Цитогенетика эмбрионального развития - часть 56

Цитогенетика эмбрионального развития человека

430

тимальной  была  избрана  кислотная  обработка  в  течение  25–30  мин, 

так как она обеспечивала наиболее полную денатурацию хромосом, не 

изменяя их морфологические характеристики.

Распределение флуоресцентных сигналов по длине хромосом ока-

залось неравномерным по длине хромосом (рис. 10.22)

*

 и стабильно 

воспроизводилось во всех проанализированных 72 метафазных плас-

тинках из ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови 

от 7 доноров с нормальным кариотипом. При сравнении М-сегмента-

ции  и  QFH/AcD-исчерченности  (рис. 10.23)

*

  установлено,  что  боль-

шинство сайтов связывания АТ-МеС соответствуют R- и Т-сегментам. 

Высокая плотность сайтов связывания антител отмечена также в райо-

нах прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 3, 9, 16 и в корот-

ких плечах акроцентрических хромосом групп D и G.

На основе распределения по длине хромосом флуоресцентных сиг-

налов АТ-МеС, имеющих различную интенсивность, визуально оце-

ненную в баллах, были составлены идиограммы (рис. 10.24)

*

. Интен-

сивный сигнал (4 балла) был выявлен в большинстве Т- и в некоторых 

R-сегментах, в прицентромерном гетерохроматине хромосом 1, 16 и в 

коротких плечах больших и малых акроцентриков. Средняя (3 балла) 

и слабая (2 балла) флуоресценция была характерна для большинства 

R-, некоторых Т-сегментов и для прицентромерного гетерохроматина 

хромосом 3 и 9. В семнадцати R-сегментах на хромосомах 2, 3, 4, 6, 

8, 9, 13, 16 и во всех G-сегментах флуоресцентный сигнал был очень 

слабым (1 балл), а в центромерных участках отсутствовал (0 баллов) 

(рис. 10.23, 10.24)

*

.

Типичная локализация и различия в интенсивности флуоресценции 

позволили идентифицировать легко узнаваемые маркеры (landmarks) 

для каждой пары аутосом. В качестве таких М-маркеров были опре-

делены  районы  с  интенсивностью  флуоресценции  3  и  4  балла.  Ис-

ключение составил только участок 15q24, флуоресценция которого не 

превысила 2 балла. Большинство М-маркеров совпадали с Т-сегмен-

тами, некоторые — с отдельными R- и C-сегментами. Основные ха-

рактеристики  участков  аутосом,  выделенных  в  качестве  постоянных 

морфологических маркеров М-сегментации хромосом в лимфоцитах, 

приведены в таблице 10.4. Специфика М-сегментации половых X- и 

Y-хромосом  не  рассматривалась  в  рамках  проведенного  исследова-

* 

Рисунок на цв. вкл.

431

Глава 10.

 структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

Хромо-

сома

Плечо, 

сегмент

Расположение морфологического маркера

Интенсивность 

флуоресценции, 

баллы

1

р36

Дистальный Т-сегмент

4

q12, q21 

q42

Район, объединяющий прицентромерный 
гетерохроматин и смежный с ним Т-сегмент
Дистальный R-сегмент

4

4

2

р25 
p23

Дистальный R-сегмент
Дистальный R-сегмент

3
3

q37

Дистальный Т-сегмент

4

3

р25
p21

Дистальный Т-сегмент
Медиальный Т-сегмент

4
4

q21
q27
q29

Проксимальный Т-сегмент
Дистальный R-сегмент
Дистальный R-сегмент

4
4
4

4

р16

Дистальный Т-сегмент

4

q35

Дистальный R-сегмент

4

5

р15

Дистальный Т-сегмент

4

q31 
q35

Дистальный R- и Т-сегмент
Дистальный R- и Т-сегмент

3
4

6

р23
p21

Дистальный R-сегмент
Медиальный Т-сегмент

3
3

q25
q27

Дистальный R-сегмент
Дистальный R-сегмент

4
4

7

р22

Дистальный Т-сегмент

4

q11.2
q22
q36

Проксимальный Т-сегмент
Медиальный Т-сегмент
Дистальный Т-сегмент

4
4
4

Таблица 10.4. Характерные морфологические маркеры, выявляемые на метафазных хромо-

сомах человека с помощью специфических моноклональных антител к 5-метилцитозину

Цитогенетика эмбрионального развития человека

432

8

р23
p21

Дистальный R-сегмент
Медиальный Т-сегмент

4
4

q24

Дистальный Т-сегмент

4

9

р12

Район прицентромерного гетерохроматина

3

q34

Дистальный Т-сегмент

4

10

р15
p13

Дистальный R-сегмент
Медиальный Т-сегмент

4
4

q11.2
q26

Проксимальный R-сегмент
Дистальный Т-сегмент

3
4

11

р15

Дистальный Т-сегмент

4

q13
q23

Проксимальный Т-сегмент
Дистальный Т-сегмент

4
4

12

р13

Дистальный R-сегмент

4

q24

Дистальный Т-сегмент

4

13

q12
q32
q34

Проксимальный R-сегмент
Дистальный R-сегмент
Дистальный R-сегмент

3
4
4

14

q24
q32

Дистальный R- и Т-сегмент
Дистальный R- и Т-сегмент

3
4

15

р11.2

Прицентромерный гетерохроматин

4

q24, 
q26

Дистальный R-сегмент
Дистальный R-сегмент

2
3

Хромо-
сома

Плечо, 

сегмент

Расположение морфологического маркера

Интенсивность 

флуоресценции, 

баллы

Таблица 10.4 (продолжение)

16

р13

Дистальный Т-сегмент

4

q11.2
q24

Проксимальный R-сегмент
Дистальный Т-сегмент

3
4

433

Глава 10.

 структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

ния. Учитывая случайную инактивацию Х-хромосомы в соматических 

клетках, содержащих две и более Х-хромосомы, особенности их мети-

лирования являются предметом специального изучения.

Как  и  в  случае  ник-трансляции  in situ,  опосредованной  чувстви-

тельными к метилированию рестриктазами, М-сегменты, выявляемые 

на  метафазных  хромосомах  с  помощью  специфических  антител,  ха-

рактеризуются выраженными различиями в интенсивности флуорес-

ценции. Последние могут быть обусловлены степенью спирализации 

хромосом, доступностью сайта-мишени для специфических антител, а 

также плотностью 5-метилцитозина в соответствующих участках.

17

р13

Дистальный Т-сегмент

4

q21
q25

Медиальный Т-сегмент
Дистальный Т-сегмент

3
4

18

р11.2

Проксимальный R-сегмент

3

q23

Дистальный R-сегмент

4

19

р13

Т-сегмент

4

q13

Т-сегмент

4

20

р13

Дистальный R-сегмент

3

q11.2
q13

Проксимальный Т-сегмент
Дистальный Т-сегмент

4
4

21

р11.2

Район прицентромерного гетерохроматина

4

q22

Дистальный Т-сегмент

4

22

р11.2

Район прицентромерного гетерохроматина

4

q11.2
q13

Проксимальный Т-сегменты

4
4

Хромо-
сома

Плечо, 

сегмент

Расположение морфологического маркера

Интенсивность 

флуоресценции, 

баллы

Таблица 10.4 (окончание)

Цитогенетика эмбрионального развития человека

434

Фактор  спирализации  был  минимизирован  путем  отбора  мета-

фазных пластинок со средней степенью спирализации хромосом, со-

ответствующей  разрешению  ~  400  сегментов  на  гаплоидный  геном. 

Условия  экспериментов  были  подобраны  таким  образом,  что  хромо-

сомы набора были в равной степени денатурированы по всей длине, 

что  обеспечивало  одинаковый  доступ  антител  к  сайтам  связывания. 

Таким  образом,  различия  интенсивности  флуоресценции  в  условиях 

применения специфических антител в наших исследованиях, главным 

образом, определялись степенью метилирования CpG-динуклеотидов 

хромосомных сегментов.

Напомним,  что  R-сегменты  имеют  ярко  выраженную  неодно-

родность  нуклеотидного  состава  и  подразделяются  на  относительно  

GC-бедные (L1 и L2) и GC-богатые районы (Н1, Н2 и Н3) [229, 772]. 

Н3

 + 

-районы  наиболее  обогащены  GC-динуклеотидами  и  соответст-

вуют всем Т- и отдельным R-сегментам [772]. Интенсивность флуо-

ресценции  АТ-МеС  в  Н3

 + 

-участках  варьирует  от  2  до  4  баллов,  что 

свидетельствует о различной степени их метилирования (рис. 10.24). 

При этом большинство сегментов характеризуется интенсивной флуо-

ресценцией (4 балла), в то время как в отдельных Н3

 + 

-сегментах она не 

превышает 3 баллов. Более того, единичные R-сегменты хромосом 9 и 

15, соответствующие Н3

 + 

-участкам (9р13, 9q22, 9q32, 15q15, 15q24), 

характеризуются слабым флуоресцентным сигналом (2 балла).

Как  уже  упоминалось,  метилированный  цитозин,  в  основном,  в 

виде  динуклеотидов  CpG,  находится  в  CpG-островках,  распределен-

ных в геноме человека неравномерно [326, 869]. В R-сегментах лока-

лизовано 80

 

% СpG-островков, расстояние между которыми составляет 

менее 100 т.п.н., в то время как в G-сегментах расстояние между этими 

островками превышает 1000 т. п. н. [229, 336]. Согласно нашим наблю-

дениям,  сегменты  хромосом,  обогащенные  СpG-островками,  имеют 

высокий уровень метилирования. Вместе с тем, некоторые сегменты 

хромосом  6,  9,  10,  13,  15,  характеризующиеся  высокой  плотностью 

СpG-островков  [229],  обнаруживают  слабый  (2  балла —  9p13,  9q22, 

10q24, 13q22, 15q24) или даже очень слабый флуоресцентный сигнал 

(1 балл — 6q15, 6q21, 6q23, 13q22).

Примечательно, что два сегмента хромосомы 9 (9p13, 9q22) и один 

хромосомы  15  (15q24),  характеризующиеся  высоким  содержанием 

изохора Н3

 + 

 и СpG-островков, имели низкий уровень флуоресценции 

435

Глава 10.

 структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

(рис. 10.24)

*

, что, по всей вероятности, свидетельствовало об их ги-

пометилированном состоянии. Известно, что GC-обогащенность кор-

релирует с плотностью генов. Последняя может достигать 20-кратной 

разницы  при  сравнении  разных  R-сегментов  метафазных  хромосом 

[252, 253, 837, 842, 907]. Можно предполагать, что слабая степень ме-

тилирования некоторых участков хромосом, богатых СG-динуклеоти-

дами и характеризующихся наибольшей плотностью генов, свидетель-

ствует об их функциональной активности в исследуемом типе клеток 

на соответствующей стадии развития. Интересно отметить, что боль-

шинство Т-сегментов хромосом в клетках цитотрофобласта, которые 

на  основании  результатов  ник-трансляции,  опосредованной  HpaII  и 

ДНКазойI,  были  причислены  к  гипометилированным,  оказались  ги-

перметилированными  в  лимфоцитах  периферической  крови.  Исклю-

чение  составили  сегменты  7q32  и  9q22,  которые  характеризовались 

гипометилированным состоянием в обоих типах клеток.

Хромосом-специфичный уровень метилирования был отмечен так-

же  для  блоков  прицентромерного  гетерохроматина.  Интенсивность 

флуоресценции гетерохроматина хромосом 1 и 16 на всех проанали-

зированных метафазах была высокой (4 балла) и не зависела от раз-

меров  блока.  Вместе  с  тем,  для  района  9q12  был  характерен  сигнал 

меньшей  интенсивности  (3  балла).  Известно,  что  в  геноме  человека 

гетерохроматин большей частью образован сателлитной ДНК I, II, III 

классов,  распределение  которых  характеризуется  определенной  хро-

мосом-специфичностью [229, 485]. В состав гетерохроматина хромо-

сомы 9 преимущественно входят сателлиты III и β, более обогащенные 

CG-динуклеотидами, по сравнению с сатДНК прицентромерных гете-

рохроматиновых районов хромосом 1 и 16. Не исключено, что гипо-

метилированное состояние гетерохроматина хромосомы 9 важно для 

поддержания особой конформационной структуры этого района, необ-

ходимой для сохранения функциональной активности.

Отличия  в  интенсивности  флуоресценции  АТ–МеС  наблюдались  

в коротких плечах акроцентрических хромосом. Как уже обсуждалось 

выше, причиной этих различий являются полиморфизм сателлитных 

последовательностей ДНК, входящих в состав прицентромерного ге-

терохроматина и спутников, и различная активность локализованных 

в спутничных нитях рибосомных генов.

*

 Рисунок на цв. вкл.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

436

Таким образом, цитохимический анализ метафазных хромосом чело-

века с использованием специфических антител к 5-метилцитозину поз-

волил  обнаружить  новый  вариант  дифференциальной  исчерченности, 

который можно рассматривать как М-сегментацию. В какой мере рисунок 

М-метилирования хромосом культивированных лимфоцитов характерен 

для клеток других тканей, зависит ли он от функциональной организации 

хромосом, изменяется ли он в эмбриогенезе и в процессе клеточной диф-

ференцировки рассмотрено в следующем разделе.

10.4.2. Некоторые особенности паттерна

 метилирования хромосом в эмбриогенезе человека

10.4.2.1. Характеристика М-сегментации хромосом 

из лимфоцитов пуповинной крови 

у плодов 20–24 недель развития 

М-рисунок хромосом ФГА-стимулированных лимфоцитов из пу-

повинной крови у 5 плодов человека 22–24 недель развития оказал-

ся идентичным таковому в лимфоцитах периферической крови до-

норов (рис. 10.25)

*

. Однако интенсивность флуоресценции многих 

М

 + 

-сегментов,  за  исключением  хромосом  4  и  19,  заметно  отлича-

лась. Отличия были статистически достоверны для 22 М-сегментов, 

совпадающих  с  R-сегментами  (М

 + 

-R),  для  семи,  совпадающими  с 

Т-сегментами (М

 + 

-Т), а также для района прицентромерного гете-

рохроматина хромосомы 9 (табл. 10.5). Интенсивность флуоресцен-

ции М

 + 

-R-сегментов у плодов менялась как в сторону увеличения, 

так и уменьшения по сравнению с таковой в аналогичных сегментах 

хромосом от взрослых индивидов, в то время как для М

 + 

-Т-сегмен-

тов было характерно лишь ее уменьшение. Примечательно, что раз-

ница  в  интенсивности  флуоресценции  М-сегментов,  как  правило, 

не превышала 1 балла, что может свидетельствовать о небольших 

различиях статуса метилирования.

Согласно нашим наблюдениям, различия по интенсивности флуорес-

ценции между гомологичными хромосомами из ФГА-стимулированных 

лимфоцитов плода и взрослых индивидуумов отмечаются в общей слож-

ности по 30 сегментам. При этом в 13 сегментах у плода флуоресценция 

была интенсивнее, а в 17 — менее яркой, чем в гомологичных сегментах 

* 

Рисунок на цв. вкл.

437

Глава 10.

 структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

Хромосома

Сегмент

Характеристика 

сегмента

Интенсивность флуоресценции, 

баллы

Взрослые 

лимфоциты

Фетальные 

лимфоциты

1

1q42

(T)

4

3

1q44

(R)

2

3

2

2q23

(R)

1

2

2q31

(R)

1

2

2q33

(R)

1

3

3

3q21

(R)

4

3

3q25

(R)

3

2

4

–

–

–

–

5

5q13

(R)

4

3

6

6p11.2

(R)

1

3

7

7p13

(R)

2

3

7p15

(R)

2

3

8

8q11.2

(R)

2

3

9

9q12

(С)

3

2

9p13

(R)

2

3

10

10q24

(R)

2

3

10q26

(T)

4

3

11

11q23

(T)

4

3

12

12p13

(R)

4

3

12q13

(T)

4

3

13

13q22

(R)

1

3

14

14q13

(R)

2

3

14q22

(R)

2

3

15

15q11.2

(R)

3

2

15q13

(R)

3

2

16

16q22

(R)

3

2

17

17q21

(Т)

3

2

18

18q11.2

(R)

3

2

19

–

–

–

–

20

20q11.2

(Т)

4

3

21

21q11.2

(R)

3

2

22

22q11.2

(Т)

4

3

Таблица 10.5. Различия интенсивности флуоресценции сегментов хромосом в ФГА-стимули-

рованных лимфоцитах взрослых индивидов и плодов человека