фенилизотиоцианат реагирует со свободной

α-NH

2

-группой N-концевой аминокислоты полипептида с образованием

фенилтиокарбамоилпептида.

* За разработку этого метода Ф. Сэнджер удостоен Нобелевской премии (1958). В 1980 г.

он был удостоен второй раз Нобелевской премии вместе с У. Гилбертом и П. Бергом за

разработку метода определения первичной структуры нуклеиновых кислот.

53

Полипептид (белок)

Гидролиз

+ Свободные аминокислоты

Динитрофениламинокислота

ДНФБ

Н

2

О

Обработка продукта реакции кислотой приводит к циклизации и осво-

бождению фенилтиогидантоина N-концевой аминокислоты, природу кото-

рого устанавливают хроматографически. Укороченный на одну аминокис-

лоту полипептид подвергают дальнейшему анализу.

Эту процедуру ступенчатого расщепления пептида с N-конца можно

повторять многократно, идентифицируя последовательно одну аминокис-

лоту за другой. Метод Эдмана используется в качестве химической основы

для определения первичной структуры белков и пептидов. Он реализован

в специальном приборе – секвенаторе (от англ. sequence – последователь-

ность), работающем в автоматическом режиме и позволяющем определить

последовательность аминокислот с N-конца пептида до 50–60 аминокис-

лотных остатков.

Кроме этих реактивов, для определения чередования аминокислот ис-

пользуют цианат калия, 1-диметиламинонафтил-5-сульфонилхлорид – дан-

силхлорид и дабсилхлорид. Для этих же целей иногда применяют ферменты

экзопептидазы, в частности аланин- и лейцинаминопептидазу. Эти фермен-

ты разрывают пептидные связи с того конца полипептида, где имеется

свободная NН

2

-группа, освобождая N-концевую аминокислоту (механизм

действия экзопептидаз см. в главе 12).

Методы определения С-концевой аминокислоты

Для определения природы С-концевой аминокислоты часто используют

ферментативные методы. Обработка полипептида карбоксипептидазой,

которая разрывает пептидную связь с того конца пептида, где содержится

свободная СООН-группа, приводит к освобождению С-концевой аминокис-

лоты, природа которой может быть идентифицирована методом хромато-

графии.

Предложен также химический  м е т о д  А к а б о р и (S. Akabori), который

основан на гидразинолизе полипептида:

54

Фенилизотиоцианат

Полипептид

Фенилтиогидантоиновое

производное

N-концевой АМК

Полипептид, укороченный

на одну аминокислоту

HCl

Гидразин, вызывая распад чувствительных к нему пептидных связей

полипептида, реагирует со всеми аминокислотами, за исключением С-

концевой аминокислоты, поскольку ее карбоксильная группа не участвует

в образовании пептидной связи. При этом образуется смесь аминоацил-

гидразинов и свободной С-концевой аминокислоты. Последнюю после

обработки всей смеси ДНФБ отделяют и идентифицируют хроматографи-

чески, для чего образовавшиеся динитрофенилпроизводные аминоацил-

гидразинов предварительно экстрагируют уксусно-этиловым эфиром.

С-концевую аминокислоту идентифицируют также путем обработки

полипептида восстанавливающим агентом, например боргидридом натрия.

В простейшей форме эту процедуру можно представить в следующем виде:

Видно, что в указанных условиях только одна, а именно С-концевая,

аминокислота будет превращаться в α-аминоспирт, легко идентифицируе-

мый методом хроматографии. Таким образом, при помощи указанных

методов определяют природу N- и С-концевых аминокислот.

Следующий этап работы связан с определением чередования (последо-

вательности) аминокислот внутри полипептидной цепи. Для этого сначала

проводят избирательный, частичный (химический и ферментативный), гид-

ролиз полипептидной цепи на короткие пептидные фрагменты, последова-

тельность аминокислот в которых может быть точно определена описан-

ными ранее методами.

Химические методы избирательного и неполного гидролиза основаны

на применении таких химических реактивов, которые вызывают селектив-

ный, высокоспецифический разрыв пептидных связей, образованных опре-

деленными аминокислотами, оставляя незатронутыми остальные пептид-

ные связи. К этим избирательно гидролизующим веществам относятся

цианогенбромид, CNBr (по остаткам метионина), гидроксиламин (по свя-

зям между остатками аспарагиновой кислоты и глицина), N-бромсукцина-

55

Аминоацилгидразины

Аланин

Гидразин

NaBH

4

6М НСl, 105°С, 24ч

Свободные аминокислоты

α-Аминоспирт

мид (по остаткам триптофана). Метионина в составе белков содержится

обычно меньше, чем других аминокислот, поэтому обработка CNBr пред-

почтительнее, так как при этом образуется небольшое число пептидов,

первичную структуру которых определяют с помощью рассмотренных

ранее методов, всякий раз начиная с определения природы N- и С-концевых

аминокислот.

Ферментативные методы гидролиза основаны на избирательности дей-

ствия протеолитических (вызывающих распад белков) ферментов, расщеп-

ляющих пептидные связи, образованные определенными аминокислотами.

В частности, пепсин ускоряет гидролиз связей, образованных остатками

фенилаланина, тирозина и глутаминовой кислоты, трипсин – аргинина и ли-

зина, химотрипсин – триптофана, тирозина и фенилаланина. Ряд других

ферментов, например папаин, субтилизин, проназа и другие бактериальные

протеиназы, также используется для неполного гидролиза белков. В резуль-

тате полипептидная цепь расщепляется на мелкие пептиды, содержащие

иногда всего несколько аминокислот, которые отделяют друг от друга

сочетанными электрофоретическими и хроматографическими методами,

получая своеобразные пептидные карты. Далее определяют чередование

аминокислот в каждом индивидуальном пептиде. Завершается работа

воссозданием первичной структуры полной полипептидной цепи на основа-

нии определения последовательности аминокислот в отдельных пептидах.

Метод составления пептидных карт, получивший образное название

«метод отпечатков пальцев», используется при определении сходства или

различия гомологичных белков по первичной структуре. Белок инкубируют

с каким-либо протеолитическим ферментом. Часто порции белка инкубиру-

ют как с пепсином, так и с трипсином. При этом вследствие гидролиза

строго определенных пептидных связей образуется смесь коротких пепти-

дов, легко разделяемых с помощью хроматографии в одном направлении

и электрофореза – в другом, под углом 90° от первого (пептидная карта).

Дальнейшие задачи – установление последовательности расположения

аминокислот в каждом из выделенных пептидов (фенилтиогидантоиновым

или другими методами), сопоставление полученных данных и установление

первичной структуры всей молекулы.

Возможность применения рентгеноструктурного анализа для определе-

ния последовательности аминокислот в белковой молекуле была рассмот-

рена ранее. Следует отметить совершенно новый подход к решению этой

важной проблемы – определение последовательности аминокислот в белко-

вой молекуле с использованием данных о комплементарной нуклеотидной

последовательности ДНК. Этому способствуют как методы быстрого

секвенирования ДНК, так и техника изолирования и доступности самого

гена *.

В настоящее время выяснение первичной структуры белков является

вопросом времени и технического оснащения лабораторий. Полностью

выяснена первичная структура многих природных белков и прежде всего

инсулина, содержащего 51 аминокислотный остаток [Сэнджер Ф., 1954].

Более крупным белком с выясненной первичной структурой оказался

иммуноглобулин, в четырех полипептидных цепях которого насчитывается

1300 аминокислотных остатков. За эту работу Дж. Эдельман и Р. Портер

были удостоены Нобелевской премии (1972).

* Описана первичная структура многих белков и ферментов, в частности репликазы фага

MS2 (544 аминокислотных остатка), установленная этим методическим приемом.

56