содержание .. 52 53 54 55 ..

Цитогенетика эмбрионального развития - часть 54

Цитогенетика эмбрионального развития человека

414

реализации наследственной программы в процессах индивидуального

развития зародыша, то есть приблизиться к пониманию функций гено-

ма в эмбриогенезе.

Для решения этой проблемы были разработаны специальные ме-

тоды, позволяющие визуализировать непосредственно на цитологи-

ческих препаратах активно работающие гены, точнее кластеры этих

генов, сосредоточенные в определенных участках хромосом. К ним

относятся методы рестрикции in situ, методы ник-трансляции in situ и

другие молекулярные методы, ранее применявшиеся только в экспери-

ментах с изолированной ДНК. Некоторые из них ранее с успехом были

применены для изучения особенностей структурно-функциональной

организации хромосом в эмбриогенезе лабораторных млекопитающих

[143]. В серии наших исследований впервые был проведен анализ осо-

бенностей метилирования ДНК хромосом в разных тканях и на разных

стадиях эмбриогенеза человека [125, 135, 145, 558].

10.3. Анализ статуса метилирования хромосом

с помощью метода ник-трансляции

situ

Известно, что активный хроматин, где находятся работающие и, сле-

довательно, деметилированные гены, чувствителен к рестрикции фер-

ментом ДНКазой I [501]. Показано, что основное количество гиперчувс-

твительных к ДНКазе I сайтов (DH-сайтов) локализовано в 5’-концах

тканеспецифичных генов, где располагаются регуляторные последова-

тельности, включая CpG-островки [555]. Специфическая конформация

хроматина, определяющая чувствительность активных или потенциаль-

но активных генов к ДНКазе I, сохраняется и в фиксированных митоти-

ческих хромосомах, что впервые было продемонстрировано на примере

различий в чувствительности к ДНКазе I активной и инактивированной

Х-хромосом [501]. При обработке in situ препаратов метафазных хромо-

сом ДНКазой I в местах скопления активных генов в цепочке ДНК обра-

зуются бреши (ники), которые затем в присутствии ДНК-полимеразы 1 и

набора меченых нуклеотидов, репарируются и могут быть визуализиро-

ваны. Распределение ник-трансляционного сигнала по длине метафазных

хромосом (D-рисунок) в целом совпадает с типичным рисунком R-дисков

метафазных хромосом [593].

Следует отметить, что метод ник-трансляции in situ без предвари-

тельных обработок нуклеазами позволяет выявить на метафазных хро-

415

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

мосомах спонтанные однонитевые разрывы в ДНК. Так, множествен-

ные однонитевые разрывы были обнаружены в хромосомах мышей на

доимплантационных стадиях эмбриогенеза [697], а также в различных

клетках при апоптозе [329, 906].

Попытки использования специфических эндонуклеаз рестрикции в

цитогенетической практике, предпринятые в 1980–1990-е годы [875],

оказались вполне успешными для изучения нуклеотидного состава

ДНК в различных участках хромосом. Так, рестриктазы, имеющие

сайты-мишени, обогащенные С- и G-нуклеотидами, индуцируют, в

основном, G-подобный рисунок [623], а рестриктазы, сайты-мише-

ни которых обогащены А- и Т-основаниями — R-подобный рисунок

[877]. Однако ДНК не во всех участках хромосомы равно доступна

для действия рестриктаз [841]. На рестрикцию in situ влияют как

структура ферментов, так и структура хроматина [367]. Некоторые

рестриктазы (например, TaqI), сайты-мишени которых локализованы

преимущественно в сателлитной ДНК, могут экстрагировать ДНК из

таких очень компактизованных районов как С-блоки в хромосомах 1,

9, 16 и Y [330, 581]. Другие рестриктазы, например, AluI, наоборот,

особенно интенсивно экстрагируют ДНК из плеч хромосом, индуци-

руя С-рисунок [397].

В плане локализации функционально активных участков хромосом

особый интерес представляют эндонуклеазы, обладающие различной

чувствительностью к сайтам ДНК в зависимости от того, являются ли

те метилированными (неактивными) или неметилированными (актив-

ными).

Так, эндонуклеазы MspI и HpaII расщепляют один и тот же сайт

ДНК — С↓CGG, то есть являются изошизомерами. Метилирование

этого сайта не влияет на рестрикционные свойства эндонуклеазы

MspI, тогда как эндонуклеаза HpaII расщепляет этот сайт только в том

случае, если внутренний цитозин неметилирован. С помощью именно

этих рестриктаз на изолированной ДНК человека было показано, что

число неметилированных CCGG-сайтов примерно в 4 раза меньше,

чем всех CCGG-сайтов [523].

Доступность сайтов-мишеней для рестриктаз, особенно HpaII, ос-

ложняется вследствие связывания ДНК с белками, в том числе с метил-

цитозин-специфическими белками [214], а также наличием в R-дисках

Alu-повторов с высоким содержанием метилированных CpG-динук-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

416

леотидов [809]. Однако именно эти сайты, будучи в составе активного

хроматина, подвергаются рестрикции HpaII и MspI, что позволяет пос-

ле проведения ник-трансляции регистрировать образованные ими бре-

ши в виде дифференциальной исчерченности метафазных хромосом.

Поскольку наибольшее количество сайтов-мишеней для этих рестрик-

таз находится в CpG-островках генов «домашнего хозяйства», которые

локализованы в R-дисках [336], то ник-трансляция с использованием

рестриктаз MspI или HpaII на хромосомах лимфоцитов человека поз-

воляет получить дифференциальную исчерченность, подобную R-ри-

сунку [214, 851]. Различная доступность этих сайтов для HpaII и MspI,

обусловленная статусом их метилирования, определяет разное число

разрывов, вносимых этими рестриктазами, в одних и тех же участках

метафазных хромосом. Сопоставление этих различий позволяет су-

дить о степени метилирования отдельных участков хромосом.

Таким образом, метод ник-трансляции in situ с использованием раз-

личных эндонуклеаз открывает широкие возможности для изучения

структурной и функциональной организации хромосом млекопитаю-

щих и человека.

В нашей работе впервые использован этот метод для изучения рас-

пределения активных и потенциально активных участков хромосом на

препаратах из спонтанно делящихся клеток цитотрофобласта, а также

из эмбриональных тканей (эпителий кишечника, почки, легкие, рого-

вица глаза и др.), полученных при медицинских абортах в срок 5–12

недель развития.

Согласно литературным данным, на препаратах хромосом культи-

вированных лимфоцитов человека после ник-трансляции с использо-

ванием рестриктаз HpaII и MspI [214, 851] или следовых количеств

ДНКазы1 [501, 593], сигнал регистрируется преимущественно в R-дис-

ках и в активной Х-хромосоме. Ориентируясь на эти данные, ключе-

выми моментами при адаптации метода ник-трансляции для анализа

«прямых» препаратов было создание оптимальных условий для полу-

чения специфического сигнала в R-дисках на аутосомах и в длинных

плечах Х-хромосом.

При подборе методических условий нами была апробирована ам-

плификация ник-трансляционного сигнала методом «иммунных сэн-

двичей» [713], 1–2 раунда которой позволили значительно повысить

эффективность выявления сегментации. Этот метод достаточно попу-

417

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

лярен при проведении FISH, однако для детекции сигнала при ник-

трансляции он был применен нами впервые.

Оптимальные условия предобработок препаратов, проведения ре-

акции ник-трансляции, опосредованной ДНКазойI и эндонуклеазами

рестрикции HpaII и MspI приведены в Приложении.

10.3.1. общая характеристика функционального

статуса хромосом у эмбрионов человека

При любых предобработках препаратов (ДНКазой I, MspI и HpaII)

флуоресцентный ник-трансляционный сигнал регистрировался во всех

хромосомах, однако его интенсивность и характер распределения по

сегментам различных хромосом и в клетках различного эмбриональ-

ного происхождения оказались различными.

На препаратах из эмбриональных тканей при обработке ДНКазой I

распределение сигнала было столь диффузным, что не позволяло отнес-

ти его к какому-либо определенному типу сегментации (рис. 10.11)

Предобработки с помощью MspI и HpaII индуцировали более четкий

рисунок, соответствующий R-исчерченности (рис. 10.12)

. Следует от-

метить полное отсутствие ник-трансляционного сигнала в С-сегмен-

тах и единичные сигналы в районах 1qh, 9qh 16qh хромосом из эмбри-

ональных клеток при различных предобработках препаратов.

В клетках цитотрофобласта предобработка ДНКазойI приводила к

диффузному распределению сигнала по хромосомам с преобладанием

в R- и особенно в Т-сегментах и прицентромерных гетерохроматино-

вых районах хромосом 1, 9, 16, 15 и 22 (рис. 10.13)

, в то время как

воздействие MspI и HpaII — к более четкой картине R + Т-исчерченно-

сти при сохранении сигнала в районах 1qh, 9qh, 16qh, 15cenh и 22cenh

(рис. 10.14)

Обнаруженные межтканевые различия, обусловленные специфи-

кой использованных ферментов и их различным сродством к сайтам-

мишеням, отражают более глубинные различия в структурно-функци-

ональной организации хромосом клеток эмбриона и его провизорных

органов. Так, известно, что ДНК трофэктодермы в меньшей степени

метилирована по сравнению с ДНК внутренней клеточной массы

[646], а уровень метилирования CpG-динуклеотидов в плаценте почти

в 2 раза ниже, чем в лимфоцитах взрослого человека [369]. Кроме того,

* Рисунок на цв. вкл

Цитогенетика эмбрионального развития человека

418

замещение цитозина на 5-метилцитозин в значительной мере влияет

на структуру и стабильность хроматина и сопровождается его декон-

денсацией [899]. Это явление можно оценить визуально. Так, при оди-

наковых методических условиях приготовления «прямых» препаратов

метафазные хромосомы из клеток цитотрофобласта хориона заметно

менее конденсированы по сравнению с хромосомами из эмбриональ-

ных клеток — производных внутренней клеточной массы (ср. метафа-

з ные пластинки, видеоизображения которых получены при одном уве-

личении, рис. 10.11 и 10.13)

. Поэтому логично, что ДНК хромосом

в цитотрофобласте более доступна для нуклеаз, чем в клетках эмбрио-

нального происхождения. Что касается неспецифического проявления

сигнала, затрудняющего определение границ сегментов на хромосо-

мах, то следует отметить, что в процессе ник-трансляции происходит

репарация любых разрывов, индуцированных не только тем или иным

ферментом, но и условиями приготовления препаратов. Не исключено,

однако, что спонтанные однонитевые разрывы в ДНК являются свой-

ством метафазных хромосом эмбриональных клеток. По крайней мере,

множественные однонитевые разрывы обнаружены в хромосомах мы-

шей на доимплантационных стадиях развития [697].

В какой-то мере нечеткость сегментации обусловлена и различной

плотностью распределения сайтов-мишеней для эндонуклеаз, которая оп-

ределяется как их распределением в первичной последовательности ДНК,

так и особенностью их упаковки в процессе спирализации хромосомы.

Уместно напомнить, что специфичность распределения АТ- и CG-пар

оснований ДНК в геноме хорошо коррелирует с особенностями R/G

дифференциальной окраски метафазных хромосом. Так, для G-дисков

характерна высокая плотность АТ-пар, тогда как R-диски богаты GC-ди-

нуклеотидами. При этом R-сегменты неоднородны и подразделяются на

несколько подтипов в зависимости от распределения и плотности GC-бо-

гатых фрагментов (изохоров), а также содержания других молекулярных

маркеров, например, Alu-повторов [772]. При этом наиболее GC-богатые

R-сегменты, независимо от содержания в них Alu-повторов, определяют

как T-сегменты [473]. Важно отметить, что плотность генов в GC-обога-

щенных R-сегментах, особенно в Т-сегментах, которые относятся к ак-

тивно транскрибируемому хроматину, в среднем на порядок выше, чем

в АТ-богатых G-дисках [161, 258, 820].

Рисунок на цв. вкл

419

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

Результаты проведенного нами анализа распределения ник-транс-

ляционных сигналов по плечам хромосом наглядно иллюстрируют

факты локализации в R- и Т-сегментах GC-богатых последователь-

ностей (по расположению сайтов-мишеней для рестриктаз MspI и

HpaII) и принадлежности к активному хроматину (по различной до-

ступности для рестриктаз MspI и HpaII, обусловленной метилирова-

нием и наличием сайтов-мишеней для ДНКазы I). Так, максимальная

концентрация сигнала при одном раунде амплификации регистрирова-

лась в Т-сегментах, например, в хромосоме 7 в сегментах 7q32 и 7q36

(рис. 10.14)

, в хромосоме 11 — в сегментах 11р15, 11q23 и особенно —

в 11q13 (рис. 10.15)

. Интересно отметить, что район 11q12–13 явля-

ется «горячей точкой» рекомбинации [355]. Оба плеча хромосомы 19,

в которой все R-блоки являются, по сути, Т-блоками, демонстрировали

наличие сигнала, тогда как хромосома 18, которая не имеет Т-блоков,

демонстрировала относительно слабое свечение. Исключениями яв-

лялись некоторые R-блоки (например, 18p11, 18q23, 9q22), интенсив-

ность включения сигнала в которые была сопоставима с истинными Т-

блоками (рис. 10.13 и 10.14)

. По-видимому, в большинстве R-сегмен-

тов плотность СрG-островков недостаточна для выявления сигнала на

цитологическом уровне, хотя проявление многих R-сегментов после

2-кратной амплификации сигнала свидетельствует о том, что образо-

вание и репарация брешей («ников») происходит и в них, но с меньшей

интенсивностью.

При анализе распределения участков хромосом, чувствительных к

нуклеотид-специфичным эндонуклеазам, необходимо учитывать сте-

пень спирализации хромосом. Известно, что многие R- и G-сегменты

на малоспирализованных хромосомах «распадаются» на субсегменты,

число и относительная плотность которых варьируют в разных райо-

нах хромосом (см. главу 2). При спирализации слияние одних суб-

сегментов в сегменты и далее в районы хромосом происходит более,

других — менее интенсивно [162, 168, 176]. Эти особенности неравно-

мерной упаковки имеют немаловажное значение при характеристике

структурно-функциональных особенностей конкретных участков хро-

мосомы.

Расшифровка генома человека и очевидные успехи в картирова-

нии генов на хромосомах предоставляют уникальную возможность

Рисунок на цв. вкл.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

420

проанализировать особенности генного состава участков хромосом,

характеризующихся, согласно полученным данным, выраженным сиг-

налом ник-трансляции, который соответствует активному состоянию

гетерохроматина. Сравнительный анализ таких функционально актив-

ных сегментов в клетках цитотрофобласта (см. выше) указывает на то,

что именно в них сосредоточены кластеры генов факторов транскрип-

ции (PAX4, HRC1, HRAS1, SOX6, ZNF214, ZNF215, ZNF143, ZNF195,

HLXB9), факторы роста (INS, IGF2, INSIG1), гены энергетического об-

мена (cDKNIC, NDUFA5), гены регуляторы митотической активно сти

(RAS, REHEB2, p53, H19), гены клеточной дифференцировки, в том

числе, участвующие в развитии плаценты (H19, KIP2RNH) и эмбрио-

нальной дифференцировке (SCRA1, PTJP, GBX1, MEST, SHH), а также

гены малых цитоплазматических РНК (RNY1–5). Участие этих генов в

контролировании процессов раннего эмбриогенеза, в том числе в раз-

витии и становлении хориона и дефинитивной плаценты представля-

ется вполне реальным. Таким образом, с определенными ограничени-

ями, результаты, полученные методом ник-трансляции, вполне могут

быть использованы для поиска участков хромосом, обогащенных гена-

ми, активно функционирующими в определенных клетках на соответ-

ствующих стадиях развития. Мы еще вернемся к рассмотрению этого

принципиально важного положения в заключительной главе.

Характер распределения ник-трансляционных сигналов в метафаз-

ных пластинках из клеток цитотрофобласта принципиально не отли-

чался между гомологичными хромосомами. Вместе с тем, идентичные

районы некоторых гомологичных хромосом проявляли заметные отли-

чия по интенсивности флуоресценции. Учитывая, что эти отличия мо-

гут отражать различную функциональную значимость гомологичных

хромосом в эмбриогенезе [380], представляло интерес понять причину

этой гетерогенности.

Сравнительный анализ гомологичных хромосом по интенсивности

ник-трансляционного сигнала был предпринят на «прямых» препара-

тах из клеток цитотрофобласта хориона от 9 эмбрионов 8–11 недель

развития. От каждого индивида исследовали по 4 метафазные плас-

тинки с четкой R + T-сегментацией хромосом, полученной при предоб-

работке препаратов ДНКазойI и HpaII. При визуальной оценке интен-

сивности сигнала в идентичных районах хромосом заметные различия

регистрировали как « + », а их отсутствие — как «–». В качестве приме-

421

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

№ э

мбри

она

Срок разви-

тия (недель)

Кариотип

плода

Различия в интенсивности

ник-трансляционного сигнала

Метафазные пластинки

Всего

–

46,XX

–

46,XY

–

46,XY

46,XX

–

46,ХХ

–

46,XY

–

Таблица 10.3. Сравнительный анализ различий по интенсивности флуоресцентного сиг-

нала в интервале 2q11 ~ q13 на метафазных хромосомах из клеток цитотрофобласта

после ник-трансляции с предобработкой ДНКазой I

ра приведен принцип оценки различий в районе 2q11–q13 (табл. 10.3).

После проверки на однородность выборки с помощью таблиц сопря-

женности достоверность различий/сходства оценивали методом χ

. Ре-

зультаты сравнительного анализа по нескольким сегментам хромосом

суммированы на рисунке 10.16. В большинстве случаев межклеточные

различия имели случайный характер и, по-видимому, были связаны

с погрешностями методик и визуальной оценки интенсивности флуо-

ресценции (качеством препаратов, нестрогим соблюдением условий

обработки ферментами и проведения реакции ник-трансляции, нали-

чием неспецифических сигналов и т. д.). Межиндивидуальные разли-

чия по некоторым сегментам, возможно, были обусловлены различия-

ми в сроках развития эмбрионов, однако проверка этого предположе-

ния требует увеличения выборки.

Различия по интенсивности ник-трансляционного сигнала подтве-

рдились лишь по сегментам хромосом Х и 2. Наиболее ярко они были

представлены в интервале Xq24–q27. Во всех метафазных пласти-

нках на препаратах хориона плодов с кариотипом 46,ХХ были отмече-

ны различия между Х-хромосомами в интенсивности флуоресценции

ник-сигнала как после обработки ДНКазойI, так и HpaII (рис. 10.16).

Следует отметить, что в работах других авторов различия между

содержание .. 52 53 54 55 ..