содержание .. 55 56 57 58 ..

Цитогенетика эмбрионального развития - часть 57

Цитогенетика эмбрионального развития человека

438

хромосом из лимфоцитов взрослых. Особенно значительные различия

отмечены для хромосомных сегментов 2q33, 6p11.2 и 13q22, интенсив-

ность флуоресценции которых в фетальных лимфоцитах на 2 балла пре-

вышала таковую во взрослых лимфоцитах. Анализ генетического соста-

ва этих сегментов показывает, что в 2q33 локализованы гены CTLA–4

(цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный протеин), ICOS,

AILIM (ответственные за взаимодействие Т- и В-лимфоцитов), ADAM3

(контролирующий синтез металлопротеинов), в 13q22 — семейство ге-

нов, регулирующих синтез факторов некроза тканей (TNFRCF) и эндо-

телиновый рецептор (EDNRB). Не исключено, что во время эмбриогене-

за функция этих генов, столь важная в постнатальном развитии, может

быть подавлена. Их включение (деметилирование) происходит на более

поздних стадиях онтогенеза.

Таким образом, выявленные различия в характере метилирования мета-

фазных хромосом и их гомологичных сегментов в однотипных клетках

могут отражать существенные особенности функциональной активности

генов, входящих в состав этих сегментов, на разных стадиях онтогенеза.

Примечательно, что уровень метилирования прицентромерного ге-

терохроматина хромосом 1, 9, 16 в лимфоцитах периферической и пу-

повинной крови также варьировал. Интенсивность флуоресценции ге-

терохроматина хромосом 1 и 16 в лимфоцитах плода и взрослого всегда

была высокой (4 балла) и не зависела от размера блока. Для района 9q12

был характерен сигнал меньшей интенсивности, который соответство-

вал 3 баллам в лимфоцитах взрослых и 2 баллам в лимфоцитах пло-

дов. Напомним, что в состав гетерохроматина хромосомы 9 преиму-

щественно входят сателлиты III и β, более богатые CG-основаниями по

сравнению с сатДНК других классов. Поэтому слабая интенсивность

флуоресцентного сигнала района 9qh по сравнению с другими гетерох-

роматиновыми блоками, вероятно, детерминирована его гипометили-

рованным состоянием, особенно выраженным в клетках плода.

Нет сомнения, что данные по интенсивности флуоресценции сиг-

налов, полученные при визуальной оценке, носят ориентировочный

характер. Для точной регистрации различий необходимо сравнение

денситометрических профилей М-рисунка, а для понимания их при-

чин — сведения не только о генном составе сравниваемых сегментов,

но и об экспрессионных профилях соответствующих клеток на разных

стадиях онтогенеза.

439

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

10.4.2.2. общая характеристика

М-сегментации хромосом у эмбрионов 5–8 недель развития

Пилотное исследование, проведенное нами на «прямых» препа-

ратах из хориона и эмбриональных тканей плода у двух эмбрионов

с нор маль ным кариотипом 5/6 недель развития, показало, что в целом

число и распределение М-сегментов по хромосомам в эмбриональ-

ных клетках соответствует М-сегментации хромосом лимфоцитов

(рис. 10.26 а, б)

. Однако, если в лимфоцитах гетероморфизм гомо-

логов по интенсивности флуоресценции АТ–МеС касался только

районов 1qh, 9qh, 16qh и коротких плеч хромосом групп D и G, то

в клетках эмбрионов I триместра развития такие различия обнару-

жены для большинства хромосом набора. Аналогичное явление

отмечалось нами при анализе статуса метилирования хромосом

в цитотрофобласте хориона методом ник-трансляции in situ с пре-

добработками ДНКазой1 и рестриктазой НраII (см. раздел 10.2.6).

Сравнение локализации гомологичных сегментов, отличающихся

по интенсивности флуоресценции АТ–МеС и ник-трансляционного

сигнала, показало, что спектр таких сегментов зависит от метода де-

текции метилированных участков. Например, доказанные методом

ник-трансляции с предобработкой НраII различия по уровню мети-

лирования локуса 15q11-q13 в эмбриональных клетках (рис. 10.17)

оказались не выявлены иммуноцитохимическим методом (рис. 10.26,

а, б)

. Дискордантность полученных результатов в значительной мере

определяется разрешающей способностью методов. Считается, что

иммуноцитохимический метод уступает в чувствительности методу

ник-трансляции in situ, опосредованной рестриктазами, и мало при-

годен для детекции различий в степени метилирования хромосом на

уровне отдельных сегментов [610]. Между тем, тканеспецифичные

различия по степени метилирования гомологов в импринтирован-

ном локусе — 11р15 подтверждаются двумя обсуждаемыми метода-

ми (рис. 10.18 и 10.26 а – в)

. Не вызывают сомнения также межтка-

невые различия в уровне метилирования районов прицентромерного

гетерохроматина хромосом 1, 9 и 16, наглядно продемонстрирован-

ные как при использовании метода ник-трансляции (рис. 10.19)

, так

и при помощи АТ–МеС (рис. 10.26, а – в)

. Однако вывод о различ-

ном уровне метилирования R- и G-сегментов гомологичных хромо-

Рисунок на цв. вкл.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

440

сом в разных тканях, основанный на визуальной оценке интенсив-

ности флуоресцентных сигналов, требует серьезных доказательств,

которые могут быть получены путем кропотливого анализа особен-

ностей М-сегментации хромосом в клетках, имеющих различное эм-

бриональное происхождение.

10.4.2.3. особенности М-рисунка хромосом

у эмбрионов доимплантационных стадий развития

Особый интерес представляет исследование статуса метилирова-

ния метафазных хромосом у эмбрионов человека ранних стадий разви-

тия. С этой целью нами предпринят анализ М-сегментации хромосом у

дробящихся зародышей, полученных по программам экстракорпораль-

ного оплодотворения. Все эмбрионы после регистрации трех пронук-

леусов были признаны непригодными для трансплантации.

Прежде всего, следует отметить нечеткость М-сегментации

(рис. 10.27–10.31)

, которая, по-видимому, обусловлена не столько ус-

ловиями приготовления препаратов из дробящихся зародышей, сколь-

ко особенностями метилирования хромосом на этих стадиях развития.

В целом, типичными для хромосом 2–8-клеточных эмбрионов оказа-

лись невысокая интенсивность флуоресценции и наличие гемимети-

лирования (метилирование только одной хроматиды). При этом боль-

шинство хромосом в бластомерах имели точечные сигналы АТ–МеС,

и лишь некоторые — ярко выраженные М-сегменты. Вероятно, наблю-

даемая картина отражает активно происходящие процессы деметили-

рования на этих стадиях развития.

Первые М-сегменты появляются на отдельных хромосомах, начи-

ная со стадии 8 бластомеров (рис. 10.31)

и становятся характерными

для большинства хромосом на стадии бластоцисты. М-рисунок хро-

мосом на стадии бластоцисты тождественен или приближается к тако-

вому в лимфоцитах пуповинной крови. Однако данный вывод требует

более строгих экспериментальных подтверждений.

Гемиметилирование четко определяется в отдельных хромосомах,

начиная со стадии двух бластомеров и, вероятно, обусловлено пассив-

ным деметилированием, т. е. отсутствием метилирования в дочерней

хроматиде. Наличие гемиметилированных хромосом на ранних стади-

ях дробления ранее было описано у зародышей мышей [307] и круп-

Рисунок на цв. вкл.

441

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

ного рогатого скота [325]. В то же время у зародышей кроликов и овец

процессы деметилирования генома происходят с задержкой на 2–3 де-

ления дробления [671, 902].

У эмбрионов на стадии морулы, когда активизируется процесс ме-

тилирования de novo, выявлены хромосомы, в которых одна хроматида

была полностью, а другая лишь частично метилирована (рис. 10.29)

Характерными для отдельных гемиметилированных хромосом были

и сестринские хроматидные обмены, то есть обмены метилированными

и неметилированными сегментами сестринских хроматид (рис. 10.27)

Ранее сестринские хроматидные обмены были зарегистрированы при

культивировании дробящихся зародышей мышей в среде с добавлением

бромдезоксиуридина [143], а сравнительно недавно были обнаружены и у

других млекопитающих при использовании АТ–МеС [307].

Особый интерес представляло сравнение паттернов метилирования

гомологичных хромосом у эмбрионов на доимплантационных стадиях

развития. При полной идентичности QFH-рисунка всех гомологичных

хромосом в различных клетках некоторые хромосомы в бластомерах

резко отличались по интенсивности флуоресценции АТ–МеС. Напри-

мер, два гомолога из триады хромосом 17 оказались гипометилиро-

ванными, тогда как в одном гомологе М-сегментация выявлялась уже

на стадии 8 бластомеров (рис. 10.29)

. Учитывая, что у триплоидных

зародышей человека, возникающих в условиях in vitro преимущест-

венно вследствие диспермного оплодотворения, удвоены хромосомы

отцовского происхождения, именно они, скорее всего, и оставались ги-

пометилированными по сравнению с хромосомой материнского про-

исхождения. Заметные отличия статуса метилирования определяются

и для гомологов других хромосом в метафазных пластинках трипло-

идных 8-бластомерных зародышей (рис. 10.30)

. Асинхронность ме-

тилирования гомологов, по-видимому, отражает исходные различия в

состоянии метилирования хромосом мужского и женского пронуклеу-

сов [902]. Деметилирование отцовского генома у мышей, свиней, а по

некоторым данным, и у человека происходит уже на стадии пронуклеу-

сов, тогда как хромосом ооцита — только во время делений дробления

[671]. По-видимому, именно отцовские хромосомы остаются гипоме-

тилированными и во время первых делений дробления у триплоидных

зародышей андрогенетического происхождения. Учитывая большое

Рисунок на цв. вкл.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

442

значение процессов метилирования для функциональной активности

генов, этот феномен требует более строгих экспериментальных доказа-

тельств. В частности, особенно важным представляется сравнение ста-

туса метилирования гомологов разного родительского происхождения

и его сопоставление с данными о функциональной активности генов,

локализованных в этих хромосомах. Известно, что у доимплантацион-

ных зародышей мышей экспрессируется около 10 000 генов, многие из

которых (примерно 4

%) активны только на этих ранних стадиях разви-

тия [564]. В каких хромосомах человека локализованы «ранние» гены,

как их активность коррелирует с состоянием метилирования, зависит

ли она от родительского происхождения остается неизвестным и за-

служивает серьезных дополнительных исследований.

Не менее интересным, а в функциональном значении и более за-

гадочным, является гипометилированное состояние прицентромерных

гетерохроматиновых блоков хромосом 1, 9 и 16, которое сохранялось

вплоть до стадии бластоцисты. Как уже упоминалось выше, гипоме-

тилированные блоки конститутивного гетерохроматина являются ха-

рактерной особенностью хромосом цитотрофобласта хориона. Вместе

с тем, в клетках других тканей у эмбрионов в 5–12 недель развития, а

также в цитотрофобласте плаценты и лимфоцитах пуповинной крови

(второй триместр беременности) районы 1qh, 9qh и 16qh обнаружи-

вали интенсивную флуоресценцию АТ–5МеС, что свидетельствовало

об их гиперметилированном состоянии (рис. 10.32)

. Следовательно,

паттерн метилирования гетерохроматина варьирует в зависимости от

стадии развития.

Если гипометилированное состояние является характерным свой-

ством гетерохроматина хромосом 1, 9, 16 и Y мужского пронуклеу-

са [493], то имеет ли функциональное значение гипометилирование

кон ститутивного гетерохроматина в женском пронуклеусе, или оно

является простым следствием глобального деметилирования гено-

ма на этой стадии развития? Почему деметилированное состояние

гетеро хроматина обоих гомологов характерно для хромосом цитотро-

фобласта на протяжении I триместра и меняется на метилированное

в плодный период? На какой стадии начинается метилирование этих

блоков в плаценте? Почему те же гетерохроматиновые блоки на обоих

гомологах оказываются метилированными у эмбрионов в период ак-

Рисунок на цв. вкл.

443

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

тивного органогенеза? Что реально стоит за этим феноменом? Эти и

другие вопросы остаются пока без ответа и заслуживают дальнейшего

изучения.

Считается, что районы прицентромерного гетерохроматина не со-

держат структурных генов и не участвуют в процессах транскрипции.

Вместе с тем, предположения об участии этих районов в регуляции

работы ближайших к ним генов, контролирующих ранние стадии раз-

вития у человека [134, 637, 878] получают многочисленные подтверж-

дения. Не исключено, что именно в них находятся блоки транспозонов,

а также повторяющихся последовательностей, продукты которых, как

было недавно установлено, играют важную роль в обеспечении функ-

циональной активности генов на начальных стадиях эмбриогенеза

млекопитающих [760].

Следует обратить внимание на то, что наши исследования были

проведены на триплоидных эмбрионах доимплантационных стадий

развития. Отражают ли данные, полученные на триплоидных зароды-

шах, реальную динамику процессов метилирования/деметилирования

хромосом у нормальных диплоидных зародышей человека остается

неизвестным. Существенно подчеркнуть, что развитие триплоидных

зародышей человека происходит медленнее, чем зародышей с нор-

мальным кариотипом; они имеют пониженную жизнеспособность и

для них характерны множественные врожденные пороки. Однако не-

которые триплоидные эмбрионы сохраняют способность не только к

имплантации и внутриутробному развитию, но и к живорождению.

Возможно, что метилирование как один из механизмов регуляции ран-

него развития человека, способно компенсировать хромосомный дис-

баланс путем инактивации дополнительного хромосомного материала,

по крайней мере, в отдельных районах хромосом, возможно, наиболее

значимых для определенного этапа эмбрионального развития, как это

было показано нами на примере трисомии 13 и 16 [145].

Гипометилирование генома бластомеров дробящихся зародышей,

асимметричность рисунка метилирования (гемиметилирование) хро-

мосом при первых делениях дробления, сменяющаяся типичной кар-

тиной М-сегментации хромосом на стадии морулы — бластоцисты,

сестринские обмены, регистрируемые на гемиметилированных хромо-

сомах — все эти особенности метилирования у доимплантационных

зародышей человека описаны нами впервые [125]. Ранее эти особен-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

444

ности паттерна метилирования были отмечены у зародышей ранних

стадий развития других млекопитающих [260, 307, 516, 902]. В наших

исследованиях обнаружены, по крайней мере, две особенности мети-

лирования хромосом человека, ранее не отмеченные у других млеко-

питающих: существенные различия в метилировании гомологичных

хромосом и отсутствие метилирования блоков гетерохроматина хро-

мосом 1, 9, 16 независимо от их родительского происхождения.

Таким образом, паттерн метилирования метафазных хромосом за-

родышей человека доимплантационных стадий развития имеет ряд

важных особенностей, отличающих его от такового у эмбрионов и

плодов человека более поздних стадий развития. В этой связи осо-

бый интерес приобретают исследования особенностей метилирования

метафазных хромосом эмбриональных стволовых клеток человека,

получаемых при культивировании бластоцисты [149]. В какой мере

хромосомы эмбриональных стволовых клеток сохраняют статус мети-

лирования, свойственный доимплантационным зародышам является

предметом наших дальнейших исследований.

В заключение уместно напомнить, что иммуноцитохимический ме-

тод с использованием специфических антител не позволяет судить о

метилировании, то есть о функциональном состоянии единичных ге-

нов и позволяет выявлять только сравнительно крупные фрагменты

хромосом с высокой концентрацией метилированных CpG-динуклео-

тидов. Более четкая информация о паттерне функциональной актив-

ности хромосом в эмбриогенезе человека, в том числе при клеточной

и тканевой дифференцировке может быть получена только в условиях

комплексных цитогенетических, молекулярных и биохимических ис-

следований зародышей ранних стадий развития.

10.5. Морфометрические характеристики

гетерохроматиновых районов хромосом 1, 9, 16

Как уже отмечалось, доступность районов конститутивного гете-

рохроматина в клетках цитотрофобласта для рестрикции эндонукле-

азами в значительной степени определяется их деконденсированным

состоянием. Учитывая наличие корреляции между конденсацией и

метилированием [899], есть основания предполагать, что гипометили-

рованное состояние хромосом должно сопровождаться их деконденса-

цией. В таком случае, морфометрические характеристики отдельных

445

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

сегментов хромосом могут быть использованы в качестве критерия

для оценки состояния при различных условиях. В этой связи представ-

лялось целесообразным охарактеризовать морфометрические особен-

ности гетерохроматиновых районов хромосом у эмбрионов и плодов

человека разных сроков развития.

Единичные работы, выполненные на культурах фибробластов и

лимфоцитов человека, показали наличие определенной динамики ли-

нейных размеров и селективную нейтральность гетерохроматиновых

районов в эмбриогенезе человека [2, 117]. Между тем, условия клеточ-

ных культур вряд ли адекватны для суждения о нативном состоянии

гетерохроматина в эмбриональных клетках. Такая информация может

быть получена только при изучении гетерохроматина in situ или на

прямых хромосомных препаратах.

Нами проведено морфометрическое исследование гетерохрома-

тиновых районов хромосом 1, 9 и 16 в спонтанно делящихся клетках

цитотрофобласта хориона у эмбрионов и плодов человека 6–20 недель

развития. Значительная вариабельность размеров блоков гетерохро-

матина на «прямых» препаратах не вызывает сомнения. Эти различия

особенно резко выражены при сравнении гетерохроматиновых блоков

хромосом из хориона с вариантами qh + в культурах лимфоцитов пу-

повинной крови плода (табл. 10.6). Обращает на себя внимание факт

высокой частоты варианта 9qh + в клетках цитотрофобласта по сравне-

нию с лимфоцитами, а также тенденция к снижению частоты вариан-

тов qh + для каждой хромосомы по мере развития плода.

Срок

развития,

нед.

Всего

клеток

Хромосома 1

Хромосома 9

Хромосома 16

Число qh +

Число

qh +

Клетки цитотрофобласта (прямые препараты)

111

16,2 %

51,5 %

15,3 %

14–15

25,6 %

50 %

15,9 %

18–20

199

14,6 %

44,7 %

14,6 %

ФГА-стимулированные лимфоциты пуповинной крови

20–29

12,5 %

17,5 %

10 %

Таблица 10.6. Частоты увеличенных гетерохроматиновых блоков* (qh + ) хромосом 1,

9, 16 у эмбрионов и плодов человека на разных сроках эмбрионального развития

* Размеры блоков оценивались визуально на препаратах метафазных хромосом,

окрашенных флуорохромом Hoechst 33258 с контрастированием актиномицином D.

Препараты приготовлены стандартными методами из материала, полученного с це-

лью пренатальной диагностики хромосомных болезней

содержание .. 55 56 57 58 ..