Цитогенетика эмбрионального развития - часть 64

Цитогенетика эмбрионального развития человека

494

4. В чистый пенициллиновый флакон налить 3–4 мл свежего фик-

сатора, поместить в него ворсинку (2–3 мг) и добавить равный объем 

дистиллированной воды. 

5. Через 2–5 мин, когда ворсина опустится на дно, вынуть ее пин-

цетом, обсушить фильтровальной бумагой и перенести на чистое обез-

жиренное  предметное  стекло,  подогретое  над  пламенем  спиртовки 

примерно до  + 45–50 °С, в каплю (0,3–0,5 мл) 60%-й уксусной кисло-

ты. Мацерацию проводить под контролем бинокулярной лупы МБС-2, 

наблюдая за выходом клеток в проходящем свете затемненного поля и 

передвигая ворсину по стеклу препаровальной иглой. 

6. Через  2–3  мин  ворсину  перенести  на  следующее  предметное 

стекло  в  каплю  уксусной  кислоты,  а  полученную  на  первом  стекле 

суспензию клеток покачиванием стекла распределить по поверхности. 

Избыток суспензии перенести на следующий препарат.

7. На препарат нанести 2–3 капли фиксатора и высушить над пла-

менем  спиртовки  или  поджиганием  фиксатора.  Аналогично  готовят 

следующие препараты.

Примечания

1) Митотический индекс не зависит от морфологии ворсины, поэ-

тому не следует пренебрегать ворсинами, не имеющими выраженной 

васкуляризации.

2) Качество метафазных хромосом существенно зависит от гипото-

нической обработки, поэтому необходимо заблаговременно апробиро-

вать каждую новую партию цитрата натрия. 

3) Гипотонический раствор, как и 60%-й раствор уксусной кислоты 

следует готовить в день использования.

4) Препараты следует готовить непосредственно в день забора ма-

териала, при увеличении срока хранения фиксированного материала 

значительно ухудшается их качество.

5) Из образца весом до 5 мг делать не более двух препаратов.

Протокол 1.5 (метод «стряхивания — отпечатывания» [184])

Пп. 1–5 см. Протокол 1.4. 

6. Несколько раз приподнять мацерированную ворсинку в капле раз-

мягчающей  смеси,  т.  е.  провести  «стряхивание»  клеток  и  сделать  этой 

ворсинкой серию отпечатков на стекле. Перенести ворсинку на следую-

495

Приложение

щее предметное стекло в каплю уксусной кислоты и повторить манипу-

ляции.

7. См. п.7 Протокола 1.4.

1.4.2. Кратковременное культивирование («полупрямой» метод)

Протокол 1.6 

1. Биоптаты поместить в пенициллиновые флаконы с 5 мл культу-

ральной среды и инкубировать 1–2 или 24 часа в термостате с 5 % СО

2

 

или в замкнутой системе при  + 37 °С. В случае 24-часовой инкубации в 

среду добавить 0,5–1 мл эмбриональной телячьей сыворотки. 

2. За 30–50 мин до фиксации ввести колхицин в конечной концент-

рации 0,5–1 мкг/мл.

3. Заменить культуральную среду на 5 мл 0,9%-го цитрата натрия и 

проводить гипотоническую обработку в течение 15 — 20 мин.

4. Остальные этапы соответствуют пп. 2–6 Протокола 1.4.

Примечания

1) Удается повысить митотический индекс, поместив ворсины хо-

риона в культуральной среде на 6–12 часов в холодильник ( + 4 °С), а 

затем перенести в термостат ( + 37 °С).

2)  Нецелесообразно  инкубировать  мелкие  фрагменты  ворсинок. 

Образец для культивирования должен быть не менее 8–10 мг.

3)  Инкубирование  не  улучшает  качество  метафазных  хромосом 

для традиционных методов дифференциальной окраски. Целесообраз-

но использовать этот метод для получения репликационного рисунка 

дифференциальной окраски.

1.5. Приготовление препаратов хромосом из различных 

эмбриональных органов

 

Анализ  хромосомного  набора  в  клетках  различных  тканей  и  ор-

ганов зародыша человека необходим как для верификации диагноза, 

установленного при исследовании клеток хориона, так и для сопостав-

ления хромосомного набора собственно эмбриона и его провизорных 

органов.  Обычно  для  подобных  исследований  используют  культуры 

эмбриональных фибробластов. Предлагаемые нами методы основаны 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

496

на изучении спонтанных митозов в различных тканях плода, получен-

ных из абортного материала, и позволяют получить результат в тече-

ние 1–2 дней [16].

Получение материала 

Непосредственно  в  операционной  произвести  отбор  материа-

ла — цело го эмбриона или его фрагментов, отмыть от крови гепари-

низированной средой Игла (Хенкса) или физиологическим раствором 

и  доставить  в  лабораторию.  Если  операционный  блок  расположен  в 

непосредственной  близости,  возможна  доставка  всего  полученного 

материала в кювете и отбор частей зародыша в лаборатории.

1.5.1. Приготовление препаратов из фрагментов тканей эмбрионов

Протокол 1.7

1. Тонкий кишечник и пищевод разрезать на кусочки длиной 2–3 

мм, остальные органы (желудок, легкие, почки, костный и продолгова-

тый мозг, мозговые пузыри, роговицу глаза) измельчить ножницами.

2. В пенициллиновый флакон с 5 мл гипотонического раствора, со-

держащего колхицин (колцемид) в конечной концентрации 1 мкг/мл, 

поместить примерно по 10 мг образца (2–3 кусочка) и инкубировать 

при комнатной температуре 45–50 мин или при  + 37 °С 30–45 мин. За-

тем провести префиксацию и фиксацию материала, после чего приго-

тавливать препараты.

3. Препараты хромосом из различных органов зародыша человека 

готовить аналогично препаратам из ворсин хориона и плаценты по ус-

коренному «прямому» методу (Протокол 1.4).

1.5.2. Приготовление препаратов из суспензии клеток (печени, кост-

ного мозга)

Протокол 1.8

1. Фрагменты печени поместить в чашку Петри диаметром 40 мм, ча-

совое стекло или гомогенизатор с плохо притертым пестиком, налить не-

большое количество питательной среды, содержащей колхицин в концен-

трации 0,5 мкг/мл, и гомогенизировать. Фрагменты костного мозга сразу 

же перенести в пробирки с небольшим количеством среды с колхицином 

497

Приложение

и осторожным пипетированием добиться получения суспензии.

2. В полученную суспензию добавить среду с колхицином, пипети-

ровать и перенести в центрифужные пробирки.

3. Инкубировать клетки 1,5–2 часа при  + 37 °С (общее время обра-

ботки клеток колхицином не должно превышать 2 час). Дальнейшие 

этапы приготовления препаратов аналогичны описанным для культу-

ры лимфоцитов (см. пп. 4–6 Протокола 1.1).

Примечания

1) Для облегчения выхода клеток из фиксированного материала ку-

сочки кишечника или пищевода разрезать вдоль при помощи препаро-

вальной иглы в капле уксусной кислоты на препарате.

2) При приготовлении препаратов из печени и мозга следует соб-

людать осторожность, так как фиксированные кусочки очень хрупкие 

и легко разрушаются. Качество препаратов из печени и костного мозга 

можно повысить, используя суспензию клеток. 

2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА НЕОКРАШЕННЫХ И РАВНОМЕРНО  

ОКРАШЕННЫХ ХРОМОСОМ

2.1. Фазово-контрастная микроскопия 

Первый  этап  анализа  состоит  в  просмотре  неокрашенных  препа-

ратов  с  помощью  фазово-контрастного  устройства.  При  этом  произ-

водится оценка качества препаратов для дальнейшего анализа с помо-

щью различных типов окрашивания. 

2.2. Рутинная окраска хромосом

Сплошное,  или  равномерное,  окрашивание  хромосом  получило 

название рутинной окраски. Этот метод позволяет провести подсчет 

хромосом на метафазной пластинке и их групповую идентификацию и 

не пригоден для целей кариотипирования. Ограниченные возможнос-

ти метода сузили область его применения в современной цитогенетике 

до анализа и учета некоторых типов хромосомных аберраций в иссле-

дованиях мутагенной активности факторов среды.

Протокол 2.1

1. Препараты окрасить 3–5%-м раствором красителя Гимза на стан-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

498

дартном фосфатном буфере при комнатной температуре в течение 5–15 

мин в бюксе с красителем или нанесением на препарат 2–5 мл окраши-

вающего раствора. 

2. Промыть проточной водой и высушить.

3. МЕТОДЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ОКРАСКИ ХРОМОСОМ

Наиболее полное представление о кариотипе можно получить на 

препаратах  дифференциально  окрашенных  хромосом.  Методы  диф-

ференциального окрашивания позволяют идентифицировать каждую 

хромосому набора по специфичному для гомологичной пары линейно-

му рисунку в соответствии с основными типами окрасок: Q, G и R. 

3.1. Методы G-окраски хромосом

3.1.1. Метод GTG 

Протокол 3.1 [511]

Растворы

1. Буферный раствор SKN, pH 7,8 (для «прямых» препаратов) или 

GKN, pH 7,8 (для культивированных клеток).

2. 0,25%-й раствор трипсина. Трипсин растворить в буфере SKN, 

pH 7,8.

3. 5%-й раствор красителя Гимза: 1 мл маточного раствора красите-

ля растворить в 20 мл буфера SKN, pH 7,0.

Техника окрашивания 

1. Препараты (свежеприготовленные или хранившиеся при комнат-

ной температуре не более 10 дней) выдержать при 100 °С в течение 30 

мин. 

2. Охладить приблизительно до 30–40 °С. 

3. Обработать 2–5 сек в растворе трипсина.

4. Ополаскивать (10–15 сек) в буфере SKN, рН 9,0. 

5. Окрашивать 5–10 мин, нанося на препарат по 2–3 мл красителя.

6. Смыть краситель проточной водой и высушить.

499

Приложение

Примечания

1) Необходимо пользоваться свежеприготовленным буферным рас-

твором.

2) Каждый препарат следует окрашивать свежей порцией красителя.

Протокол 3.2 

Растворы

1. Раствор GKN, pH 7,0.

2. Раствор версена.

3. 0,25%-й раствор трипсина (на воде или физиологическом растворе).

4. 2%-й раствор красителя Гимза на 0,01 М Na-фосфатном буфере.

Техника окрашивания 

1. Свежеприготовленные препараты оставить на ночь, хранившие-

ся при комнатной температуре 2–3 дня — на 1 час, при  + 60 °С.

2. Обработать при комнатной температуре в смеси растворов версе-

на (30 мл), GKN (24 мл) и трипсина (6 мл). Время обработки подбирать 

эмпирически для каждой серии препаратов (30 сек — 3 мин).  

3. На 15 сек поместить в GKN.  

4. Окрашивать 3–7 мин красителем Гимза, нанося на каждый пре-

парат свежую порцию красителя.

3.1.2. Методы G-окраски без применения трипсина 

Протокол 3.3

1. На  свежеприготовленные  препараты  из  клеточной  суспензии 

нанести  по  2–3  мл  2%-го  раствора  красителя  Гимза,  заблаговремен-

но (за 6–8 часов) приготовленного на стандартном фосфатном буфере, 

рН 6,8.

2. Окрашивать в течение 5–7 мин.

3. Промыть проточной водой и высушить.

Протокол 3.4 [283]

1. На свежеприготовленные или хранившиеся при комнатной тем-

пературе не более 10 дней препараты нанести под покровные стекла 

0,4–0,5 мл буферного раствора 2×SSC и облучать в течение 15–25 мин 

под ультрафиолетовой лампой. Источник УФС типа ОКН-11 должен 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

500

находиться на расстоянии 20–25 см, типа ОРК-21 — 45–50 см от по-

верхности препарата. 

2. Покровные стекла смыть проточной или дистиллированной во-

дой.

3. На влажные стекла нанести по 2–3 мл 3-4%-го раствора красителя 

Гимза на стандартном фосфатном буфере, рН 6,8, окрашивать 5–10 мин. 

4. Промыть проточной водой и высушить.

Протокол 3.5 [819]

1. Препараты поместить в раствор 2хSSC и инкубировать в течение 

1–2 часов при  + 60 

о

С.

2. Дегидратировать в серии спиртов (70°, 80°, 96°), высушить.

3. Окрашивать 3–5%-м раствором красителя Гимза на 0,06 М K-Na-

фос фатном буфере, pH 6,8, 5–8 мин.

4. Промыть проточной дистиллированной водой, высушить.

3.2. Методы R-окраски хромосом (RHG, RFA)

Рисунок хромосом при R-окраске противоположен G-рисунку, что 

делает его незаменимым для анализа некоторых типов аберраций, осо-

бенно при идентификации ломкой Х-хромосомы на дифференциально 

окрашенных препаратах. Несмотря на то, что метод очень капризен, 

ему отдают предпочтение как основному методу дифференциального 

окрашивания в некоторых зарубежных лабораториях. 

Растворы

0,06 М фосфатный буфер Соренсена. 

Протокол 3.6 [875]

1. Препараты инкубировать в предварительно нагретом буферном 

растворе. Температуру и время подбирать для каждой партии препа-

ратов  эмпирически,  увеличивая  жесткость  обработки  в  зависимости 

от времени хранения препаратов (6–10 мин при 85 °С для препаратов  

10–30-дневной давности и 60–120 мин при 87 °С для односуточных). 

2. Промыть препараты в порции буфера при комнатной температу-

ре и затем проточной дистиллированной водой.

3. Провести препараты через серию спиртов повышающейся кон-

501

Приложение

центрации (70 °, 80 °, 96 °). Этот этап не является строго обязательным, 

его  используют  только  в  случае  чрезмерного  разбухания  хромосом 

вслед ствие предобработки.

Протокол 3.7 (RHG-метод)

1. Окрашивать препараты красителем Гимза (4–5 % в буфере Со-

ренсена, рН 6,7) 10–12 мин. 

2. Смыть краситель проточной водой, высушить. 

3. Анализировать препараты в проходящем свете с фазово-контрас-

тным устройством.

Протокол 3.8 (RFA-метод) 

1. Окрашивать препараты акридиновым оранжевым (0,01 % в буфе-

ре Соренсена, рН 6,5) 4–5 мин. 

2. Промыть препараты тем же буферным раствором 1 мин, заклю-

чить под покровное стекло в каплю того же буферного раствора.

3. Анализировать на люминесцентном микроскопе при длине вол-

ны 450–500 нм. 

Примечания

1)  Cвежеприготовленныe  препараты  нуждаются  в  более  длитель-

ной обработке. Однако следует иметь в виду, что при увеличении про-

должительности обработки тип окрашивания может видоизменяться в 

направлении R-, RT-, TC-, C-рисунков.

2) RHG-метод требует подбора условий для каждой новой партии 

препаратов и красителя Гимза.

3) RFA-метод позволяет получить более стабильный рисунок.

3.3. Методы Q-окраски хромосом (QFQ, QFH)

3.3.1. Метод QFQ

Для  получения  Q-окраски  хромосом  используют  акрихин  и  его 

производные (атебрин, акрихин-иприт, акрихин-пропил). Существует 

несколько вариантов метода, незначительно отличающихся по резуль-

татам. В отечественных лабораториях этот метод не нашел широкого 

применения для анализа метафазных хромосом, однако его использу-

ют при анализе Y-хроматина в ядрах буккального эпителия.