Цитогенетика эмбрионального развития - часть 65

Цитогенетика эмбрионального развития человека

502

Растворы

Стандартный фосфатный буфер (рН 6,7) или цитратно-фосфатный 

буфер Мак-Ильвейна (рН 5,4). 

Протокол 3.9 [64]

1. Краситель развести в одном из буферных растворов. Рекоменду-

емые концентрации: 5 мкг/мл, 50 мкг/мл или 1–5 мг/мл.

2.  Окрашивать  препарат  под  покровными  стеклами  или  в  бюксе 

10–20 мин.

3. Промыть в нескольких сменах буферного раствора или проточ-

ной водой.

4. Заключить препарат в буфер или воду.

5. Анализировать на люминесцентном микроскопе при длине вол-

ны 450–500 нм.

Примечания

1) При использовании низких концентраций красителя можно ана-

лизировать препарат непосредственно в растворе красителя без про-

мывания.

2)  Заключающий  раствор  можно  приготовить  из  смеси  буфера  с 

глицерином в соотношении 1:1.

3.3.2. Метод QFH 

Рисунок  флуоресценции  при  окрашивании  хромосом  флуорохро-

мом  Hoechst  33258  с  последующим  контрастированием  актиноми-

цином D принципиально не отличается от Q-рисунка, получаемого с 

помощью акрихина за исключением интенсивно светящихся гетерох-

роматиновых районов хромосом 1, 9 и 16, темных при традиционном 

QFQ-рисунке. Преимущества QFН-рисунка заключаются и в том, что 

Hoechst значительно превосходит акрихин по яркости, а контрастиро-

вание окраски антибиотиком актиномицином D дает очень четкую и 

стабильную  картину  дифференциальной  флуоресценции.  Хотя  этот 

метод  применяется  для  окраски  хромосом  человека  только  в  нашей 

лаборатории, предлагаемый вариант достоин широкого применения в 

клинической цитогенетике и особенно в пренатальной диагностике.

503

Приложение

Растворы

1. Насыщенный солевой буферный раствор, рН 7,2.

2. Раствор флуорохрома Hoechst 33258. 

Маточный  раствор  красителя  на  дистиллированной  воде  в  концент-

рации 1мг/мл (может быть использован в течение года при хранении 

при  + 4 °С). 

Рабочий раствор: приготавливать из маточного на насыщенном соле-

вом буферном растворе, рН 7,2, в концентрации 0,5 мкг/мл. Использо-

вать в течение 2–4 недель.

3. Актиномицин D (аналоги: актиномицин С, дактиномицин) рас-

творить в концентрации 0,2–0,3 мг/мл в буфере состава: 1 мМ Na

2

HPO

4

, 

1мМ ЭДТА.

4. Заключающий раствор: цитратно-фосфатный буферный раствор, 

рН 4,2, смешать с глицерином в соотношении 1:1 (по объему).

Протокол 3.10 [16]

1. Инкубировать препараты 10–20 мин в насыщенном coлевом бу-

ферном растворе, рН 7,2 (время инкубирования свежеприготовленного 

препарата можно сократить до 3–5 мин). 

2. Окрашивать 12–20 мин в растворе красителя Hoechst 33258. 

3. Инкубировать в свежей порции буферного раствора 10–20 мин.  

4. Высушить препарат и нанести 2 капли раствора актиномицина, 

накрыть каждую каплю чистым сухим покровным стеклом и помес-

тить в защищенное от света место на 15–20 мин. 

5. Смыть покровные стекла и промыть препарат проточной дистил-

лированной водой. Высушить.  

6. Нанести на препарат под каждое покровное стекло по 1 капле 

заключающего раствора. Избыток жидкости аккуратно удалить филь-

тровальной бумагой.

7. Анализировать на люминесцентном микроскопе при длине вол-

ны  360–390  нм.  При  использовании  микроскопов  серии  «Люмам» 

возбуждающий светофильтр «УФС 6-3» или 6–5 в комплекте со све-

тофильтром СЗС-24, запирающий ЖСЗ + БС8 (голубая пластинка опак-

иллюминатора).

Цитогенетика эмбрионального развития человека

504

Примечания

1)  Всю  процедуру  окрашивания  проводить  в  бюксах  из  темного 

стекла или обернутых в черную бумагу.

2)  Качество  дифференциальной  окраски  зависит  от  рН  растворов  и 

времени хранения препаратов до и после окрашивания. Анализ хромосом 

лучше проводить на препаратах, хранившихся при  + 60 °С

 

1–12 часов или 

2–7 дней при  + 37 °С до окрашивания и 2–5 дней при  + 4 °С после окраски, 

избегая таким образом «выцветания» дифференциальной окраски.

3) Окрашенные препараты оберегать от воздействия света.

4)  Использовать  нефлуоресцирующее  иммерсионное  масло,  при 

его отсутствии — глицерин.

Глицерин не должен иметь собственной люминесценции. 

3.4.  Методы  избирательной  окраски  гетерохроматиновых 

районов хромосом

В отличие от G- или R-дифференциальной окраски, которые поз-

воляют получить исчерченность вдоль хромосомы и на основе этого 

рисунка  идентифицировать  каждую  хромосому,  методы  избиратель-

ного окрашивания направлены на выявление отдельных районов хро-

мосом,  в  частности,  прицентромерного  гетерохроматина  сегментов  

(С-окрашивание) или активных ядрышкообразующих районов (ЯОР- 

или NOR-окрашивание).

3.4.1. Метод CBG 

С помощью С-метода выявляются центромерные районы всех хро-

мосом,  а  также  полиморфные  гетерохроматиновые  блоки,  локализо-

ванные в прицентромерных районах акроцентрических хромосом и в 

длинных плечах хромосом 1, 9, 16 и Y. 

Протокол 3.11 [64] 

1.  Препараты,  хранившиеся  после  приготовления  3–10  дней 

при  + 37 °C, инкубировать в 0,2 N HCl при комнатной температуре в 

течение 1 часа.

2. Промыть проточной дистиллированной водой или в трех сменах 

воды, слегка подсушить. 

505

Приложение

3. Инкубировать в насыщенном (5 %) растворе Ва(ОН)

2

 при 60 °С  

в течение 3–20 мин (время обработки обратно пропорционально сро-

ку хранения препаратов и раствора Ва(ОН)

2

. Желательно использовать 

свежеприготовленный раствор Ва(ОН)

2

. 

4. Промыть препарат в 0,1 N HCl, затем в трех сменах дистиллиро-

ванной воды и слегка подсушить. 

5. Инкубировать в 2×SSC при  + 60 °С в течение 1 часа (время инку-

бирования можно увеличивать до суток при комнатной температуре). 

6. Окрашивать 10–15 мин в растворе красителя Гимза (40 мл 0,1 М 

фосфатного буфера, рН 6,8, 1,2 мл метанола и 2 мл красителя).

3.4.2. Метод G-11

При этом методе гетерохроматиновые блоки на хромосоме 9 окрашива-

ются в густой розово-пурпурный цвет в отличие от всех других районов хро-

мосом. Метод особенно удобен при уточнении инверсий этого участка.

Протокол 3.12 [64]

1. Приготовить 2%-й раствор красителя Гимза на дистиллирован-

ной воде, рН 11,0, используя 0,1 М раствор NaOH.

2. Нанести на препарат свежеприготовленный раствор красителя и 

окрашивать в течение 5–10 мин.

3. Смыть краситель проточной водой, высушить.

Примечания

1)  Для  окрашивания  пригодны  препараты,  хранившиеся  7–10 

дней.

2) Для свежеприготовленных препаратов условия (время, вариации 

рН от 10,5 до 11,6) подбираются эмпирически.

3.4.3. Методы с использованием флуорохромов 

Растворы

1. Цитратно-фосфатный буферный раствор, рН 7,0 и рН 4,0.

2. Раствор метилового зеленого. 

Маточный раствор — 1,76 % на буфере, рН 4,0. Раствор можно сохра-

нять при  + 4 °С в течение нескольких месяцев. 

Рабочий раствор (готовить непосредственно перед употреблением) — 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

506

маточный раствор развести в соотношении 1 : 50 буферным раствором 

с рН 7,0.

3. Рабочий раствор флуорохрома Hoechst 33258 (способ приготов-

ления см. в методе QFH). 

4. Заключающий раствор (см. там же).

Протокол 3.13 [16]

1. На препараты (свежеприготовленные или хранившиеся несколь-

ко дней) нанести по 2–4 мл рабочего раствора метилового зеленого и 

инкубировать 25–30 мин при комнатной температуре.

2. Промыть проточной дистиллированной водой, высушить.

3. Окрашивать флуорохромом Hoechst 33258 как при QFH-технике.

4. Под покровные стекла нанести по 1 капле заключающего рас-

твора.

5. Анализировать как QFH-исчерченность.

Примечания

1) Метод позволяет выявлять гетерохроматиновые блоки преиму-

щественно на 9, а также на 1, 13–15, 16, 19, 21, 22 и Y хромосомах.

2) При получении тусклой флуоресценции можно докрасить препа-

рат флуорохромом Hoechst 33258 и наоборот.

3) При  использовании  препаратов,  ранее  окрашенных  для  анали-

за  QFH-рисунка,  увеличить  время  обработки  метиловым  зеленым  и 

сократить  до  5  мин  повторное  окрашивание  флуорохромом  Hoechst 

33258.

4) Препараты, окрашенные ранее красителем Гимза для рутинного 

анализа, обесцветить в стандартном фиксаторе (этанол — ледяная ук-

сусная кислота, 3:1).

4. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО 

АНАЛИЗА

Приведенные ниже методы не используются в ежедневной практи-

ке, однако для целого ряда исследований они незаменимы. Предложен-

ные варианты достаточно просты и воспроизводимы. 

 

507

Приложение

4.1. Репликационные варианты G- и R-дифференциального 

окрашивания хромосом

Использование аналогов тимидина — 5-бромдезоксиуридина (БДУ) 

или 5-флуородезоксиуридина (ФДУ) позволяет получить дифференци-

альную окраску хромосом. Рисунок дифференциальной исчерченнос-

ти основан на разновременной репликации ДНК G- и R-блоков в S-

фазе клеточного цикла. Введение БДУ в культуру в начале S-периода 

позволяет получить рисунок, аналогичный G-исчерченности, в конце 

S-периода — R-рисунок.

Растворы (приготавливать на дистиллированной воде для инъекций)

1. БДУ — 1 мг/мл.

2. Тимидин — 1 мг/мл.

3. Бромистый этидий — 1 мг/мл. 

4.1.1. Репликационный G-рисунок 

Протокол 4.1. (для клеток хориона) 

1. Поставить кратковременную 24-часовую культуру (см. Протокол 1.6). 

2. В начале культивирования (если ворсины в среде находились в 

холодильнике  —  то  перед  тем,  как  перенести  флаконы  в  термостат) 

ввести БДУ в конечной концентрации 25–30 мкг/мл.

3. Через 12 часов культивирования ворсинки отмыть в небольшой 

порции среды и поместить во флаконы с культуральной средой пре-

жнего состава (без БДУ). Для получения более четкого рисунка доба-

вить тимидин в конечной концентрации 20–25 мг/мл. Культивирование 

продолжать в течение следующих 12 часов. 

4. За 1–2 часа до фиксации в культуру ввести колхицин в конечной 

концентрации 0,5 мкг/мл. Во избежание чрезмерной конденсации хро-

мосом одновременно ввести бромистый этидий в конечной концентра-

ции 5–10 мкг/мл.

Протокол 4.2 (для клеток амниотической жидкости и лимфоцитов)

1. Культивирование клеток проводить в соответствии с общеприня-

тыми методами (см. раздел 1.1, 1.2 и 1.5).

Цитогенетика эмбрионального развития человека

508

2. За 16–20 часов до фиксации в культуру ввести БДУ в конечной 

концентрации 15–25 мкг/мл.

3. За 6–7 часов до фиксации культуру лимфоцитов перенести в сте-

рильные центрифужные пробирки, дважды промыть культуральной сре-

дой (по 4–5 мл), осаждая клетки центрифугированием при 1000 об/мин 

в течение 7–10 мин, ресуспендировать в свежей порции питательной 

среды и ввести тимидин в конечной концентрации 20–25 мкг/мл. 

4. При  культивировании  амниоцитов  среду,  содержащую  БДУ, 

удалить, промыть монослой 1–2 сменами теплой ( + 37 °С) среды, в 

свежую порцию питательной среды добавить тимидин. Концентра-

ции БДУ и тимидина, а также временные интервалы такие же, как 

и для лимфоцитов.

4.1.2. Репликационный R-рисунок (RBG, RBA)

Протокол 4.3 (для клеток хориона)

Концентрации вводимых реагентов аналогичны описанным в Прото-

коле 4.1. Изменить последовательность операций: в начале культивиро-

вания ввести тимидин, заменяя его через 12 часов на БДУ. Инкубацию в 

течение первых 12 часов можно проводить и в отсутствии тимидина. 

Протокол 4.4 (для клеток амниотической жидкости и лимфоцитов)

Культивирование  клеток  проводить  в  соответствии  с  общепри-

нятыми методами (см. раздел 1.1, 1.2 и 1.5). За 6–7 часов до фиксации 

в культуру ввести БДУ в конечной концентрации 30 мкг/мл. Для полу-

чения  более  четкой  картины  исчерченности  одновременно  с  колхици-

ном рекомендуется ввести бромистый этидий в конечной концентрации  

10 мкг/мл.

Протокол 4.5 (RBG) 

Растворы 

1. Ноechst 33258 — 0,02 %. 

2.  5%-й  раствор  красителя  Гимза  на  0,1  М  фосфатном  буфере, 

рН 6,8.

Техника окрашивания

1. На свежеприготовленные или хранившиеся не более двух недель 

при комнатной температуре в защищенном от света месте препараты 

509

Приложение

нанести по 3–5 мл раствора Hoechst. 

2. Облучать в течение 80–90 мин ультрафиолетовой лампой, как для 

получения G-рисунка (см. Протокол 3.4).  

3. Смыть покровные стекла проточной дистиллированной водой и 

окрашивать препарат красителем Гимза.

Протокол 4.6 (RBA)

Растворы

  1.  0,1%-й  раствор  акридинового  оранжевого.  Раствор  красителя 

пригоден в течение месяца при хранении при  + 4 °С.

  2. 0,1 М Na-фосфатный буфер, рН 6,8–7,0.

Техника окрашивания 

  1. Нанести на препарат под покровные стекла по 1–2 капли акриди-

нового оранжевого на 1–2 мин.  

  2. Смыть покровные стекла и промыть препарат проточной дистил-

лированной водой. 

  3. Препарат заключить в 0,1 М Na-фосфатный буфер.

  4. Анализировать на люминесцентном микроскопе при длине вол-

ны 430–480 нм. При использовании микроскопа серии «Люмам» свето-

фильтр возбуждения ФС в комплексе с фильтром СЗС-24, запирающие 

светофильтры — ЖС-18  +  ЖСС-19 (зеленая пластинка опак-иллюми-

натора).

Примечания

  1) Окрашенный препарат должен флуоресцировать в желто-оран-

жевом спектре. При избыточном окрашивании (красная область спект-

ра) необходимо промыть препарат 1–2 мин в буфере. Свечение в зеле-

ной области означает, что препарат недокрашен. В этом случае смыть 

проточной водой покровные стекла, высушить и докрасить препарат 

акридиновым  оранжевым.  Небольшое  смещение  в  красную  область 

спектра  можно  преодолеть,  наблюдая  за  изменением  спектра  люми-

несценции в процессе анализа.

Протокол 4.7

Растворы 

  1. Ноechst 33258 — 0,02 %. 

  2. 2×SSC, pH 7,0.

  3.  Растворы  для  окраски  и  заключения  препаратов  см.  в  разделе 

«Гибридизация in situ» (Окраска и заключение препаратов, пп. 1–3, 6).