Цитогенетика эмбрионального развития - часть 59

Цитогенетика эмбрионального развития человека

454

G-сегментов,  реплицирующихся  синхронно  с  гетерохроматином 

хромосом 1, 9, 16, существенно варьировали в зависимости от проис-

хождения клетки и от срока развития эмбриона. Так, если в цитотро-

фобласте у эмбрионов 5–7 недель развития общее число G-сегментов, 

реплицировавшихся одновременно с гетерохроматином достигало 150, 

а доля таких метафаз — 90

 

%, то в срок 12–13 недель эти показатели 

снизились более чем в два раза. В эмбриональных клетках в отличие 

от  цитотрофобласта  гетерохроматиновые  районы,  как  правило,  реп-

лицировались изолированно, и только в 30

 

% эмбриональных клеток 

была  зарегистрирована  одновременная  репликация  гетерохроматина 

и G-сегментов. Сравнение репликационной структуры хромосом 1, 2, 

3, 4, 5, 9, 11, 13, 14, 15, 16, 21 и 22 показало, что различия во времени 

репликации G-сегментов более выражены между цитотрофобластом и 

эмбриональными клетками у эмбрионов 5–7 недель, чем 12–13 недель 

развития (52 и 16 сегментов соответственно, Р < 0,05) [701].

Феномен  тканеспецифичных  и  стадиоспецифичных  различий  во 

времени репликации сегментов может быть обусловлен несколькими 

причинами. Наиболее вероятно, что одной из них являются различия 

в параметрах клеточного цикла, другой — изменение транскрипцион-

ной активности генов, локализованных в изучаемых сегментах. Если 

исходить из постулата, что цитологической характеристикой консти-

тутивного  гетерохроматина  является  репликация  в  конце  S-фазы,  то 

есть позже по сравнению с другими сегментами хромосом [158, 610], 

то  уменьшение  реплицирующихся  синхронно  с  гетерохроматином 

G-сегментов можно объяснить их более ранней репликацией. Прини-

мая во внимание, что в G-сегментах преимущественно локализованы 

тканеспецифичные гены [568], нельзя исключить, что их транскрип-

ционная активность необходима для конечных этапов формирования 

хорион-аллантоидной  плаценты,  завершающегося  к  13  неделям  раз-

вития  [49].  Незначительное  число  таких  «рано  реплицирующихся»  

G-сегментов в эмбриональных клетках в срок 5–12 недель, возможно, 

связано с необходимостью функционирования многих генов в этот пе-

риод активного органогенеза. С другой стороны, возможно, что репли-

кация гетерохроматина в цитотрофобласте хориона начинается рань-

ше,  чем  в  эмбриональных  клетках.  Если  последнее  предположение 

справедливо, то следует признать, что в гетерохроматиновых районах, 

по крайней мере, некоторых хромосом локализованы гены, функцио-

455

Глава 10.

 структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

нально активные только в эмбриональный период развития и именно  

в цитотрофобласте хориона.

Особое  внимание  обращали  на  себя  различия  между  гомологич-

ными хромосомами по интенсивности сигнала АТ-БДУ, вплоть до его 

полного отсутствия, в районах 1q12, 1p31, 1q31, 9q12, 9p21, 16q11.2, 

16p12,  16q21.  Вероятно,  отсутствие  сигнала  или  его  слабая  интен-

сивность,  отражают  различия  во  времени  и  в  активности  процессов 

репликации гомологичных районов. Эта асинхронность не зависела от 

тканевого происхождения клеток и наблюдалась у разных эмбрионов в 

20–50

 

% метафазных пластинок. Таким образом, по уровню асинхрон-

ности репликации гетерохроматиновые районы и некоторые G-сегмен-

ты хромосом 1, 9 и 16 соответствовали импринтированным локусам. 

Наряду с гетерологичностью метилирования гомологичных хромосом, 

асинхронность их репликации, возможно, свидетельствует о различ-

ной функциональной значимости хромосом отцовского и материнско-

го происхождения в эмбриогенезе человека. Однако это предположе-

ние нуждается в дополнительных специальных исследованиях.

Еще  один  интересный  факт  касается  наличия  клеток  с  разновре-

менной репликацией гетерохроматиновых районов разных хромосом. 

Так, например, в цитотрофобласте на некоторых метафазных пластин-

ках включения БДУ были зарегистрированы только в районе 16qh, в 

то время как в гетерохроматине хромосом 1 и 9 флуоресцентных сиг-

налов обнаружено не было. На других метафазных пластинках БДУ 

содержали  районы  9q12  и  16q11.2  при  отсутствии  сигнала  в  районе 

1q12. При этом одновременно с гетерохроматином реплицировались 

некоторые  G-сегменты,  что  характерно  для  начала  поздней  S-фазы. 

На некоторых метафазных пластинках одновременно с G-сегментами 

реплицировался только прицентромерный гетерохроматин хромосомы 

1, на других — районы 1q12 и 16q11.2, в то время как в районе 9q12 

включение БДУ не обнаружено. По сочетанию включения БДУ в гете-

рохроматиновые районы хромосом эмбриональных клеток также мож-

но выделить несколько вариантов.

Причина этих хромосом-специфичных моделей репликации неко-

торых G-сегментов и гетерохроматиновых районов хромосом 1, 9 и 16 

остается неясной. Скорее всего, они обусловлены различиями во вре-

мени начала и окончания репликации. Поскольку варианты сочетания 

одновременной репликации разных сегментов хромосом в эмбриональ-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

456

ных клетках и цитотрофобласте различны, нельзя исключить, что они 

маркируют  клетки  разной  степени  дифференцировки.  К  сожалению, 

на хромосомных препаратах определить принадлежность метафазной 

пластинки к какому-либо типу ткани не представляется возможным. 

Тем не менее, на «прямых» препаратах из хориона, где нами установ-

лено  две  репликационные  модели,  метафазные  пластинки  представ-

лены  только  клетками  Лангханса,  активная  пролиферация  которых  

в I триместре необходима для образования и поддержания собственно 

цитотрофобласта и для дифференцировки синцитиотрофобласта, по-

крывающего ворсины хориона. В то же время наличие большего числа 

моделей репликации в клетках эмбриональных тканей вполне согласу-

ется с активной пролиферацией и дифференцировкой клеток всех ти-

пов тканей в период органогенеза. Полученные результаты подтверж-

дают  данные  о  тканеспецифичности  порядка  репликации  отдельных 

сегментов хромосом в разных тканях, которая была обнаружена для 

лимфоцитов и фибробластов человека в постнатальном периоде онто-

генеза человека [158, 419].

Таким образом, различия в характере репликации районов гетеро-

хроматина хромосом 1, 9 и 16 являются ткане- и стадиоспецифичными 

и  подтверждают  различный  функциональный  статус  этих  районов  в 

эмбриональных и экстраэмбриональных тканях на разных стадиях эм-

бриогенеза человека.

Заключение

В главе суммированы данные о морфофункциональных особеннос-

тях хромосом человека на разных, преимущественно ранних постимп-

лантационных стадиях развития. Основная часть приведенных резуль-

татов вполне оригинальна, так как получена на прямых хромосомных 

препаратах из ворсин хориона (цитотрофобласт) или различных тканей 

собственно эмбриона человека. Данный метод делает реальным анализ 

метафазных хромосом уже через несколько часов после получения ма-

териала и позволяет избежать влияния культивирования на структур-

но-функциональные характеристики хромосом.

Основное  внимание  обращено  на  изучение  районов  ядрышковых 

организаторов  (ЯОР)  и  конститутивного  гетерохроматина,  паттерн 

метилирования метафазных хромосом, особенности их морфологии и 

репликации на разных стадиях эмбриогенеза.

457

Глава 10.

 структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

Установлено, что среднее число Ag + ЯОР на метафазную пластинку 

и их общая активность в эмбриональных и экстраэмбриональных (хо-

рион) тканях не зависят от стадии эмбриогенеза. Основной причиной 

полиморфизма ЯОР хромосом у эмбрионов человека является комбина-

торика родительских ЯО-хромосом, функциональный статус которых 

наследуется как стабильный признак большинством (76

 

%) хромосом. 

Вместе с тем, в период с 8 до 14 недель развития отмечается возраста-

ние суммарной транскрипционной активности кластеров рибосомных 

генов,  которое  обусловлено  большей  функциональной  активностью  

р-генов хромосом группы G (21 и 22) по сравнению с хромосомами 

группы D (13, 14 и 15). Нельзя поэтому исключить реальное существо-

вание  молекулярных  механизмов  репрессии — дерепрессии  р-генов, 

регулирующих их активность во время нейруляции, активного орга-

ногенеза и плацентации. Увеличение активности экспрессии р-генов 

отмечается на более поздних стадиях эмбриогенеза и у плодов с тяже-

лыми пороками развития. При нормальном кариотипе у плода измен-

чивость  характера  Ag-окраски  ЯОР  более  свойственна  хромосомам 

группы G. Наличие дополнительной ЯО-хромосомы в кариотипе плода 

сопровождается увеличением числа хромосом группы D с вариабель-

ными ЯОР и приводит к возрастанию общей транскрипционной актив-

ности р-генов. При трисомиях 21 и 13 изменчивость функционального 

статуса  ЯОР  не  связана  с  происхождением  ЯО-хромосом,  тогда  как 

при нормальном кариотипе у плода характер Ag-окраски сохраняется 

неизменным на хромосоме 15, унаследованной от матери.

Исследования с помощью двух вариантов метода ник-трансляции 

(предобработка  ДНКазой I  детектирует  конформационные  особенно-

сти ДНК, а предобработка хромосом рестриктазами MspI и HpaII вы-

являет гипометилированные участки ДНК) дали сходные результаты 

и  позволили  получить  принципиально  новые  данные  относительно 

расположения  на  метафазных  хромосомах  функционально  активных 

районов в зависимости от типа ткани и стадии развития. Эти наблюде-

ния были дополнены морфометрическим анализом размеров соответ-

ствующих  гетерохроматиновых  районов  в  клетках  цитотрофобласта 

хориона и эмбриональных тканей.

Наиболее значимые результаты включают: различия в уровне ме-

тилирования некоторых гомологичных сегментов хромосом из клеток 

цитотрофобласта и из клеток эмбриональных тканей, различия в ме-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

458

тилировании  гомологичных  сегментов  хромосом  из  клеток  хориона 

в  сравнении  с  аналогичными  сегментами  хромосом  из  лимфоцитов 

взрослых,  гипометилированность  районов  прицентромерного  хрома-

тина в клетках цитотрофобласта.

1.  Гетерологичность  метилирования  выражена  наиболее  четко  для 

сегментов 2q11–13, 11p15 и Xq24–27 в клетках цитотрофобласта и для 

сегментов 15q11–13 в эмбриональных клетках. Есть основания предпола-

гать, что именно в этих районах функционально активны гены только од-

ного гипометилированного гомолога, контролирующие развитие хориона 

и плаценты (2q11–13, 11p15, Xq24–27) и дифференцировку собственно 

эмбриональных тканей (15q11–13). Идентичные гены тех же сегментов 

другого гомолога, по всей вероятности, остаются импринтированными и 

функционально неактивными. Уместно отметить, что именно в сегментах 

хромосом 11 и 15, отличающихся степенью метилирования, локализова-

ны крупные кластеры импринтированных генов.

2. Различия в интенсивности флуоресценции антител к 5-метилци-

тозину на хромосомах лимфоцитов взрослого и плода особенно харак-

терны для сегментов 2q33, 6p11.2, 13q22. Гиперметилированность этих 

сегментов в лимфоцитах пуповинной крови позволяет предполагать, 

что  гены  соответствующих  сегментов,  скорее  всего,  функционально 

неактивны в период внутриутробного развития.

3. Установлены существенные отличия в состоянии блоков прицен-

тромерного гетерохроматина в хорионе и эмбриональных тканях — ги-

пометилированность и слабая степень спирализации гетерохроматина 

в  цитотрофобласте,  гиперметилированность  и  высокая  степень  спи-

рализации в эмбриональных клетках. На основании этих результатов 

сформулирована гипотеза о наличии в околоцентромерном хроматине 

хромосом 9 и 16 «ранних» генов, продукты которых необходимы для 

обеспечения роста хориона, формирования плаценты и их нормально-

го функционирования. Не исключено, что в гетерохроматине локали-

зованы гены пролиферации и клеточного роста, а также факторы их 

регуляции,  активация  и  инактивация  которых  осуществляется  путем 

изменения характера метилирования.

Эти  результаты  хорошо  согласуются  с  данными  морфометриче-

ского анализа, свидетельствующими об увеличении размеров С-блоков 

хромосом 1, 9 и 16 в экстраэмбриональных тканях у плодов человека в 

первом триместре беременности.

459

Глава 10.

 структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

Определенное сходство между хорионом и опухолями в отношении 

параметров клеточного цикла, предрасположенности к гетероплоидии, 

уровню метилирования позволяет высказать предположение, что неко-

торые онкогены, многие из которых, как известно, играют важную роль 

в эмбриогенезе, активны и в клетках хориона. По крайней мере, часть 

таких  генов  локализована  в  гетерохроматине.  Можно  надеяться,  что 

полная расшифровка первичной структуры генома человека, включая 

и области гетерохроматина, идентификация всех генов и выяснение их 

функций позволят решить проблему гетерохроматина, в том числе по-

лучить ответ на вопрос о наличии в его составе структурных генов.

Использование моноклональных антител к 5-метилцитозину позво-

лило обнаружить и описать новый тип сегментации метафазных хро-

мосом человека, который мы назвали М-сегментацией. Предваритель-

ные данные, полученные на зародышах человека, свидетельствуют о 

наличии количественных и качественных различий паттернов метили-

рования метафазных хромосом на разных стадиях эмбриогенеза чело-

века. Характерным для эмбрионов ранних доимплантационных стадий 

является  гемиметилированность  хромосом.  Дефинитивный  рисунок 

метилирования хромосом начинает определяться только на стадии мо-

рулы — ранней бластоцисты. У плодов 20–24 недель развития отме-

чаются существенные отличия паттерна метилирования многих локу-

сов от гомологичных им локусов хромосом из лимфоцитов взрослых 

индивидуумов. Не исключено, что выявленные различия в характере 

метилирования метафазных хромосом и их гомологичных сегментов 

отражают существенные особенности функциональной активности ге-

нов этих сегментов на разных стадиях онтогенеза.

Полученные данные, основанные на визуальной оценке интенсив-

ности флуоресценции, носят ориентировочный характер. Для точной 

оценки таких различий необходимо не только сравнение денситомет-

рических профилей М-рисунка, но и насыщенность физических карт, 

а также сведения об экспрессионных профилях соответствующих кле-

ток на разных стадиях онтогенеза.

Дальнейшие  углубленные  исследования  особенностей  паттернов 

метилирования  метафазных  хромосом  в  разных  тканях  и  на  разных 

стадиях эмбриогенеза могут дать ценную новую информацию об осо-

бенностях функции генома в эмбриогенезе человека.

ГлАвА 11 

ГориЗоНТЫ ЦиТоГеНеТиКи

 ЭМБриоНАлЬНоГо рАЗвиТиЯ ЧеловеКА

введение 

Цитогенетика развития человека — сравнительно новое направле-

ние  на  стыке  многих  фундаментальных  (генетика,  молекулярная 

биология,  эмбриология,  физиология)  и  прикладных  (медицинская 

генетика,  пренатальная  диагностика,  репродуктология)  направлений 

современной науки. Задачи цитогенетики развития тесно смыкаются 

с  проблемами  феногенетики,  общей  генетики  и  биологии  развития. 

Качественное своеобразие цитогенетики эмбрионального развития на 

современном этапе определяется не только доступностью эмбриональ-

ного материала и гамет человека практически на любой стадии разви-

тия,  но  и  огромными  успехами  клеточной  биологии  и  цитогенетики 

в изучении тонкой структуры хромосом и их поведения в митозе и в 

мейозе, бурным развитием методов молекулярной цитогенетики. На-

конец, огромные перспективы для цитогенетики открывает заверше-

ние расшифровки генома человека и картирование непосредственно на 

хромосомах генов, число которых к концу 2004 года достигло 15

 

000. 

Последнее обстоятельство позволяет уже сегодня говорить о цитоге-

номике эмбрионального развития, имея при этом в виду исследование 

надмолекулярных  (хромосомных)  механизмов  регуляции  генной  ак-

тивности в процессе онтогенеза.

Сравнительно небольшой объем информации, приведенной в пре-

дыдущей главе, отчасти объясняется тем, что, по убеждению авторов, 

реальные сведения по цитогенетике эмбрионального развития человека 

могут быть получены лишь при использовании прямых хромосомных 

препаратов из гамет или тканей развивающихся зародышей. Использо-

вание для этих целей культивируемых клеток не позволяет объективно 

461

Глава 11. 

Горизонты цитогенетики эмбрионального развития человека

оценить структурно-функциональные особенности интерфазного ядра 

и хромосомного аппарата, которые в условиях in vitro всегда претер-

певают  значительные  изменения.  Не  случайно  основные  результаты 

по цитогенетике эмбрионального развития млекопита ющих были по-

лучены  на  прямых  хромосомных  препаратах  в  условиях  модельных 

экспериментов на лабораторных мышах, главным образом, на мышах 

с различными хромосомными транслокациями [11, 14, 18, 21, 56, 249, 

250, 251, 380].

В  данной  главе  проведено  сравнение  основных  положений  цито-

генетики  эмбрионального  развития  млекопитающих  с  таковыми  у 

человека,  намечены  наиболее  актуальные  направления  дальнейших 

исследований, представляющих несомненный интерес для фундамен-

тальной науки и практической медицины.

Нам  представляется,  что  существенный  прогресс  в  цитогенетике 

(цитогеномике)  эмбрионального  развития  человека  может  быть  до-

стигнут при решении следующих основных вопросов.

Как  происходит  формирование  дефинитивной  трехмерной 

 

●

структуры ядра зародыша после оплодотворения яйцеклетки? 

Каковы хромосомные аспекты клеточной дифференцировки?

Наблюдается  ли  при  оплодотворении  и  на  первых  делениях 

 

●

дробления феномен конъюгации гомологичных хромосом?

Что представляют собой паттерны метилирования хромосом в 

 

●

провизорных органах и собственно в тканях плода на разных 

стадиях эмбриогенеза?

Каковы  особенности  метилирования  гетерохроматиновых 

 

●

районов?

Какова функциональная роль гетерохроматина?

 

●

Имеются ли различия в функциональной активности гомоло-

 

●

гичных хромосом?

Каков генез спонтанных хромосомных нарушений у доимплан-

 

●

тационных зародышей?

Какие  факторы  определяют  феногенетику  хромосомных  ано-

 

●

малий?

Ответы на эти вопросы имеют принципиальное значение для цито-

геномики эмбрионального развития человека. Для удобства изложения 

они могут быть подразделены на 5 групп: 1) особенности структур-

но-функциональной организации хромосом в развитии, 2) гетерохро-