Цитогенетика эмбрионального развития - часть 66

Цитогенетика эмбрионального развития человека

510

Техника окрашивания 

  1–2. См. Протокол 4.5.

  3.  Смыть  покровные  стекла,  поместить  препараты  в  стакан  с 

2×SSC.

  4. Инкубировать в течение 1 часа при 60 °С в 2×SSC.

  5. Промыть препараты дистиллированной водой и высушить.

  6. Заключить препараты под покровные стекла в раствор красите-

лей (см. Протокол 5.14).

  7. Анализировать препараты на люминесцентном микроскопе (см. 

таблицу в разделе «Гибридизация in situ»).

Протокол 4.8 (иммуноцитохимическая детекция включения БДУ)

  1. Препараты метафазных хромосом после инкубирования в при-

сутствии БДУ, денатурировать в 2 М HCl в течение 10–20 минут при 

комнатной  температуре,  после  чего  провести  через  серию  ледяных 

спиртов 70°, 80° и 96°. 

  2.  Инкубировать  препараты  в  двух  сменах  фосфатного  буфера 

(1×PBS, рН 7,2) по 10 минут в каждом при комнатной температуре. 

  3.  Нанести  на  препараты  по  150  мкл  блокирующего  раствора 

(Boehringer Mannhiem) на 1×PBS, накрыть покровным стеклом и ин-

кубировать 30 минут во влажной камере при температуре  + 37 °С.

  4. На влажные препараты под покровные стекла нанести по 80–100 

мкл блокирующего раствора (Boehringer Mannheim) на 1×PBS, содер-

жащего антитела к БДУ (mouse AT-BudR 0,5 мкг/мл). Препараты инку-

бировать 80 минут во влажной камере при температуре  + 37 °С. 

  5. Отмыть препараты в трех сменах фосфатного буфера 1×PBS (pH 

7,2), содержащего 0,5 % Tween 20, по 5 минут в каждой, на водяной 

бане при температуре  + 43 °С.

  6. На влажные препараты под покровные стекла нанести по 100 мкл 

блокирующего раствора (Boehringer Mannheim) на 1×PBS, содержаще-

го антитела, конъюгированные с FITC (goat-anti-mouse-FITC), в кон-

центрации, рекомендуемой фирмой-изготовителем (Sigma) (0,2 мкг/мл), и 

инкубировать 60 минут во влажной камере при  + 37 °С.

  7. Препараты отмывать в трех сменах фосфатного буфера 1×PBS 

(pH 7.2), содержащем 0,5 % Tween 20, по 5 минут в каждой, на водяной 

511

Приложение

бане  при  температуре   + 43°С,  ополоснуть  дистиллированной  водой, 

дегидратировать в серии спиртов (70°, 80°, 96°) и высушить на возду-

хе.

  8. Окраска и заключение препаратов (условия проведения процеду-

ры и растворы см. Протокол 5.14). 

4.2. Метод выявления ломкой Х-хромосомы

  В настоящее время цитогенетические исследования утратили свое 

значение как единственно возможного метода лабораторной диагнос-

тики синдрома Мартина–Белла. Тем не менее, цитогенетический ана-

лиз  наряду  с  методами  молекулярной  генетики  и  иммуноцитохимии 

может  быть  частью  комплексной  диагностики.  Предлагаемый  нами 

вариант приготовления препаратов для регистрации ломкой Х-хромо-

сомы, основанный на использовании так называемого «тимидинового 

шока», вполне эффективен и доступен для большинства цитогенети-

ческих лабораторий.

Растворы

  1. Культуральная смесь: 4,9 мл среды RPMI 1640 с глутамином, 0,1 мл  

эмбриональной телячьей сыворотки, 0,3–0,4 мл цельной гепаринизи-

рованной крови.

  2. Раствор тимидина: на 4 культуральных флакона 6 мг тимидина 

развести в 200 мкл дистиллированной воды (из расчета 1,5 мг на пробу, 

конечная концентрация 0,3 мг/мл).

Протокол 4.9

  1. Культивирование лимфоцитов проводить по стандартному полу-

микрометоду (см. выше). Рекомендуется ставить не менее 4 проб. 

  2. Общее время культивирования при 37 °С составляет 96 часов (4 

суток).

  3. Через 72 часа от начала культивирования в каждую пробу ввести 50 

мкл раствора тимидина.

  4.  Дальнейшие  этапы  (гипотоническую  обработку,  фиксацию  и 

приготовление препаратов) проводить стандартным способом.

  5. Окрашивать препараты рутинным или R-методом.

  6.  Анализировать  по  25–30  метафазных  пластинок  из  каждой 

пробы.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

512

Примечание

  Маркирование прицентромерного района Х-хромосомы с исполь-

зованием  метода  FISH  существенно  облегчает  регистрацию  ломкого 

сайта, так как ограничивает наблюдения анализом Х-хромосом.

5. ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ IN SITU (FISH)

  Метод гибридизации in situ основан на способности хромосомной 

ДНК образовывать устойчивые гибридные молекулы с ДНК(РНК)-

зондами непосредственно на препаратах фиксированных хромосом 

и  интерфазных  ядер.  С  помощью  этого  метода  можно  определить 

точное  местоположение  практически  любой  последовательности 

ДНК  или  РНК  непосредственно  в  клетке,  клеточном  ядре  или  на 

хромосомах.

  Использование метода FISH в цитогенетической диагностике поз-

воляет идентифицировать структурные хромосомные перестройки, ус-

танавливать природу маркерных хромосом, проводить анализ числен-

ных нарушений хромосомного набора как на метафазных хромосомах, 

так и в интерфазных ядрах. Комбинация различно модифицированных 

проб, выявляемых с помощью разных систем детекции, позволяет од-

новременно определять местоположение двух и более последователь-

ностей ДНК в одном интерфазном ядре или на одной метафазной плас-

тинке.

  В настоящее время для удобства исследователей разработаны ком-

мерческие наборы зондов и реактивов для FISH, которые используют-

ся при диагностике наиболее частых численных и структурных абер-

раций хромосом. 

  Согласно классической схеме проведения неизотопной гибридиза-

ции ДНК–ДНК in situ методики FISH включают приготовление ДНК-

зондов,  предгибридизационную  обработку  препаратов,  проведение 

реакции  гибридизации,  постгибридизационные  отмывки,  детекцию 

гибридных молекул, окраску и заключение препаратов. 

5.1. ДНК-зонды

  Основные  требования,  предъявляемые  к  ДНК-зондам  для  FISH, 

следующие:  высокая  степень  очистки,  эффективность  включения 

модифицированных  нуклеотидов  от  50 %  и  выше,  размер  меченых 

фрагментов  от  150  до  700  п.  н.  Вышеперечисленные  показатели  су-

513

Приложение

щественно  влияют  на  эффективность  гибридизации  и  на  отношение 

сигнал: фон. 

Ниже мы приводим хорошо зарекомендовавший себя способ проведения 

реакции ник-трансляции, а также простые способы оптимизации разме-

ров меченых фрагментов и оценки эффективности мечения зонда.

5.1.1. Мечение ДНК-зондов методом ник-трансляции

Маточные растворы

  1. 1 М трис. Растворить 121,1 г триса в 800 мл H

2

O. Довести pH до 

необходимого значения добавлением концентрированной HCl. Довес-

ти объем раствора до 1000 мл.

  2. 1 М MgCl

2

. Растворить 203,3 г MgCl

2 

× 

6H

2

O в 800 мл. H

2

O. До-

вести объем до 1 л. Разлить на порции и простерилизовать автоклави-

рованием.

  3. 1 М дитиотрейтол (ДТТ). Растворить 3,09 г ДТТ в 20 мл 0,01 М 

ацетата натрия, pH 5,2. Простерилизовать фильтрованием, разлить на 

порции по 1 мл и хранить при –20 °С.

  4. β-меркаптоэтанол. Обычно выпускается в виде 14,4 М раство-

ра. Хранить в темной бутыли при  + 4 °С.

  5. 3  М-ацетат  натрия.  Растворить  408,1  г  ацетата  натрия  ×  3  H

2

O  

в 800 мл H

2

O. Довести pH до 5,2 ледяной уксусной кислотой. Довести 

объем до 1 л. Разлить на порции и простерилизовать автоклавирова-

нием.

  6. 0,5 М ЭДТА. Добавить 186,1 г динатриевой соли ЭДТА × 2 H

2

O  

к 800 мл H

2

O. Интенсивно размешать на магнитной мешалке. Довести 

pH до 8,0 с помощью NaOH (~ 20 г NaOH). Довести объем раствора до 

1000 мл. Разлить на порции и простерилизовать автоклавированием.

Состав реакционной смеси 

• 

5 мкл 10 × буфера для ник-трансляции (0,5 М Tris-HCl, pH 7,8; 50 мM 

MgCl

2

; 0,5мг/мл бычий сывороточный альбумин (БСА);

• 

5 мкл 0,1 М дитиотрейтола (ДТТ);

• 

5 мкл 0,1 М β-меркаптоэтанола; 

• 

4 мкл смеси нуклеотидов (0,5 мМ дATФ; 0,5 мМ дГTФ; 0,5 мМ дЦTФ; 

0,1 мМ дTTФ); 

• 

2 мкл 1мМ био-11-дУТФ (или диг-11-дУТФ, флуоресцин-12-дУТФ 

и др.);

Цитогенетика эмбрионального развития человека

514

•мкл (1мкг) ДНК-пробы; 

•мкл (10 ед.) ДНК-полимеразы I E.Coli;

•мкл (оптимальное количество мкл (см. Протокол 5.2) рабочего рас-

твора ДНКазы I*;

•мкл бидистиллированная вода до конечного объема 50 мкл.

  * Маточный раствор ДНКазы I: 1 мг ДНКазы I растворить в 1 мл буфе-

ра — 0,15 М NaCl и 50 % глицерин, хранить раствор при –20 °С.

Рабочий раствор ДНКазы I: готовится разведением маточного в 1000 раз: 

непосредственно перед использованием 1 мкл маточного раствора доба-

вить к 1 мл холодной ( + 4 °C) бидистиллированной воды и перемешать.

Протокол 5.1

  1. Приготовить реакционную смесь в эппендорфовской пробирке 

на льду, ферменты добавлять в последнюю очередь. 

  2. Смесь перемешать встряхиванием пробирки и быстро осадить 

центрифугированием.

  3. Реакционную смесь инкубировать на водяной бане при  + 15 °С в 

течение двух часов или при  + 10 °C четыре часа.

  4. Остановить реакцию добавлением 5 мкл 0,5 M ЭДТА, рН 8,0. Вы-

полнение этого пункта не обязательно в том случае, если за п. 3 будет 

без перерыва следовать п. 5. 

  5. Добавить к реакционной смеси раствор ДНК-носителя (50 мкг)*, 

затем добавить 1/10 объема 3 М ацетата натрия, рН 5,5 и 3–5 объемов 

охлажденного до –20 °С 96%-го этанола.

  6. Выдержать смесь в течение не менее 30 мин при – 70 °С или 3 

часов при – 20 °С. При – 20 °С смесь можно оставить на ночь или более 

длительный срок. 

  7. Осадить ДНК центрифугированием при 15 тыс. об/мин в течение 

15–20 мин (лучше использовать центрифугу с охлаждением,  + 4 °С). 

  8. Осторожно удалить надосадочную жидкость пипеткой. 

  9. Добавить к осадку 300–400 мкл охлажденного до – 20 °С 70%-го 

этанола, слегка покачать пробирку несколько раз, не переворачивая, и 

повторно центрифугировать при 15 тыс. об/мин в течение 10 мин.

  10. Удалить надосадочную жидкость пипеткой и высушить осадок 

при  + 37 °С. Сухой осадок становится прозрачным.

  11. Растворить ДНК в 40 мкл бидистиллированной воды. Конечная 

концентрация полученной меченной ДНК составляет 20–25 нг/мкл. 

515

Приложение

  12.  Приготовленный  раствор  меченой  ДНК  можно  хранить  при 

– 20 °С в течение нескольких месяцев.

  * В качестве ДНК-носителя рекомендуется использовать фрагменти-

рованную ДНК спермы лосося (размер фрагментов от 400 до 1000 п.н.).

5.1.2. Оптимизация размеров меченых фрагментов

Протокол 5.2

  1.  Приготовить реакционные смеси для ник-трансляции (см. п. 1–2 

Протокола 5.1), добавив в них разный объем рабочего раствора ДНКа-

зы1 — 1; 2,5; 5 и 10 мкл.

  2. Провести реакцию как описано в п. 3 Протокола 5.1.

  3. Отобрать из каждой пробирки аликвоту 10 мкл (200 нг) в новые 

пробирки, а пробирки, в которых проводилась реакция на время тести-

рования убрать в холодильник — температура не выше  + 4 °С.

  4. Денатурировать ДНК, поместив пробирки в кипящую водяную 

баню на 5 мин.

  5. Сразу перенести пробирки в лед. Через 2–3 мин добавить в них 

1/10 объема раствора, содержащего: 25 % фиколл, 0,25 % ксиленциа-

нол, 0,25 % бромфеноловый синий.

  6. Быстро нанести образцы на 2%-й агарозный гель вместе с мар-

керами размера ДНК (размеры от 50 до 2000 нуклеотидов) и провести 

электрофорез, пока бромфеноловый синий не пройдет 2/3 геля. Элект-

рофорез во избежание ренатурации молекул ДНК проводить при напря-

жении 40–60 В и силе тока 25–30 мА, желательно в холодном месте.

  7. Окрасить гель водным раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл) 

и проанализировать в проходящем УФ-свете. Сравнить размеры ДНК 

образцов  и  ДНК  маркера.  Оптимальный  размер  зондов  составляет 

150–700 нуклеотидов. 

  8.  Завершить  мечение  ДНК-зондов  в  пробирках  с  оптимальным 

размером фрагментов (см. п. 5–12 Протокола 5.1). 

5.1.3. Оценка эффективности мечения ДНК-зонда

Растворы

  1) Раствор 20×SSC, pH 7,0 — 3 M NaCl, 0,3 M цитрат Na.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

516

  2) Раствор 4×SSC, pH 7,0 — к 200 мл раствора 20×SSC добавить 

800 мл дистиллированной воды.

  3) Раствор для отмывок — 4×SSC, 0,2%-й Tween-20.

  4) Блокирующий раствор — 1 % блокирующий реагент (Boe hringer 

Mannheim), 4×SSC, 0,2%-й Tween-20. Блокирующий реагент можно за-

менить БСА (3 %) или обезжиренным сухим молоком (5 %).

  5)  Инкубационный  раствор  —  1%-й  блокирующий  реагент  (Boe-

hringer  Mannheim),  4×SSC,  0,1%-й  Tween-20.  Блокирующий  реагент 

можно заменить БСА (1 %) или обезжиренным сухим молоком (5 %), 

содержащий  конъюгат  стрептавидин  (авидин)-щелочная  фосфатаза  

в разведении, рекомендуемом фирмой-изготовителем.

  6) Раствор для щелочной фосфатазы — 0,1 M Tris-HCl, pH 9,5; 0,1 

M NaCl; 10 мM MgCl

2

.

  7) Раствор для детекции — раствор для щелочной фосфатазы, со-

держащий субстраты NBT и BCIP. К 10 мл буфера для щелочной фос-

фатазы добавить 45 мкл маточного раствора NBT и 35 мкл маточного 

раствора BCIP.

  8)  Маточный  раствор  NBT  (нитротетразолий  синий)  —  75  мг/мл  

в диметилформамиде.

  9) Маточный раствор BCIP (5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат) —  

50  мг/мл  в  50%-м  диметилформамиде  (при  использовании  калиевой 

соли BCIP) или воде (при использовании натриевой соли BCIP). 

Протокол 5.3

  1. Приготовить в лунках иммунологического планшета или на па-

рафильме  серию  разведений  ДНК-зонда  от  1  нг/мкл  до  0,1  пг/мкл. 

Для этого нанести в лунки иммунологического планшета или на па-

рафильм по 9 мкл, для первого разведения 9,5 мкл, дистиллированной 

воды; добавить к первой капле 0,5 мкл раствора меченого зонда (см.

п. 11, Протокол 5.1), аккуратно перемешать пипетированием; затем из 

первой капли перенести 1 мкл во вторую каплю и т. д.

  2. По 1 мкл из каждого разведения нанести на нейлоновую мембра-

ну и высушить.

3. Облучить мембрану на УФ-трансиллюминаторе в течение 2–3 мин. 

  4. Поместить мембрану в пластиковую кювету или чашку Петри и 

залить блокирующим раствором, инкубировать 15 мин при 37 °С.

  5. Раствор осторожно слить и залить в кювету инкубационный рас-

517

Приложение

твор.  Инкубировать  30  мин  при  37 °С  или  согласно  рекомендациям 

производителя.

  6. Инкубационный раствор слить и отмыть фильтр при покачива-

нии кюветы в трех сменах раствора для отмывок, по 5 мин в каждой, 

температура отмывок на 2 °С выше инкубационной.

  7. Инкубировать фильтр 5 мин при комнатной температуре в рас-

творе для щелочной фосфатазы.

  8.  Раствор  слить  и  инкубировать  фильтр  в  растворе  для  детекции,  

в темноте при комнатной температуре, до появления четкого синего окра-

шивания точек. Время окрашивания варьирует от 15 минут до 3 часов.

  9. Промыть фильтр в дистиллированной воде и высушить.

  10. ДНК-зонд рекомендуется использовать для гибридизации, если  

1 пг его определяется данным тестом, однако в случае высокоповторя-

ющихся последовательностей ДНК (сателлитные и альфоидные повто-

ры) выявление 5 пг зонда можно считать достаточным. 

5.2. Приготовление препаратов хромосом и интерфазных ядер

  Для проведения гибридизации in situ пригодны цитологические или 

гистологические препараты клеток любых тканей или органов, приго-

товленные по стандартным методикам. В условиях клинической цито-

генетической  лаборатории  используют  препараты  культивированных 

лимфоцитов  периферической  крови,  клеток  цитотрофобласта  хорио-

нального эпителия, культивированных и некультивированных клеток 

амниотической жидкости, различных тканей из абортного материала, 

а также мазков клеток буккального эпителия и крови. 

  Приготовление препаратов хромосом и интерфазных ядер из куль-

тивированных лимфоцитов и др. клеток, а также прямых препаратов 

хромосом и интерфазных ядер из различных тканей описано выше.

В данном разделе мы приводим методики приготовления препаратов 

из других типов клеток.

Протокол 5.4 (приготовление мазков буккального эпителия)

  1. На чистом, обезжиренном стекле приготовить мазок из соскоба 

клеток буккального эпителия, равномерно распределив материал шпа-

телем по стеклу. 

  2. Высушить препарат на воздухе.