Цитогенетика эмбрионального развития - часть 68

Цитогенетика эмбрионального развития человека

526

ной гибридизации зонда с ДНК хромосом, не являющейся мишенью, 

но содержащей ИПП. В качестве конкурентной ДНК можно использо-

вать фрагментированную тотальную геномную ДНК (размер фрагмен-

тов  400–800  п.  н.)  или  ДНК  высокоповторяющейся  фракции  генома 

- Сot1, последнее более эффективно. 

Состав гибридизационного раствора (конечная концентрация форма-

мида 50 %):

10 мкл — общий объем
 

7 мкл — гибридизационный буфер № 2 см. Протокол 5.9

— мкл — ДНК-зонд (50–100 нг) 

— мкл — конкурентная ДНК (1–5 мкг, до 8 мкг) 

— мкл — ДНК-носитель (суммарное количество конкурентной ДНК 

и ДНК-носителя должно составлять 10 мкг) 
— мкл дистиллированной воды до 10 мкл

Примечание

  Общее количество ДНК в гибридизационном растворе не должно 

превышать 30 мкг.

Протокол 5.10

  1. Приготовить  в  эппендорфовской  пробирке  гибридизационный 

раствор*.

  2. Денатурировать пробу, поместив пробирку с гибридизационным 

раствором на кипящую водяную баню на 5–10 мин.

  3. Быстро перенести пробирку в термостат на  + 37 °С и инкубиро-

вать 10–50 мин. Продолжительность инкубации зависит от количества 

ИПП в ДНК-зонде, размера ДНК-мишени (хромосомы или хромосом-

ного участка) и степени гомологии исследуемой ДНК с ДНК других 

участков хромосом. 

  4. Нанести гибридизационный раствор (10 мкл под покровное стек-

ло 22×22 мм), на предварительно нагретые до 37–38 °С препараты, за-

клеить по периметру края покровных стекол резиновым клеем и по-

местить их во влажной камере в термостат.

  5. Инкубировать препараты 12–18 часов (ночь) при  + 37–38 °С.

  *См. примечания к Протоколу 5.9.

527

Приложение

5.4.3. Постгибридизационные отмывки препаратов 

  Постгибридизационные отмывки необходимы для удаления с пре-

паратов молекул ДНК-зонда не специфически связавшихся с хромо-

сомной ДНК. От точности проведения этого этапа во многом зависит 

общий  результат  диагностики,  так  как  неспецифическая  «фоновая» 

гибридизация  затрудняет,  а  иногда  делает  невозможным  корректный 

анализ препаратов после FISH. С целью выявления на хромосомах или 

в интерфазных ядрах последовательностей, гомологичных последова-

тельностям ДНК-зонда, отмывки проводят при той же концентрации 

формамида,  что  и  гибридизацию,  а  температура  на  5 °С  выше,  чем 

гибридизационная. О возможных вариантах и целях отмывок разной 

степени жесткости см. в работах [533, 818]. Ниже мы приводим стан-

дартный Протокол постгибридизационных отмывок. 

Протокол 5.11

  1. Осторожно удалить резиновый клей.

  2. Поместить препараты в стакан с раствором 50 % (55 %) форма-

мид — 2×SSC, pH 7,0, при  + 43 °С. Через 3–5 мин аккуратно удалить 

покровные стекла.

  3. Отмыть  препараты  в  трех  сменах  раствора  формамид  50 % 

(55 %) — 2×SSC pH 7.0 по 5 мин в каждом при  + 43°С. 

  4. Отмыть препараты в трех сменах раствора 2×SSC по 5 мин в каж-

дом, при  + 43 °С. 

  5. Отмыть препараты 5 мин в растворе 0,2×SSC, при  + 43 °С.

Примечания

  1) Для отмывок используется раствор формамида той же концент-

рации, которую применяли для гибридизации. Формамид деионизиро-

вать не обязательно, pH при необходимости подвести до 7,0 концент-

рированной HCl.

  2) Отмывки рекомендуется проводить в стаканах или кюветах для 

проводок на водяной бане-качалке.

5.4.4. Флуоресцентная детекция гибридных молекул

  Гибридные молекулы можно выявлять с помощью различных сис-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

528

тем  иммунохимической  детекции,  используя  флуорохромы-детекто-

ры  разных  цветов,  это  делает  возможным  выявление  одновременно 

нескольких последовательностей ДНК в одной клетке. Ниже мы при-

водим два хорошо зарекомендовавших себя способа детекции гибри-

дизационных  сигналов.  Первый  —  «одноцветный»  (Протокол  5.12) 

используется  для  детекции  гибридных  молекул  после  гибридизации 

in  situ,  проведенной  с  ДНК-зондом,  меченным  биотином,  второй  — 

«двухцветный»  (Протокол  5.13)  для  детекции  продуктов  гибридиза-

ции, проведенной одновременно с двумя ДНК-зондами (детекция био-

тина и дегоксигенина).

Растворы

  1. Раствор 4×SSC, pH 7,0 — к 200 мл раствора 20×SSC добавить 

800 мл дистиллированной воды.

  2. Раствор для отмывок — 4×SSC, 0,2 %-й Tween-20.

  3. Блокирующий раствор — 1%-й блокирующий реагент (Boehringer 

Mannheim), 4×SSC, 0,1%-й Tween-20. Блокирующий реагент можно за-

менить БСА (3 %) или обезжиренным сухим молоком (5 %).

  4. Раствор для детекции — 1 %-й блокирующий реагент (Boehringer  

Mannheim)  4×SSC,  0,1%-й  Tween-20.  Блокирующий  реагент  мож-

но  заменить  БСА  (1 %)  или  обезжиренным  сухим  молоком  (5 %),  

содержащий  соответствующий  конъюгат-детектор.  Раствор  пригото-

вить  в  эппендорфовской  пробирке  за  20–30  мин.  до  использования, 

хорошо перемешать и оставить до момента нанесения при комнатной 

температуре в темноте, перед нанесением раствор еще раз перемешать 

и быстро осадить центрифугированием.

Протокол 5.12 

  1. Препараты из раствора 0,2×SSC, стряхнув с них жидкость, по-

местить на нагревательный столик.

  2. Нанести  на  препараты  по  150  мкл  блокирующего  раствора  и  на-

крыть покровными стеклами 24×50 мм (при использовании стекол друго-

го размера соответственно изменить объем наносимого раствора).

  3. Инкубировать препараты 20–30 мин во влажной камере в термо-

стате при  + 37 °С.

  4. Осторожно (стряхиванием) удалить покровные стекла.

  5. Влажные  препараты  немедленно  поместить  в  прогретую 

529

Приложение

до  + 37 °С влажную камеру или на нагретый до этой же температуры 

нагревательный столик и нанести на них по 80–100 мкл раствора для 

детекции, содержащего конъюгат авидин-FITC в концентрации 5 мкг/

мл, сверху накрыть покровными стеклами 24×50 мм. Препараты инку-

бировать 30–40 мин во влажной камере в термостате при  + 37 °С.

  6. Осторожно удалить покровные стекла, отмыть препараты в трех 

сменах раствора для отмывок по 5 мин в каждой смене, при  + 43 °С, 

при покачивании. 

  7.

 

Быстро перенести препараты во влажную камеру или на нагрева-

тельный столик и нанести на них 80–100 мкл раствора для детекции, 

содержащего  биотинилированный  антиавидин  D  в  концентрации  5 

мкг/мл, накрыть покровными стеклами 24×50 мм. Препараты инкуби-

ровать 30–40 мин во влажной камере в термостате при  + 37 °С.

  8. Повторить п. 6 данного Протокола.

  9. Повторить п. 5 данного Протокола. Продолжительность инкуба-

ции можно уменьшить до 20–25 мин.

  10. Повторить п. 6 данного Протокола.

  11. Сполоснуть препараты в стакане с 14×SSC, 0,1%-й Tween-20PBS, 

а  затем  в  стакане  с  дистиллированной  водой.  Можно  использовать 

только дистиллированную воду — две смены.

  12. Дегидратировать препараты в серии спиртов (70 %, 80 %, 96 % 

этанол) по 5 мин в каждом.

  13. Высушить препараты на воздухе.

 

Примечания

  1. Все процедуры отмывок препаратов рекомендуется проводить в 

стаканах или кюветах для проводок на водяной бане-качалке.

  2. При проведении всех этапов детекции поверхность препаратов 

не должна подсыхать. 

  3. Этапы Протокола, начиная с п. 5, рекомендуется проводить в за-

темненном помещении. Категорически недопустима работа в ярко ос-

вещенном помещении.

  4. Если нет необходимости в усилении гибридизационных сигналов 

(например, при использовании в качестве зонда сателлитных последо-

вательностей  ДНК),  этапы  иммунохимической  амплификации  флуо-

ресцентных сигналов (пп. 7–9), можно исключить. После п. 6 перейти 

к выполнению пп. 11–13. 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

530

Протокол 5.13

  1–6. См. п. 1–6 Протокола 5.12.

  7. Быстро  перенести  препараты  из  последней  смены  отмывок  во 

влажную камеру или на нагревательный столик, и нанести на них по 

80–100 мкл раствора для детекции, содержащего биотинилированный 

антиавидин D в концентрации 5 мкг/мл и мышиные моноклональные 

антитела к дигоксигенину в разведении, рекомендуемом фирмой-изго-

товителем, накрыть покровными стеклами 24×50 мм. Препараты инку-

бировать 30–40 мин во влажной камере при  + 37 °С.

  8. См. п. 6 Протокола 5.12.

  9. Не давая препаратам полностью высохнуть, нанести по 80–100 

мкл раствора для детекции, содержащего конъюгат авидин-FITC в кон-

центрации 5 мкг/мл и кроличьи антитела к IgG мыши, конъюгирован-

ные  с  TRITC,  в  разведении,  рекомендуемом  фирмой-изготовителем, 

накрыть покровными стеклами 24×50 мм. Препараты инкубировать 30 

мин во влажной камере при  + 37 °С.

10. См. п. 6 Протокола 5.12.

11. На влажные препараты нанести по 80–100 мкл раствора для де-

текции, содержащего козьи антитела к IgG кролика, конъюгированные 

с TRITC, в концентрации, рекомендуемой фирмой-изготовителем. На-

крыть  покровными  стеклами  24×50  мм,  инкубировать  20–30  мин  во 

влажной камере при  + 37 °С.

12. См. п. 7 Протокола 5.12.

13–15. См. пп. 11–13 Протокола 5.12.

Примечание

Условия проведения процедуры см. в Протоколе 5.12.

5.4.4.1. Окраска и заключение препаратов

После  детекции  гибридных  молекул  препараты  окрашивают  флуо-

ресцентными красителями и заключают в фотозащитный раствор. Пер-

вая процедура позволяет наблюдать флуоресцентные сигналы непосред-

ственно на окрашенных хромосомах, интерфазных ядрах, клетках и т. д., 

что облегчает анализ полученных результатов. Вторая — защищает флу-

орохромы от выгорания. Окраска и заключение могут быть проведены 

раздельно или одновременно. В последнем случае краситель добавляют в 

531

Приложение

фотозащитный раствор. Нам кажется более удобным второй способ, один 

из вариантов которого мы приводим ниже. 

Если для детекции гибридных молекул использовали FITC, в фо-

тозащитный раствор добавляют растворы пропидиум йодида и DAPI. 

Если проводили «двухцветную» детекцию, используя FITC и TRITC, в 

фотозащитный раствор следует добавить только раствор DAPI.

Растворы

1. Фотозащитный заключающий раствор:

к  0,23  г  1,4-диазобицикло-(2,2,2)-октана  (DABCO)  добавить 

 

●

1мл 0,2 M Tris-HCl, pH 7,5 и перемешать покачиванием или пи-

петированием;

добавить 9 мл 95–99%-го глицерина;

 

●

растворить смесь при  + 70

 

●

 °С (на шейкере или пипетировани-

ем); когда раствор станет гомогенным, оставить его на несколь-

ко часов или на ночь при комнатной температуре;

подогреть раствор до  + 40

 

●

 °С и профильтровать через фильтр с 

диаметром пор 45 мкм;

расфасовать раствор по 1–2 мл и хранить при –20

 

●

 °С.

2. Раствор DAPI. 

Маточный  раствор:  1  мг/мл  на  дистиллированной  воде,  хранить 

при –20°С.

3. Раствор пропидиум йодида. 

Маточный  раствор:  1  мг/мл  на  дистиллированной  воде,  хранить 

при –20 °С.

4. Фотозащитный заключающий раствор, содержащий DAPI: (0,5–

1 мкг/мл в заключающем растворе):

0,5–1 мкл маточного раствора красителя осторожно нанести на 

 

●

стенку эппендорфа с 1 мл заключающего раствора; быстро оса-

дить центрифугированием; 

осторожно 5–6 раз перемешать пипетированием и быстро оса-

 

●

дить центрифугированием;

раствор хранить при –20 °С до полугода;

 

●

перед нанесением на препарат выдержать раствор 20–30 мин в 

 

●

темном месте, при  + 37 °С.

5. Фотозащитный заключающий раствор, содержащий пропидиум 

йодид: 0,5–1 мкг/мл в заключающем растворе; приготовление см. Фо-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

532

тозащитный заключающий раствор, содержащий DAPI. 

6. Фотозащитный заключающий раствор, содержащий пропидиум 

йодид и DAPI: добавлять оба красителя в заключающий раствор одно-

временно в указанных выше концентрациях; приготовление см. Фото-

защитный заключающий раствор, содержащий DAPI.

 Протокол 5.14

1. Нанести на препараты по 40–45 мкл заключающего раствора, со-

держащего флуоресцентный краситель (красители), накрыть покровны-

ми стеклами размером 24×50 или 24×60 мм (при использовании стекол 

другого размера соответственно изменить объем наносимого раствора).

2. Окрашивать  препараты  20–30  мин  при  комнатной  температуре 

или ночь в холодильнике при  + 4 °С.

Примечание

Заключение проводить сразу после завершения процедуры флуорес-

центной детекции, когда препараты высохнут, см. Протокол 5.12, 5.13

5.4.4.2. Микроскопия

Анализ препаратов после FISH проводят с помощью флуоресцент-

ного микроскопа, оснащенного набором соответствующих светофиль-

тров. В таблице приведены возможные варианты наборов одиночных, 

двойных и тройных светофильтров, которые можно использовать для 

визуализации флуорохромов, описанных в данном разделе. 

 

Флуорохром 

Цвет 

флуорохрома

Возбуждающий 

фильтр

Светоделительная 

пластинка

Запирающий 

фильтр

DAPI 

голубой 

365

395

397

Пропидиум йодид темно-красный 

546

580

590

Пропидиум йодид ярко-красный

460–490 

510

520

FITC

желто-зеленый

460–490

510

520

TRITC

розовый

460–490

510

520

TRITC

красный

546

580

590

FITC/TRITC

желто-зеленый/

розовый

485 и 546

440/505

515–530 и

580–630

DAPI/ FITC/TRITC зеленый/

желтый/

малиновый

400/495/570

 410/505/585

460/530/610

533

Приложение

5.4.5. Хранение препаратов после FISH

Заключенные в фотозащитный раствор препараты следует хранить 

при  + 4 °С в закрытой коробке. При правильном проведении всех эта-

пов FISH проанализированные препараты могут храниться 2–3 года и 

более. При необходимости, если морфология хромосом (интерфазных 

ядер, клеток) сохранилась, а флуоресцентные сигналы стали слабыми, 

можно  аккуратно  бритвой  или  скальпелем  снять  покровные  стекла, 

отмыть препараты в нескольких сменах дистиллированной воды, де-

гидратировать в серии спиртов и усилить гибридизационные сигналы 

(пп. 5–12 Протокола 5.12), а затем заключить препараты как описано 

в Протоколе 5.14. 

6. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО  

СОСТОЯНИЯ ХРОМОСОМНЫХ РАЙОНОВ 

6.1. Ag-окраска активных ядрышкообразующих районов 

хромосом

Для  специфического  выявления  активных  районов  ядрыш-

ковых  организаторов  (ЯОР),  локализованных  в  коротких  плечах 

акроцентриче ских  хромосом  человека,  используют  метод  окраски 

нитратом  серебра  с  желатиной.  Интенсивно  окрашиваются  в  чер-

ный цвет лишь те ЯОР, которые были активны в предшествующей 

интерфазе.  Неактивные  ЯОР  при  этом  способе  не  детектируются. 

Благодаря ярко выраженному полиморфизму, ЯОР могут быть ис-

пользованы для характеристики индивида и для установления ро-

дительского  происхождения  дополнительных  акроцентрических 

хромосом при гетероплоидии.

Растворы

1. 50%-й  раствор  азотнокислого  серебра  на  деионизированной 

(можно на бидистиллированной) воде.

2. 2%-й раствор желатина на дистиллированной воде.

3. Муравьиная кислота.

4. 5%-й раствор гипосульфита натрия.