Цитогенетика эмбрионального развития - часть 63

Цитогенетика эмбрионального развития человека

486

еще в организме бабушки. Завершающие этапы созревания яйцеклет-

ки,  а  также  1-е  деление  созревания  ооцита  происходят  за  несколько 

дней до предполагаемой овуляции в организме самой матери. Состо-

яние яйцеклетки и, в первую очередь, активность и функциональная 

полноценность  ее  генома  во  многом  определяет  состояние  плода  и 

особенности  его  внутриутробного  развития.  Таким  образом,  вполне 

справедливо  утверждение  о  том,  что  каждая  яйцеклетка  физически 

и генетически связывает три поколения: бабушка

 

→

 

мать

 

→

 

 ребенок 

[444]. Данное обстоятельство необходимо иметь в виду при разработке 

рациональных  мер  профилактики  наследственной  и  врожденной  па-

тологии у человека, учитывая при этом, что репродуктивная функция 

женщины является самым чувствительным критерием оценки повреж-

дающего действия неблагоприятных экологических факторов.

11.6.3. лечение

По  вполне  понятным  причинам  никаких  эффективных  способов 

лечения хромосомных болезней пока не изобретено. Действительно, 

глубокие нарушения метаболизма и жизнедеятельности каждой клет-

ки не позволяют представить, даже теоретически, сколько-нибудь ра-

циональные подходы к терапии хромосомных болезней. Ситуация ос-

ложняется еще и тем, что патологический геном, формирующийся при 

оплодотворении и на первых делениях дробления, так искажает про-

грамму индивидуального развития, что ее коррекция даже у плода и, 

тем более, после рождения вряд ли может привести к положительным 

результатам. Естественно, что при этом мы не имеем в виду различные 

палиативные средства, включающие симптоматическое лечение, а так-

же методы, направленные на социальную адаптацию таких больных.

Большой скептицизм в этой связи вызывает мнение некоторых оте-

чественных ученых о перспективности терапии хромосомных болез-

ней путем трансплантации стволовых клеток. Отдельные (официально 

неподтвержденные) попытки «лечения» детей с болезнью Дауна путем 

трансплантации эмбриональных клеток, предпринимавшиеся в некото-

рых отечественных центрах, насколько нам известно, не дали положи-

тельных результатов. Конечно, создание таких искусственных химер, 

несущих наряду с анеуплоидными клетками и клетки с нормальным 

диплоидным кариотипом теоретически может способствовать ослаб-

лению симптомов, обусловленных патологическим генотипом. Однако 

487

Глава 11. 

Горизонты цитогенетики эмбрионального развития человека

трансплантированные клетки никогда не заменят уже существующие 

«больные»  клетки  и,  тем  более,  вряд  ли  позволят  когда-то  добиться 

коррекции  психических  функций  и  умственных  способностей  боль-

ных с хромосомными аномалиями.

Вероятно, ситуация не выглядела бы так безнадежно, если бы ка-

ким-то способом на ранних стадиях развития удалось бы провести на-

правленное выключение лишней хромосомы. К сожалению, пока нет 

никаких данных о существовании на хромосоме 21 центра инактива-

ции всей хромосомы, подобного центру Xic на Х-хромосоме. Таким 

образом,  на  сегодняшний  день  не  существует  реальных  подходов  к 

лечению хромосомных болезней и, прежде всего, наиболее частой из 

них — болезни Дауна. Прогресс в этой области может быть достигнут 

только за счет совершенствования методов симптоматической лекар-

ственной терапии, а также путем дальнейшего улучшения методов со-

циальной адаптации таких больных.

11.7. Новые направления цитогенетики 

эмбрионального развития человека

Методы и подходы цитогенетики развития находят все более ши-

рокое применение и в некоторых других, отличных от пренатальной 

диагностики, направлениях современной науки и медицины.

Прежде всего, они оказались незаменимыми в такой бурно развива-

ющейся области как вспомогательные репродуктивные технологии. Оцен-

ка качества гамет и результатов оплодотворения in vitro, анализ состояния 

дробящихся зародышей перед трансплантацией, их доимплантационная 

диагностика  требуют  не  только  специальной  подготовки  для  работы  

с ранними зародышами человека, но и хорошего владения всем арсеналом 

современных цитогенетических методов исследования.

Цитогенетика эмбрионального развития необходима и для изучения 

столь модных в наше время стволовых клеток. Что представляет собой 

их геном? Каков паттерн метилирования хромосом в эмбриональных и 

соматических  стволовых  клетках?  Какие  особенности  состояния  гете-

рохроматина и экспрессии генов у этих клеток-предшественников? Эти 

и  многие  другие  вопросы,  связанные  с  оценкой  качества  и  изучением 

фундаме нтальных проблем генетики развития стволовых клеток требуют 

широкого использования методов и подходов цитогенетики эмбриональ-

ного развития человека, рассмотренных в данной монографии.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

488

Наконец,  недавно  разработанная  техника  создания  («конструиро-

вания») искусственных минихромосом, обладающих автономной реп-

ликацией и неограниченными пакующими возможностями в отноше-

нии кассет генно-инженерных конструкций, несущих функционально 

активные гены, открывает широкие перспективы для генной терапии 

наследственных болезней [472].

Заключение

Проблема  феногенетики  хромосомных  аберраций  пока  далека  от 

своего решения. Не вызывает, однако, сомнения, что события, связан-

ные с фенотипическим проявлением хромосомных аберраций (поро-

ки, остановка развития и гибель анеуплоидных зародышей), являются,  

в конечном счете, следствием нарушений функций генома. Они реали-

зуются на молекулярном, хромосомном, клеточном, тканевом уровнях 

и на уровне целого организма. При этом избыток генетического мате-

риала, в целом, менее драматичен для внутриутробного развития, чем 

его дефицит. Отсюда логично предполагать, что решающее значение 

для феногенетики хромосомных аберраций имеет генный состав абер-

рантной хромосомы или ее фрагментов. Дисбаланс соответствующих 

генов, по всей вероятности, и определяет специфические нарушения 

морфогенеза,  характерные  для  многих  хромосомных  аберраций.  На-

рушения баланса регуляторных факторов, в том числе генов-факторов 

транскрипции, последовательностей, кодирующих специфические ма-

лые ядерные РНК, а также нарушения архитектоники клеточного ядра, 

скорее всего, ответственны за проявление неспецифических наруше-

ний при наличии хромосомных аберраций на уровне клеток (клеточ-

ный синдром) и целого организма (задержка развития, пороки, спон-

танные  аборты).  Патологический  эффект  ОРД  обусловлен  функцио-

нальными нарушениями, связанными с дефицитом или избытком про-

дуктов импринтированных генов, с проявлением летальных мутаций и 

неблагоприятных генных полиморфизмов, которые могут существен-

но модифицировать фенотипические проявления как ОРД, так и хро-

мосомных аномалий. Важнейшими факторами регуляции программы 

индивидуального  развития  на  уровне  хромосом  являются  процессы 

метилирования и гетерохроматизации. Анализ паттернов метилирова-

ния индивидуальных хромосом в клетках разных тканей и на разных 

стадиях развития может дать ценную информацию о структурно-функ-

489

Глава 11. 

Горизонты цитогенетики эмбрионального развития человека

циональных механизмах работы генома в эмбриогенезе человека. Вы-

сказанные предположения (активная роль ретротранспозонов в раннем 

эмбриогенезе, гипотеза взаимодействия (взаимной активации) гомоло-

гичных хромосом в развитии и др.) основаны, главным образом, на ре-

зультатах экспериментальных исследований. Их проверка и уточнение 

с помощью различных методов непосредственно на зародышах чело-

века является первостепенной задачей цитогенетики эмбрионального 

развития человека.

Основные перспективы практического применения методов и под-

ходов цитогенетики развития касаются дальнейшего совершенствова-

ния методов хромосомного анализа, повышения качества профилакти-

ки хромосомной патологии с помощью медико-генетического консуль-

тирования, преконцепционной профилактики, массовой пренатальной 

диагностики, внедрения в практику генетической карты репродукти-

вного здоровья. Реальных методов или подходов к терапии хромосом-

ных  болезней  не  существует.  Прогресса  в  этой  области  можно  ожи-

дать только за счет совершенствования симптоматической терапии с 

помощью новых лекарств направленного действия и путем улучшения 

методов социальной адаптации таких больных. Нет сомнения, что ме-

тоды, подходы и опыт научных исследований в цитогенетике эмбрио-

нального развития человека найдет широкое применение в решении 

практических  задач  центров  вспомогательных  репродуктивных  тех-

нологий, в исследованиях стволовых клеток, в разработке научных и 

практических основ клеточной и генной терапии.

1. МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ХРОМОСОМ 

1.1. Приготовление препаратов хромосом из лимфоцитов 

периферической крови

Наиболее простым и доступным, и поэтому распространенным в 

клинической цитогенетике является анализ хромосом из лимфоцитов 

периферической  крови.  Циркулирующие  в  кровяном  русле  клетки  в 

норме не пролиферируют, однако в культуральных условиях митогены 

(фитогемагглютинин (ФГА), покивид, конканавалин А и др.) стимули-

руют  митотическое  деление  лимфоцитов.  При  микрометоде  исполь-

зуют  цельную  капиллярную  (из  пальца  или  пятки)  кровь,  при  полу-

микрометоде и макрометоде — венозную кровь или ее лейкоцитарную 

фракцию. В любом случае, при взятии крови необходимо строгое соб-

людение стерильных условий. 

Реактивы 

Гепарин (25 000 ед.); культуральная среда (RPMI 1640 или Игла); 

антибиотики (пенициллин — 100 ед/мл  +  канамицин — 100 мкг/мл, 

или  гентамицин  —  50 мкг/мл);   L-глутамин (конечная  концентрация 

0,2 мг/мл); сыворотка (эмбрионов коров); фитогемагглютинин, колхи-

цин (колцемид).

Протокол 1.1

1. В стерильный шприц, содержащий 100–500 ед. гепарина, взять 

из периферической вены 1–3 мл крови, перемешать. 

2. В пенициллиновые флаконы добавить: 4,25–4,5 мл среды с ан-

тибиотиками и глутамином; 0,75–0,5 мл сыворотки; 0,3–0,5 мл гепа-

ринизированной  крови;  ФГА  в  концентрациях,  рекомендуемых  фир-

мой-производителем. Стандартное время культивирования — 72 часа 

при   + 37 °С  в  закрытой  системе.  Культуру  ежедневно  перемешивать, 

осторожно встряхивая флаконы.

3. На  71-м  часу  культивирования,  т.  е.  за  50–60  мин  до  начала 

ПРИлОЖеНИе

491

Приложение

фиксации, в культуру ввести колхицин (колцемид) в конечной кон-

центрации 0,15–8,0 мкг/мл.

4.  Содержимое  флаконов  перенести  в  центрифужные  пробирки, 

клетки осадить центрифугированием при 1000 об/мин 10 мин, супер-

натант удалить пипеткой, оставляя 0,3–0,5 мл над осадком. Осадок раз-

бить энергичным встряхиванием и добавить 8–10 мл гипотонического 

раствора (0,55%-й раствор KCl или смесь 1%-го трехзамещенного цит-

рата Na и 0,55 % KCl, 1:1), перемешать пипетированием и инкубиро-

вать 15–20 мин при 37 °С.

5. Фиксация.

Вариант  1.  Центрифугировать  (10  мин,  1000  об/мин).  Осадок 

тщательно  разбить  встряхиванием  в  0,5  мл  надосадочной  жидкости. 

К осадку струйно прилить 8–10 мл холодного свежеприготовленного 

фиксатора  (метанол   +   ледяная  уксусная  кислота,  3:1)  и  перемешать 

пипетированием. Первую фиксацию проводить при  + 4 °С в течение 30 

мин. Затем фиксатор сменить 3–5 раз, добавляя порции по 5–7 мл.

Вариант 2. С префиксацией: по окончании времени гипотоничес-

кой обработки в каждую пробу добавить по 0,5–1,0 мл холодного све-

жеприготовленного фиксатора (метанол  +  ледяная уксусная кислота, 

3:1), перемешать пипетированием и осадить центрифугированием (10 

мин, 1000 об/мин). Супернатант удалить, осадок разбить встряхивани-

ем и провести фиксацию как описано выше в варианте 1.

Вариант 3. К осадку каплями добавить 1 мл фиксатора (метанол  +  

ледяная уксусная кислота, 9:1), энергично встряхивая пробирку. Затем 

струйно прилить еще 9 мл фиксатора. Через 2–3 мин клетки осадить 

центрифугированием, к осадку прилить 10 мл ледяной уксусной кис-

лоты. Пробирку вручную осторожно встряхивать в течение 10 мин, за-

тем клетки осадить центрифугированием. К осадку прилить 8–10 мл 

фиксатора 3:1. Через 2–3 мин фиксатор заменить на свежую порцию и 

продолжить фиксацию в течение 50–60 мин.

6. Приготовление препаратов.

Раскапывание суспензии проводить на предметные стекла, охлаж-

денные в морозильной камере или в холодной воде, нанося на препа-

рат с высоты 30–50 см по 30–50 мкл суспензии. Стекла высушить при 

комнатной температуре. При плохом разбросе хромосом на препарате 

рекомендуется высушивать стекла над пламенем спиртовки или под-

жиганием фиксатора.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

492

1.2. Приготовление препаратов хромосом из лимфоцитов пу-

повинной крови плода

Особенностью пренатальной диагностики с использованием крови 

плода, полученной путем кордоцентеза из пуповинной вены, является 

ограниченное количество (не более 1 мл) получаемого материала и не-

обходимость исключения контаминации клетками крови материнского 

происхождения. 

Протокол 1.2

1. В пробирку, содержащую 5,0 мл дистиллированной воды доба-

вить 1,0 мл 0,25 N NaOH (смешивать непосредственно перед употреб-

лением). 

2. Добавить 0,05 мл крови (1–2 капли). Перемешивать покачивани-

ем пробирки в течение 1 мин. 

3. Переход цвета от розового до темного зелено-коричневого указы-

вает на присутствие в образце крови матери. Ярко-розовый цвет свиде-

тельствует об отсутствии контаминации.

1.3. Тест для оценки контаминации пуповинной крови 

плода кровью матери [234]

Протокол 1.3

1. Получение крови из пуповины плода осуществляют в операци-

онной  путем  трансабдоминального  кордоцентеза  или  производят  за-

бор крови из пуповинной вены при рождении. 

2. Культивирование лимфоцитов крови плода проводится в полном соот-

ветствии со стандартным полумикрометодом (см. пп. 2–6 Протокола 1.1). 

1.4. Приготовление препаратов хромосом из ворсин хориона 

или плаценты

В пренатальной диагностике наиболее широко используют хромосом-

ный анализ клеток хориона и плаценты, получаемых под контролем уль-

тразвука. Для массовых цитогенетических исследований особенно удоб-

ными  являются  «прямые»  методы.  Они  экономичны,  позволяют  через 

несколько часов после проведения процедуры получить результат. 

493

Приложение

Предлагаемые варианты позволяют успешно (в 98,6 % случаев) прово-

дить цитогенетическую пренатальную диагностику у беременных на 

сроках 9–24 недель беременности и адаптированы к условиям отечест-

венных цитогенетических лабораторий.

Получение материала 

1. Непосредственно в операционной биоптат из шприца перенес-

ти  в  чашку  Петри  (диаметром  100  мм)  со  средой  Игла  или  Хенкса,  

( + 30–37 °С). Среда должна содержать гепарин (25 000 ед.) и антиби-

отики пенициллин (50000 ед.) и стрептомицин (25 мг) — на 500 мл 

среды.

2. Отбор ворсин проводить под контролем бинокулярной лупы МБС-2  

в  проходящем  свете  затемненного  поля.  Отобранные  ворсины  и  их 

фрагменты перенести в свежую порцию среды в чашку Петри (диамет-

ром 40 мм) и визуально оценить количество полученного материала.

Следующие  этапы  приготовления  препаратов  могут  несколько  отли-

чаться.

1.4.1. «Прямой» метод

Протокол 1.4 (ускоренный «прямой» метод)

1. Отмытый от крови материал (по 5–10 мг) незамедлительно пе-

ренести в пенициллиновые флаконы с 5 мл 0,9%-го трехзамещенного 

безводного  цитрата  натрия  и  колхицином  в  конечной  концентрации  

2,5 мкг/мл. Гипотоническую обработку проводить при комнатной тем-

пературе 40–50 мин или при  + 37 °С 35–40 мин.

2. 2-3 мл гипотонического раствора удалить пипеткой. Во флакон 

порциями добавить примерно такой же объем холодного свежеприго-

товленного фиксатора (метанол  +  ледяная уксусная кислота, 3:1). Пер-

вую порцию фиксатора добавить по каплям, встряхивая флакон, затем 

струйно. Префиксацию проводить при комнатной температуре 45–90 

мин. На этом этапе можно транспортировать полученный материал в 

лабораторию.

3. Весь префиксирующий раствор удалить пипеткой, остатки жид-

кости  удалить  фильтровальной  бумагой.  Во  флакон  с  ворсинами  на-

лить 4–5 мл холодного ( + 4 °С) фиксатора. Фиксацию проводить 1–2 

часа при 0–10 °С.