Цитогенетика эмбрионального развития - часть 67

Цитогенетика эмбрионального развития человека

518

Протокол 5.5 (приготовление мазков крови)

  1.  На  чистом,  обезжиренном  стекле  приготовить  мазок  из  капли 

периферической крови, равномерно распределив материал по стеклу 

другим стеклом.

  2. Высушить препарат при комнатной температуре.

  3. Через 2–3 часа на препарат нанести 1–2 мл охлажденного свеже-

приготовленного фиксатора (метанол  +  ледяная уксусная кислота, 3 : 1) 

на 30–60 сек.

  4. Поджечь фиксатор и, не дожидаясь его полного сгорания, пога-

сить пламя.

  5. Высушить препарат на воздухе.

5.2.1. Приготовление препаратов некультивированных клеток ам-

ниотической жидкости

Растворы

  Гипотонический раствор — 0,56%-й раствор KСl.

Протокол 5.6

  1.  Образцы  амниотической  жидкости  по  6–8  мл  перенести  в  цент-

рифужные пробирки и центрифугировать при 1000 об/мин в течение 10 

мин.

  2. Осторожно удалить пипеткой надосадочную жидкость, добавить 

к осадку по 8 мл гипотонического раствора и перемешать.

  3. Инкубировать смесь 1,5 часа в термостате при  + 37 °C.

  4. Центрифугировать при 1000 об/мин в течение 10 мин.

  5. Осторожно удалить пипеткой надосадочную жидкость. 

  6. Фиксировать материал дважды свежеприготовленным фиксато-

ром (метанол  +  ледяная уксусная кислота, 3 : 1). Фиксацию проводить 

при  + 4 °С, первую в течение 10, вторую — 20 мин.

  7. Осадить клетки центрифугированием при 1000 об/мин в течение 

10 мин.

  8. Осторожно удалить пипеткой надосадочную жидкость.

  9. К осадку добавить ледяную уксусную кислоту, 8 мл на пробирку, 

перемешать и выдержать пробирки при  +  4 °С 1,5 часа.

  10. Осадить клетки центрифугированием при 1000 об/мин в тече-

519

Приложение

ние 10 мин, и осторожно удалить надосадочную жидкость.

  11. Добавить к осадку 6 мл свежеприготовленного фиксатора, пере-

мешать и выдержать смесь 10 мин при  + 4 °С.

  12. Осадить клетки центрифугированием — 1000 об/мин, 10 мин, и 

осторожно удалить надосадочную жидкость.

  13. Добавить к осадку 6 мл охлажденного метанола, перемешать и 

выдержать смесь 10 мин при  + 4 °С.

  14. Осадить клетки центрифугированием — 1000 об/мин, 10 мин, и 

осторожно удалить надосадочную жидкость.

  15. Добавить к осадку 1,5–2 мл охлажденного метанола и переме-

шать.

  16.  Суспензию  клеток  по  50–100  мкл  раскапать  на  охлажденные 

чистые и обезжиренные стекла и высушить поджиганием фиксатора.

5.2.2. Приготовление препаратов из эякулята [89, 621]

  До приготовления препаратов эякулят можно хранить в темном по-

мещении при температуре  + 4 °C не более 24 часов.

Растворы

  1) Гипотонический раствор — 0,038 М раствор KСl.

  2) Раствор для деконденсации хроматина сперматозоидов — 0,2 М 

TRIS-HCl, рН 8,6, 1,25 % папаина, 0,16 % дитиотрейтола (ДТТ) и 0,5 % 

диметилсульфоксида (ДМСО).

  3) Раствор для отмывки — 0,2 М TRIS-HCl, pH 8,6.

Протокол 5.7

  1. Образцы спермы (по 0,5 мл) перенести в центрифужные пробир-

ки, добавить в них по 8 мл гипотонического раствора и перемешать.

  2. Инкубировать смесь 30 мин в термостате при  + 37 °C.

  3. Центрифугировать 20 мин при 1500 об/мин.

  4. Осторожно удалить пипеткой надосадочную жидкость.

  5.  Фиксировать  материал  свежеприготовленным  фиксатором  (ме-

танол  +  ледяная уксусная кислота, 3 : 1). Первую фиксацию проводить 

при  + 4 °С в течение 30 мин. Затем фиксатор сменить трижды, время 

каждой фиксации — 15–20 мин.

  6. Суспензию клеток по 0,1 мл нанести на охлажденные чистые и 

обезжиренные стекла.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

520

  7. Высушить стекла поджиганием фиксатора.

  8. Выдержать препараты двое-трое суток при комнатной темпера-

туре в сухом темном месте.

  9.  Инкубировать  препараты  в  растворе  для  деконденсации 

при  + 37 °С 30 мин.

  10. Отмыть препараты в растворе для отмывки при комнатной тем-

пературе в течение 10 мин при покачивании.

  11. Высушить препараты на воздухе.

5.3. Предгибридизационная обработка препаратов

  Накопленный нами опыт показывает, что для FISH оптимально 

использовать свежие препараты, приготовленные за двое суток до 

гибридизации  и  не  подвергавшиеся  каким-либо  обработкам  или 

окраскам.  Однако  при  необходимости  можно  использовать  окра-

шенные  ранее  препараты,  мягко  (дистиллированная  вода,  спирты, 

ксилол)  отмытые  от  красителей,  и  препараты,  приготовленные  за 

несколько месяцев (до двух-трех лет) до гибридизации. Важным ус-

ловием успешного проведения исследования является минимальное 

количество цитоплазмы и клеточного детрита на препарате. Ниже 

приведена легко воспроизводимая методика обработки препаратов 

перед гибридизацией. Ее можно использовать для предгибридиза-

ционной обработки препаратов всех типов клеток, приготовленных 

прямыми методами или после культивирования, а также мазков кле-

ток буккального эпителия и крови.

Растворы

  1) Раствор РНКазы А. 

  Маточный раствор — 10 мг РНКазы А растворить в 1 мл 2×SSC, помес-

тить пробирку в кипящую водяную баню на 10 мин и охладить до комнат-

ной температуры. Расфасовать по 15 мкл и хранить раствор при – 20 °С.

  2) Рабочий раствор РНКазы (готовить непосредственно перед упот-

реблением) — к 985 мкл раствора 2хSSC добавить 15 мкл маточного 

раствора РНКазы А.

  3) Раствор 20×SSC, pH 7,0 — 3 M NaCl, 0,3 M цитрат Na.

  4) Раствор 2×SSC, pH 7,0 — к 100 мл раствора 20×SSC добавить 

900 мл дистиллированной воды.

521

Приложение

  5) Раствор 10×PBS, pH 7,0.

  6) Раствор А: в 900 мл дистиллированной воды растворить 16,02 г 

Na

2

HPO

4

×

2H

2

O и 73,84 г NaCl. Раствор Б: в 200 мл дистиллированной 

воды растворить 2,76 г NaH

2

PO

4

 и 16,56 г NaCl. Довести рН раствора 

А до 7,0 с помощью раствора Б.

  7)  Раствор  пепсина  (использовать  пепсин  с  активностью  3000–

4000 ед., например, Sigma, P 6886).

Маточный раствор — 10%-й водный раствор пепсина на дистиллиро-

ванной воде. Расфасовать по 100 мкл и хранить при –20 °С.

  8) Рабочий раствор — непосредственно перед использованием 60–

100 мкл маточного раствора пепсина добавить к 100 мл 0,01 М HCl. 

Раствор перемешать.

  9) 0,01 М HCl — к 100 мл предварительно нагретой до  + 37 °С дис-

тиллированной  воды  добавить  85  мкл  концентрированной  HCl.  Рас-

твор перемешать.

  10) Раствор параформальдегида (1%-й или 4%-й), готовить непо-

средственно перед употреблением:

• 

к 1 или 4 г параформальдегида добавить 80 мл дистиллированной 

воды и 7 (или 20) мкл 5 N NaOH, растворить при  + 50–60 °С при пока-

чивании;

• 

добавить к раствору 10 мл 10×PBS и 1 мл 5 М раствора MgCl

2

 (конеч-

ная концентрация 50 mM);

• 

охладить раствор до комнатной температуры;

• 

при  необходимости  довести  pH  до  7,0  концентрированной  HCl  

(4–10 мкл);

• 

довести объем раствора до 100 мл дистиллированной водой.

  11.  Раствор  для  денатурации  —  70 %-й  деионизированный  фор-

мамид*, 2×SSC, рН 7,0 (70 мл деионизированного формамида; 10 мл 

20×SSC, рН 7,0; H

2

O до 100 мл).

  * Деионизация формамида: к 100 мл формамида добавить 10 г ио-

нообменной смолы AG 501-X8, ячейка 20–50 (Bio-Rad), и перемеши-

вать смесь на магнитной мешалке в течение нескольких часов. Затем 

несколько  раз  профильтровать  смесь  через  фильтровальную  бумагу 

ватман № 1. Профильтрованный формамид рекомендуется хранить в 

плотно закрытой стеклянной или пластиковой посуде.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

522

Протокол 5.8 

  1. Выдержать препараты 1 час при  + 60 °С. 

  2. Дегидратировать препараты в серии спиртов (70°, 80°, 96° эта-

нол) по 5 мин в каждом.

  3. Высушить препараты на воздухе.

  4. Нанести на препараты по 100 мкл рабочего раствора РНКазы А, 

накрыть покровными стеклами 22×50 мм. Обработку препаратов про-

водить во влажной камере в термостате при  + 37 °С в течение 1 часа. 

Если в качестве ДНК-зондов будут использоваться последовательно-

сти рДНК или другие последовательности, уровень экспрессии кото-

рых в исследуемой ткани высок, рекомендуется увеличить продолжи-

тельность этапа до 2–3 часов.

  5.  Отмыть  препараты  при  комнатной  температуре  в  трех  сменах 

2×SSC и затем при  + 37 °С в 1 смене 1×PBS, по 5 мин в каждой смене, 

при покачивании. 

  6. Обработать препараты в стакане с рабочим раствором пепсина 

при  + 37 °С в течение 10 мин. Препараты клеток с плотной оболочкой 

(амниоциты,  буккальный  эпителий,  сперматозоиды  и  др.)  обрабаты-

вать  40–50  мин.  Мазки  крови  обрабатывать  не  больше  1–2  мин  или 

совсем исключить обработку. 

  7. Отмыть препараты в растворе 1×PBS в течение 5 мин при ком-

натной температуре, при покачивании. 

  8.  Фиксировать  материал,  поместив  препараты  в  стакан  с  1 %-м 

раствором параформальдегида на 10–15 мин. Для препаратов мазков 

крови  или  гистологических  срезов  использовать  4%-й  раствор  пара-

формальдегида. 

  9. Отмыть препараты в течение 5 мин в растворе 1×PBS при ком-

натной температуре, при покачивании. 

  10. Дегидратировать препараты в серии спиртов (70°, 80°, 96° эта-

нол) по 5 мин в каждом.

  11. Высушить препараты на воздухе.

  12. Денатурировать ДНК хромосом при  + 70–72 °С 2 мин, поместив 

препараты в стакан (кювету) с раствором для денатурации. Для кле-

ток с плотной оболочкой продолжительность обработки и температуру 

увеличить — например, для клеток буккального эпителия оптималь-

но — 25 мин. при  + 76–80 °С. 

  13. Быстро перенести препараты в охлажденный до –20 °С 70%-й 

523

Приложение

раствор этанола на 2 мин. 

  14.  Дегидратировать  препараты  в  серии  охлажденных  до  –20 °С 

спиртов (70°, 80°, 96° этанол) по 5 мин в каждом.

  15. Высушить препараты на воздухе.

  16. Обработанные препараты сразу использовать для гибридизации или в 

течение нескольких дней хранить при  + 4 °С в коробке с осушителем. 

Примечание

  Все  процедуры  отмывок  препаратов  рекомендуется  проводить  в 

стаканах или кюветах для проводок на водяной бане-качалке.

5.4. Гибридизация in situ 

  Состав гибридизационной смеси и температурный режим являют-

ся параметрами, от которых зависит специфика гибридизации молекул 

ДНК-зонда  с  ДНК-мишени  (хромосомной  ДНК).  Поэтому  в  зависи-

мости от нуклеотидного состава и числа копий исследуемой последо-

вательности ДНК, а также задач, поставленных исследователем, могут 

изменяться: состав гибридизационной смеси (добавление или исклю-

чение некоторых компонентов — декстран сульфат, неионные детер-

генты и т. д.), содержание денатурирующего реагента — формамида 

(от 0 до 60 %) или концентрация солевых буферов (от 2 до 0,1×SSC) и 

температурный режим проведения гибридизации (от  + 37 до  + 42 °С). 

В данной главе приведены два Протокола, которые наиболее часто ис-

пользуются для диагностических целей в нашем центре. 

5.4.1. Гибридизация in situ с ДНК-зондами на основе высоко-(уме-

ренно) повторяющихся последовательностей и уникальных после-

довательностей, не содержащих большого количества интерспер-

сных повторов. 

Растворы

  1.Состав  гибридизационного  раствора  для  гибридизации  сател-

литных и альфоидных повторов* (конечная концентрация формамида 

55 %):

10 мкл — общий объем
 

7 мкл — гибридизационный буфер №1

Цитогенетика эмбрионального развития человека

524

— мкл — ДНК-зонд (10–30 нг) 

 — мкл — ДНК-носитель (20–50-кратный избыток по сравнению с 

ДНК-зондом) 
— мкл дистиллированной воды до 10 мкл
  *Проведение гибридизации в данном растворе при температуре  + 37 °С 

соответствует  условиям  средней  жесткости,  позволяющим  выявлять 

специфические для отдельных хромосом участки альфоидных после-

довательностей ДНК (исключение — хромосомы 13 и 21, 14 и 22, име-

ющие гомологичные участки альфоидной ДНК, подробнее см. [235]). 

  2. Состав гибридизационного раствора для гибридизации умерен-

ных повторов (конечная концентрация формамида 50 %):

10 мкл — общий объем
 

7 мкл — гибридизационный буфер №2

— мкл — ДНК-зонд (20–40 нг) 

— мкл — ДНК-носитель (50-кратный избыток по сравнению с ДНК зонда) 

— мкл дистиллированной воды до 10 мкл.
  3. Состав гибридизационного раствора для гибридизации уникаль-

ных последовательностей (конечная концентрация формамида 50 %): 

10 мкл — общий объем
 

7 мкл — гибридизационный буфер №2

— мкл — ДНК-зонд (100–200 нг) 

— мкл — ДНК-носитель (500-кратный избыток по сравнению с ДНК 

зонда) 
— мкл дистиллированной воды до 10 мкл.
Приготовление гибридизационных буферных растворов

  Буфер  №1  —  смешать  в  пробирке  10  г  декстран  сульфата,  1мл 

20×SSC,  5,5  мл  деионизированного  формамида  и  довести  объем  би-

дистиллированной  водой  до  7  мл;  смесь  растворить  при   + 40 °С  на 

шейкере; профильтровать через фильтр с диаметром пор 45 мкм. Гото-

вый буфер хранить при –20 °С.

525

Приложение

  Буфер №2 — приготовление и состав такие же, как для буфера №1, 

за исключением объема формамида — 5 мл. 

Протокол 5.9

  1. Приготовить  в  эппендорфовской  пробирке  гибридизационный 

раствор,  смешав  растворы  меченой  пробы  (проб)  и  ДНК-носителя  с 

нагретым до  + 37 °С гибридизационным буфером.

  2. Денатурировать пробу, поместив пробирку с гибридизационным 

раствором на кипящую водяную баню на 5–10 мин.

  3. Быстро перенести пробирку на лед. Не рекомендуется оставлять 

денатурированный зонд на льду более 30 мин.

  4. Нанести гибридизационный раствор на предварительно нагретые до 

37–38 °С препараты — по 10 мкл под покровное стекло 22×22 мм, и заклеить 

по периметру края покровных стекол резиновым клеем. Поместить препара-

ты в предварительно нагретую до  + 37–38 °С влажную камеру. 

  5. Инкубировать препараты 12–18 часов (ночь) при  + 37–38 °С.

Примечания

  1) Если  целью  исследования  является  одновременное  выявление 

двух и более последовательностей ДНК, в гибридизационный раствор 

следует добавить одновременно несколько проб, меченных по-разному 

модифицированными  нуклеотидами.  Концентрацию  ДНК-носителя 

при этом пропорционально увеличить.

  2) Если общий объем растворов меченой пробы и ДНК-носителя 

будет  больше  30 %  объема  гибридизационного  раствора,  то  один  из 

них или оба (растворы меченой пробы и ДНК-носителя) высушить с 

помощью лиофильной сушки или в термостате при  + 37 °С.

5.4.2. Супрессорная гибридизация in situ 

 

  Метод используется для гибридизации с большеразмерными ДНК-

зондами, содержащими значительное количество интерсперсных пов-

торяющихся последовательностей (ИПП) (например, геномными пос-

ледовательностями, клонированными в космидах или YAC, цельнохро-

мосомными и локус-специфическими пробами разной природы).

  Основное  отличие  данного  Протокола  от  Протокола  5.9  —  до-

полнительный  этап  предгибридизации  (супрессии)  ДНК-зонда  с 

конкурент ной ДНК, что необходимо для предотвращения перекрест-