Цитогенетика эмбрионального развития - часть 69

Цитогенетика эмбрионального развития человека

534

Протокол 6.1

1. На препарат под каждое покровное стекло 24×24 мм нанести 2 

капли  смеси  желатина  и  муравьиной  кислоты  (1  мл  кислоты  на  100 

мл желатины, смешивать непосредственно перед употреблением) и 1 

каплю (50–60 мкл) раствора серебра.

2. Инкубировать во влажной камере при 37 °С 20–60 мин, контро-

лируя интенсивность окраски визуально и под микроскопом.

3. По  окончании  окрашивания  (потемнение  до  серо-коричневого 

цвета красящей смеси и светлые желто-коричневые ядра на препарате) 

смыть покровные стекла проточной водой и поместить препараты на 

30 сек в гипосульфит натрия.

4. Промыть проточной водой и высушить.

5. Для  анализа  в  проходящем  свете  препараты  можно  докрасить 

раствором красителя Гимза, используя рутинный (Протокол 2.1) или 

G-метод (Протоколы 3.1, 3.2, 3.4). При анализе ЯОР-препаратов, окра-

шенных с помощью QFH-метода, необходимо комбинирование люми-

несцентного и проходящего освещения. 

Примечания

1. При перекрашивании препарата (окрашивание хромосом в ко-

ричневый цвет) инкубирование в гипосульфите можно продолжить, 

увеличив его концентрацию в растворе. Можно использовать с этой 

целью насыщенный раствор красной кровяной соли.

2. Успешное окрашивание существенно зависит от партии всех 

используемых реактивов.

3. На всех этапах следует соблюдать крайнюю осторожность, т. к. 

пятна серебра не поддаются полному удалению с оптики, одежды и 

пр.

6.2. Выявление районов, обогащенных 5-метилцитозином

 

Возможно  двумя  методами:  рестрикцией  с  последующей  ник-

трансляцией  in  situ  или  прямой  детекцией  5-метилцитозина  с  помо-

щью специфичных антител. 

535

Приложение

6.2.1. Ник-трансляция in situ 

6.2.1.1. Рестрикция

В качестве предобработок перед ник-трансляцией инкубировать 

препараты  метафазных  хромосом  с  эндонуклеазами  рестрикции 

MspI и HpaII. Рестриктазы являются изошизомерами и вносят раз-

рывы в последовательности С↓CGG, при этом HpaII в отличие от 

MspI расщепляет сайт, если внутренний цитозин не метилирован. 

Протокол 6.2

1. Провести  обработку  препаратов  рестриктазами  во  влажной 

камере  при  37 °С  в  течение  45  мин.  Под  покровные  стекла  22×50 

нанести  инкубационную  смесь,  состоящую  из  50  мкл  буферного 

раствора для MspI (Promega) или HpaII (Promega) и фермента в кон-

центрации 0,25 ед/мкл. 

2. Препараты отмыть в1×PBS с 0,5 М ЭДТА 5–10 минут, затем в 

1×PBS и высушить на воздухе. 

6.2.1.2. Реакция ник-трансляции in situ [143] 

Протокол 6.3

1. На препараты под покровные стекла 22×50 нанести по 60 мкл бу-

фера для ник-трансляции, содержащий 10 мМ ДТТ, 0,5 М Tris-HCl (pH 7,6), 

50 мM MgCl, Dig-11-dUTP (20 мкмоль) (Boehringer Mannheim), дАТФ, 

дГТФ, дЦТФ (по 20 мкмоль каждого), дТТФ (5 мкмоль) (СибЭнзим), 

ДНК-полимеразу I (0,01 ед/мкл), свободную от ДНКазной активности 

(Boehringer Mannheim), и инкубировать при 17 °С в течение 40 мин. 

2. Отмыть  препараты  в  5%-й  трихлоруксусной  кислоте  при  4 °С 

1 мин.

3. Отмыть в специальном буферном растворе (1 М Tris-HCl, 4 M 

NaCl, 2,5 M MgCl

2

) в течение 10 мин и в 1×PBS 5 мин.

4. Ополоснуть в дистиллированной воде и, не высушивая, нанести 

блокирующий раствор (Boehringer Mannheim) на 1×BPS и инкубиро-

вать 30 мин при 37 °С.

5. Детекцию  дигоксигенина  провести  с  использованием  антиди-

гоксигенин-флюоросцеина  в  концентрации  80  мкг/мл  (Boehringer 

Mannheim) 60 мин при 37 °С. 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

536

6. Отмыть  в  трех  сменах  1×PBS  c  0,1 %  Tween-20,  ополоснуть  в 

дистиллированной воде и высушить на воздухе. Препараты заключить 

в  фотозащитный  раствор,  содержащий  DABCO  и  красители  ДАПИ 

(1 мкг/мл) и пропидиум йодид (0,5 мкг/мл).

Примечание 

Для контроля специфичности реакции используют препараты:

а) инкубированные в буферном растворе без ферментов MspI или 

HpaII с последующей ник-трансляцией и детекцией ник-трансляцион-

ного сигнала; 

б) инкубированные в буферном растворе для ник-трансляции без 

ДНК-полимеразы I, после предварительной обработки хромосом фер-

ментами и последующей детекцией ник-трансляционного сигнала.

6.2.1.3. Анализ препаратов 

Включение  dig-11-UTP  регистрируют  по  распределению  флуо-

ресцент ных  сигналов.  Идентификацию  хромосом  проводят  с  помо-

щью дифференциального окрашивания DAPI.

Анализ препаратов проводят на универсальных микроскопах, на-

пример:

1. ЛЮМАМ  РПО  11  (ЛОМО),  оборудованном  объективами  СХ 

20×/0,45 и М-флюар 100×/1,30, тубусной оптикой с линзами от 1,1

х

 до 

1,6

х

, черно-белой CCD-камерой накопления сигнала (Chiper);

2. DMRXA  (Leica),  оборудованном  объективами  FLUOTAR 

40×/0,70  и  100×/1,30,  автоматической  фотонасадкой,  черно-белой 

CCD-камерой  накопления  сигнала  (Cohu)  в  проходящем  свете  и  с 

помощью блока светофильтров для флуорохромов FITC, DAPI и йо-

дистого пропидия. 

6.2.2.  Иммунофлуоресцентный  метод  детекции  5-метилцитозина 

на препаратах метафазных хромосом с помощью моноклональных 

антител

Протокол 6.4 [71]

1. Препараты  метафазных  хромосом  денатурировать  в  растворе 

2 М HCl в течение 25–30 мин при комнатной температуре. 

2. Провести через ледяной 1×PBS (рН 7,2–7,4), две смены 1×PBS 

537

Приложение

(pH 7,2–7,4) и две смены дистиллированной воды (по 2 мин) при ком-

натной температуре и высушить на воздухе. 

3. На  препараты  нанести  по  100  мкл  блокирующего  раство-

ра  (Boehringer  Mannhiem)  на  1×PBS  (pH  7,2–7,4)  (под  покров-

ное  стекло  24×60)  и  инкубировать  40  мин  во  влажной  камере  при 

температуре  + 37 °С. 

4. На  влажные  препараты  под  покровные  стекла  24×60  нанес-

ти  по  100  мкл  раствора  моноклональных  антител  к  5-метилцитози-

ну  (Eurogentec),  разведенных  в  блокирующем  растворе  (Boehringer 

Mannhiem) в соотношении 1 : 500, и инкубировать 60 мин во влажной 

камере при комнатной температуре в отсутствии света. 

5. Препараты отмыть в трех сменах 1×PBS (pH 7,2–7,4), содержа-

щего 0,5 % Tween 20, по 3 мин в каждой, на водяной бане при темпе-

ратуре 43 °С. 

6. На влажные предметные стекла нанести раствор моноклональ-

ных антител, конъюгированные с FITC (anti-mouse FITС, Sigma), раз-

веденных в блокирующем растворе (Boehringer Mannhiem) в соотно-

шении 1 : 50 (под покровное стекло 24×60), и инкубировать 60 мин во 

влажной камере при температуре  + 37 °С. 

7. Препараты отмыть в трех сменах 1×PBS (pH 7,2–7,4), содержа-

щего 0,5 % Tween 20, по 3 мин в каждой, на водяной бане при темпе-

ратуре 43 °С. 

8. Препараты ополоснуть в 1×PBS (pH 7,2–7,4) и дистиллирован-

ной воде, провести через серию спиртов 70°, 80°, 96° при комнатной 

температуре и высушить на воздухе.

9. Препараты  заключить  под  покровные  стекла  24×60  в  фотоза-

щитный раствор, содержащий DABCO, красители пропидиум йодид и 

DAPI в концентрации 1мкг/мл. 

6.2.2.1. Анализ препаратов

Связывание антител регистрируют по распределению флуоресцен-

тных сигналов.

Анализ препаратов проводят c помощью микроскопа DMLS (Leica), 

оборудованного объективами FLUOTAR 20×/0,40 и 100×/1,30–0,60, ав-

томатической фотонасадкой, цветной камерой Leica DFC 320, блоком 

светофильтров для флуорохромов FITC, DAPI и йодистого пропидия. 

Для  получения  видеоизображения  используют  программное  обеспе-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

538

чение  Leica  DFC Twain.  Для  анализа  видеоизображения  используют 

программное обеспечение Adobe Photoshop 7.0.

7. ПРОПИСИ БУФЕРНЫХ РАСТВОРОВ ДЛЯ ЦИТОГЕНЕТИЧЕ­

СКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 

7.1. Cтандартный фосфатный буфер Соренсена (рН 6,8) 

Раствор 1.  1/15  M  Na

2

HPO

4

  (23,8 г  Na

2

HPO

4 

×

 

12Н

2

О,  или  11,8 г 

Na

2

HPO

4 

×

 

2Н

2

О, дистиллированная вода до 1000 мл).

Раствор 2. 1/15 M KH

2

PO

4

 (9,1 г, дистиллированная вода до 1000 мл).

Смешать перед употреблением в соотношении 1:1.

7.2. Буферный раствор GKN, pH 7,8 (10-кратный) 

 глюкоза (D + ) — 550 мM (98,0 г) 

• 

 KCl — 540 мM (4,0 г) 

• 

 NaCl — 13,7 M (80,0 г) 

• 

 Na

• 

 2

CO

3

 — 40 мM (4,2 г) 

Дистиллированная вода до 1000 мл

Маточный раствор GKN расфасовать по 15–20 мл и хранить при 

 –20 °С. 

Перед употреблением развести в 10 раз.

Для получения рН 9,0 использовать 0,1 N NaOH.

Для получения рН 7,0 использовать 0,1 N HCl.

7.3. Буферный раствор SKN, pH 7,8

 сахароза — 6,6 мМ (2,26 г)

• 

 KCl — 54 мМ (0,4 г) 

• 

 NaCl — 1,37 M (8,0 г) 

• 

 Na

• 

2

CO

3

 — 4 мM (0,42 г)

Дистиллированная вода до 1000 мл

Для получения рН 9,0 использовать 0,1 N NaOH.

Для получения рН 7,0 использовать 0,1 N HCl.

539

Приложение

7.4. Буферные растворы SSC 

7.4.1. 20×SSC:

 3 М NaCl (174 г)

• 

 0,03 M цитрат Na (88,2 г безводной соли)

• 

Растворить в 800 мл дистиллированной воды. Довести рН до 7,0 с 

помощью 1 N HCl, добавить воды до 1000 мл. 

7.4.2. 2×SSC 

 0,3 М NaCl 

• 

 0,003 M цитрат Na 

• 

Рекомендуется приготовление из 20×SSC: к 100 мл раствора доба-

вить 900 мл воды.

7.4.3. 4×SSC 

 0,6 М NaCl 

• 

 0,006 M цитрат Na

• 

Рекомендуется приготовление из 20×SSC: к 200 мл раствора доба-

вить 800 мл воды.

7.5. Раствор версена 

 NaCl — 0,137 M (8,0 г)

• 

 KCl — 2,68 мM (0,20 г)

• 

 Na

• 

2

HPO

4

 — 8,06 мM (2,89 г Na2HPO4 . 12 Н

2

О)

 KH

• 

2

PO4 — 1,47 мM (0,20 г)

 Na

• 

2

ЭДТА — 1 мM (0,372 г)

Дистиллированная вода до 1000 г  

7.6. Na-фосфатный буфер (0,01 М)

Раствор 1. 0,1 М Na

2

HPO

4

 (35,8 г Na

2

HPO

4 

×

 12 Н

2

О, вода до 1000 мл)

Раствор 2. 0,1 М NaH

2

PO

4

 (15,6 г NaH

2

PO

4 

×

 2 Н

2

О, вода до 1000 мл)

Растворы хранить отдельно. Перед употреблением смешать по 5 мл и 

довести объем до 100 мл дистиллированной водой. 

7.7. Насыщенный солевой буферный раствор Дюльбекко, рН 7,2: 

Раствор 1. 

 NaCl — 0,137 M (8,0 г)

• 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

540

 KCl — 2,68 мM (0,20 г)

• 

 Na

• 

2

HPO

4

 — 8,06 мM (2,89 г Na

2

HPO

4

 × 12 Н

2

О)

 KH

• 

2

PO

4

 — 1,47 мM (0,20 г)

Дистиллированная вода до 1000 г  

Раствор 2. С

а

Cl

2

 — 0,006 М (1,0 г СаCl

2 

×

 2 Н

2

О в 1 л воды)  

Раствор 3. MgCl

2

 — 0,005 M (1,0 г MgCl

2

 × 6 Н

2

О в 1 л воды)

Растворы хранить отдельно. Перед употреблением к 160 мл раство-

ра 1 добавить по 20 мл растворов 2 и 3.

7.8. Цитратно-фосфатный буфер Мак-Ильвейна

Раствор 1. 0,2 М Na

2

HPO

4 

(71,6 г Na

2

HPO

4 

×

 12 Н

2

О, вода до 1000 мл)

Раствор 2. 0,1 M лимонная кислота (19,2 г, вода до 1000 мл)

Для получения 200 мл смешать растворы в следующих пропорциях:

рН 4,0 — 77,1 мл раствора 1 и 122,9 мл раствора 2

рН 4,2 — 82,8 мл раствора 1 и 117,2 мл раствора 2

рН 5,0 — 103,0 мл раствора 1 и 97,0 мл раствора 2

рН 5,4 — 111,5 мл раствора 1 и 88,6 мл раствора 2

рН 7,0 — 164,7 мл раствора 1 и 35,3 мл раствора 2

541

Буквенный 

код метода 

окраски 

хромосом*

Тип сегментации и способ выявления

Особенности  

микроскопии

Расшифровка кода 

Комментарии 

QFQ 

Q

-bands by 

F

luorescence using 

Q

uinacrine

Q-сегментация, выявленная 

при окрашивании акрихином 

и его производными (акри-

хин-ипритом, акрихин-про-

пилом и др.)

Спектральные харак-

теристики фильтров 

для анализа флу-

оресценции (нм): 

400–440/500–700

QFH

Q

-bands by 

F

luorescence using 

Ноесhst 33258

Q-подобная сегментация. 

В редких случаях яркие 

сегменты обозначают как 

Н-сегменты. Отличие от 

традиционного Q-рисунка, 

получаемого при окраске 

акрихином — яркая флуорес-

ценция районов 1qh, 9qh,  

15 cenh, 16qh, 22cenh

Ультрафиолетовый 

фильтр для анализа 

флуоресценции. Спек-

тральные характерис-

тики фильтров (нм) 

340–370/425–500 (оп-

тимальные 359/461) 

QFH/АсD

Q

-bands by 

F

luorescence using 

Ноесhst 33258 

countrastained by 

Actinomycin D

Модифицированный QFH-

рисунок. Совместное исполь-

зование лигандов, аффинных 

к АТ-парам оснований ДНК 

(Ноесhst 33258) и CG-парам 

(актиномицин D) приводит к 

усилению контраста между 

Q-позитивными и Q-негатив-

ными сегментами

Ультрафиолетовый 

фильтр для анализа 

флуоресценции. Спек-

тральные характерис-

тики фильтров (нм) 

340–370/425–500 (оп-

тимальные 359/461)

QFH/MG

Modified Q-bands 

by Fluorescence 

using Ноесhst 33258 

countrastained by 

methyl green

Модифицированный QFH-

рисунок со слабым контрас-

том между Q-позитивными и 

Q-негативными сегментами 

и ярко флуоресцирующими 

районами 1qh, 9qh, 15cenh, 

16qh, 22cenh 

Ультрафиолетовый 

фильтр для анализа 

флуоресценции. Спек-

тральные характерис-

тики фильтров (нм) 

340–370/425–500 (оп-

тимальные 359/461)

DAPI

Q-like bands by 
F

luorescence using 

DAPI

Q-подобный рисунок, анало-

гичный QFH

Ультрафиолетовый 

фильтр для анализа 

флуоресценции. Спек-

тральные характерис-

тики фильтров (нм) 

340–370/425–500 (оп-

тимальные 359/461)

DA/DAPI

Modified Q-bands by 

Fluorescence using 

DAPI countrastained 

by Distamycin A

Модифицированный QFH-

рисунок со слабым контрас-

том между Q-позитивными и 

Q-негативными сегментами 

и ярко флуоресцирующими 

районами 1qh, 9qh, 15cenh, 

16qh, 22cenh

Ультрафиолетовый 

фильтр для анализа 

флуоресценции. Спек-

тральные характерис-

тики фильтров (нм) 

340–370/425–500 (оп-

тимальные 359/461)

Таблица  1.  Характеристика  методов  дифференциального  окрашивания  хромосом, 

часто используемых в цитогенетике человека