Цитогенетика эмбрионального развития - часть 55

Цитогенетика эмбрионального развития человека

422

Рис. 10.16. Результаты сравнительного анализа интенсивности флуоресценции ник-

трансляционного сигнала между участками гомологичных хромосом в клетках ци-

тотрофобласта с предобработкой ДНКазой I

Х-хромосомами на хромосомных препаратах из культивированных лим-

фоцитов  были  зарегистрированы  только  при  изотопном  варианте  ник-

трансляции  [501],  и  не  были  обнаружены  при  детекции  в  проходящем 

свете [214, 851]. С помощью модифицированного варианта метода ник-

трансляции in situ (метод SPRINS) были обнаружены различия в метили-

ровании по большему числу сегментов активной и неактивной Х-хромо-

сом в 57–90

 

% лимфоцитов от разных доноров с нормальным женским 

кариотипом [229]. Принимая во внимание, что район Хq24–q27 подвер-

гается инактивации только на одной из Х-хромосом, различия в метили-

ровании ДНК и конформации хроматина в этих участках свидетельству-

ют об отличиях их функционального статуса. Вместе с тем, корреляция 

между  метилированием  и  активностью  Х-хромосом  оказывается  более 

сложной. Так, при анализе лимфобластоидной клеточной линии, харак-

теризующейся  полисомией  Х-хромосом,  методом  SPRINS  было  уста-

новлено, что активная Х-хромосома гиперметилирована по сравнению с 

неактивными Х-хромосомами [229]. Возможно, эти различия обусловле-

ны наличием особого механизма выключения неактивной Х-хромосомы  

423

Глава 10.

 структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

(см. раздел 10.2.2). Таким образом, метод флуоресцентной детекции до-

статочно чувствителен для выявления различий между Х-хромосомами 

в клетках с двумя и более Х-хромосомами, а также пригоден для анализа 

функциональных различий отдельных районов гомологичных аутосом.

Достоверные различия в интенсивности флуоресценции ник-трансля-

ционного сигнала между аутосомными гомологами были зарегистриро-

ваны только по хромосоме 2 (район 2q11–q13). В остальных хромосомах, 

независимо от использованных эндонуклеаз (ДНКаза I или HpaII), разли-

чия в гомологичных районах и их отсутствие регистрировались примерно 

с одинаковой частотой (рис. 10.16). Можно предполагать, что район 2q11–

q13, содержащий 2 R-сегмента (2q11.2 и 2q11.3) и характеризующийся 

высокой плотностью генов [473], функционально активен только в одной 

из гомологичных хромосом в клетках цито трофобласта. Тождественный 

район в другом гомологе, по-видимому, остается функционально инерт-

ным. К сожалению, пока неясно, является ли функционально активным 

(или инертным) район 2q11-q13 одного и того же гомолога и если так, то 

каково родительское происхождение этой хромосомы.

Принимая во внимание известные факты неслучайной инактивации 

отцовской Х-хромосомы в провизорных органах (плацента, желточный 

мешок)  мышей  и,  возможно,  человека  [588],  особенности  плаценты  и 

оболочек как основного иммунологического барьера между генетически 

различными  организмами  [694],  предположение  о  функциональной  не-

равнозначности генов района 2q11–13 представляется вполне логичным. 

Однако этот феномен нуждается в дополнительных доказательствах.

Между тем, функциональная гетерогенность гомологов, доказанная 

для Х-хромосомы и предполагаемая, согласно полученным результа-

там, для района 2q11–q13, по всей видимости, носит более универсаль-

ный характер и не ограничена цитотрофобластом. Об этом, в частно сти, 

свидетельствуют данные о различиях между гомологами хромосом 11 

и 15 по интенсивности ник-трансляционного сигнала, опосредованно-

го  обработкой  HpaII  [145].  Отличия  гомологов  по  локусу  15q11–q13 

наблюдались  только  в  эмбриональных  клетках  (рис. 10.17)

*

,  но  не  

в  клет ках  цитотрофобласта.  Известно,  что  локус  15q11–q13  содер-

жит кластер из 10 импринтированных генов, экспрессия 9 из которых 

осуществляется с отцовской аллели и лишь одного — с материнской 

[721]. Нарушение импринтирования генов этого локуса, его делеция 

* 

Рисунок на цв. вкл.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

424

или однородительская дисомия приводят к возникновению синдромов 

Прадера–Вилли или Ангельмана, в зависимости от того, в какой из ро-

дительских хромосом произошли изменения, или какая из хромосом 

представлена в двух копиях [710]. С учетом того, что только в заро-

дышевых клетках наблюдались различия между гомологами хромосом 

15, т. е. локус 15q11–q13 в одном из гомологов был гипометилирован, 

можно предполагать, что активное состояние сохраняют гены в этой 

области только на одной хромосоме, тогда как в другом гомологе они 

гиперметилированы и, по-видимому, функционально неактивны. Им-

принтирование этого локуса свойственно только эмбриональным клет-

кам, но не цитотрофобласту, по крайней мере, в 5–8 недель развития.

Различия между гомологами по характеру включения сигнала наблю-

дались также по участку 11р15 (рис. 10.18)

*

. Так, в клетках экстраэмбрио-

нальных тканей гипометилированный локус находился лишь на одном из 

гомологов, в то время как в эмбриональных клетках этот участок оказался 

гипометилированным на обоих гомологах. Следовательно, локус 11р15, 

возможно, импринтирован только в клетках внезародышевых тканей. Ин-

тересно отметить, что этот локус хромосомы 11 содержит кластер из семи 

импринтированных генов, для шести из которых характерна экспрессия 

материнских аллелей и для одного — отцовской [721].

10.3.2. Характеристика прицентромерных районов

 и коротких плеч акроцентрических хромосом

Интенсивный  сигнал  ник-трансляции  наблюдался  и  в  коротких  пле-

чах всех акроцентрических хромосом. При этом отмечались существен-

ные различия по интенсивности сигналов между гомологами (рис. 10.13, 

10.14)

*

, что, вероятно, связано с разным числом транскрибируемых копий 

р-генов в ЯОР и особенностями ДНК, входящей в состав прицентромер-

ного гетерохроматина и спутников. Следует отметить, что интенсивность 

сигнала в районах спутничного гетерохроматина была заметно ниже, чем 

в районах спутничных нитей (рис. 10.13, 10.14)

*

. В целом, наши наблю-

дения подтверждают наличие хромосомспецифичного полиморфизма са-

теллитной ДНК в прицентромерном и спутничном гетерохроматине акро-

центрических хромосом [229] и согласуются с представлениями о том, что 

полиморфизм по активности кластеров рибосомных генов определяется 

степенью метилирования ДНК в этих районах.

* 

Рисунок на цв. вкл.

425

Глава 10.

 структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

Таким образом, выявляемые различия в интенсивности ник-транс-

ляционного  сигнала  действительно  отражают  различия  в  функцио-

нальном  статусе  сегментов  хромосом,  ранее  установленные  молеку-

лярными методами.

10.3.3. особенности функционального состояния районов 

прицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9 и 16

Как  упоминалось  выше,  при  любых  предобработках  препаратов 

перед проведением ник-трансляции, наряду с сегментацией, соотве т с т-

вующей стандартной R/Т-исчерченности, яркий флуоресцентный сиг-

нал  определялся  в  районах  прицентромерного  гетерохроматина  хро-

мосом 1, 9, 16 в клетках цитотрофобласта и практически отсут ствовал  

в клетках эмбриональных тканей (рис. 10.19)

*

. В аналогичных работах, 

выполненных на лимфоцитах периферической крови в постнатальном 

периоде, а также на клетках лимфобластоидной линии ник-трансляци-

онного сигнала в блоках конститутивного гетерохроматина не наблю-

далось [214, 851].

Наличие  в  прицентромерном  гетерохроматине  ник-трансляцион-

ного  сигнала,  опосредованного  метилчувствительной  рестриктазой 

НраII, свидетельствует о том, что районы конститутивного гетерохро-

матина 1qh, 16qh и, в особенности, 9qh гипометилированы в цитотро-

фобласте  по  сравнению  с  эмбриональными  тканями.  Гипометилиро-

ванность ДНК в составе гетерохроматина хромосомы 9 (сегмент 9q12) 

в плаценте человека и в активно пролиферирующих опухолевых клет-

ках ранее отмечалась в работах других  авторов [336, 416]. Феномен 

гипометилированного состояния гетерохроматина хромосом 1 и 16 в цито-

трофобласте хориона зарегистрирован нами впервые [135, 558].

Гипометилированность районов конститутивного гетерохроматина 

при  злокачественных  новообразованиях  можно  считать  доказанной. 

Так,  в  клетках  аденокарциномы  молочной  железы  гипометилирован 

гетерохроматин  хромосомы  1  [494],  в  лимфобластоидных  клетках  и 

клетках  опухолей  Вильмса  гипометилированы  районы  1q12  и  16q11 

[491, 776]. Известно также, что хорион человека, состоящий из трофэк-

тодермы, внезародышевой эктодермы и внезародышевой мезодермы, 

представляет собой активно пролиферирующую и бурно дифференци-

рующуюся ткань (cм. главу 1). Пролиферация и дифференцировка осо-

*

 Рисунок на цв. вкл.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

426

бенно интенсивны в цитотрофобласте хориона, который представля-

ет  собой  камбиальный  слой  синцитиотрофобласта,  обеспечивающий 

трофику зародыша. Индекс пролиферативного потенциала хориона до 

13-й недели развития соответствует таковому для некоторых злокаче-

ственных опухолей [734]. Вероятно, механизмы, обеспечивающие ин-

тенсивную пролиферацию малигнизированных клеток и нормальных 

клеток хориона весьма схожи или даже идентичны. Не исключено, что  

в  гетерохроматине  локализованы  гены пролиферации  и  клеточного 

роста, а также факторы их регуляции, активация и инактивация кото-

рых осуществляется путем изменения характера метилирования. Пред-

положения о наличии в гетерохроматине эмбриоспецифичных струк-

турных генов, контролирующих ранние стадии эмбриогенеза человека, 

высказывались и ранее [158, 385]. Однако локализация в гетерохрома-

тине необходимых для раннего развития генетических элементов (ран-

них генов), активных до начала функционирования эухроматинового 

генома  эмбриона,  показана  только  у  дрозофилы  [712]  и  у  пашенной 

полевки  [807].  К  сожалению,  технологии  секвенирования,  позволив-

шие провести расшифровку 98

 

% генома человека, не позволили уста-

новить  первичную  последовательность  нуклеотидов  участков  ДНК, 

входящих в состав конститутивного гетерохроматина. Поэтому вопрос 

о наличии в них структурных генов остается по-прежнему открытым.

Известно,  однако,  что  в  состав  прицентромерного  гетерохромати-

на,  кроме  АТ-богатой  альфа-сателлитной  ДНК,  входят  три  класса  сател-

литной  ДНК,  различающихся  по  насыщенности  CG-нуклеотидами  и 

предпочтительному  распределению  по  хромосомам.  Так,  обогащенные  

АТ-парами повторяющиеся последовательности сатДНКI преимущественно 

локализованы в гетерохроматине хромосом 3 и 4, коротких плеч хромосом 

групп D и G, а также в длинном плече Y-хромосомы. Имеющие и АТ- и CG-

пары сатДНКII и III также имеют хромосом-специфичное распределение — 

сатДНКII в районах 1qh и 16qh, сатДНКIII — в районе 9qh, прицентромерном 

гетерохроматине коротких плеч акроцентриче ских хромосом и Y-хромосоме 

[485, 610]. Известно также, что сатДНКIII хромосомы 9 состоит из пентаме-

ров, 5–15

 

% которых содержат CpG-по следовательности [523]. Именно эти 

сатДНК, в которых могут быть локализованы регуляторные CpG-после-

довательности структурных генов, и оказываются гипометилированными 

в экстраэмбриональных тканях. Возможно, экспрессия этих генов необхо-

дима для формирования дефинитивной хорион-аллантоидной плаценты.

427

Глава 10.

 структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

У двух эмбрионов 6 недель развития после обработки HpaII в цитот-

рофобласте сигнал был обнаружен в гетерохроматине только в одной из 

хромосом 1, в то время как после обработки MspI сигнал в 1q12 — за-

регистрирован в обеих хромосомах [135]. Следовательно, сайты-мише-

ни CCGG в 1q12 только в одной из гомологичных хромосом находились  

в деметилированном состоянии, тогда как в другом гомологе этот район 

был метилирован и, по-видимому, функционально неактивен. На более 

поздних сроках развития (7–8 недель) при такой же предобработке хро-

мосом  сигнал  детектировался  в  районах  прицентромерного  гетерохро-

матина обоих гомологов хромосом 1, 9, 16. Можно предполагать, что до 

6-й недели развития в клетках хориона функциональную нагрузку несет 

район 1q12 лишь одного из гомологов, а после 6 недель функционируют 

обе хромосомы. На этих же сроках беременности, но в эмбриональных 

тканях прицентромерный гетерохроматин гиперметилирован и, возмож-

но, функционально инертен. Нельзя исключить, что отмеченные разли-

чия между гомологами в клетках цитотрофобласта обусловлены разной 

функциональной значимостью гетерохроматина родительских хромосом 

в развитии хориона и плаценты. Однако никаких доказательств в пользу 

этого предположения пока не получено.

10.3.4. особенности метилирования

 хромосом при анеуплоидии

Особый интерес представляет метилирование хромосом при анеу-

плоидии. Паттерн метилирования триады хромосом был изучен нами 

у двух зародышей с разными трисомиями.

В  случае  трисомии  16  показанием  к  прерыванию  беременнос-

ти в срок 6/7 недель явилась анэмбриония, т. е. отсутствие эмбриона  

в  плодном  пузыре.  Благодаря  гетероморфизму  гетерохроматиновых 

блоков  хромосомы  16  удалось  установить,  что  нерасхождение  про-

изошло в оогенезе, в первом делении мейоза. После ник-трансляции на 

препаратах из клеток цитотрофобласта, предобработанных MspI, сиг-

налы были выявлены в районе 16q11 во всех трех гомологах, а после 

предобработки HpaII — лишь у двух гомологов из триады (рис. 10.20)

*

. 

При этом отсутствие ник-трансляционного сигнала зарегистрировано 

в  гетерохроматиновом блоке хромосомы 16  материнского  происхож-

дения во всех клетках. У эмбрионов с нормальным кариотипом такого 
* 

Рисунок на цв. вкл.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

428

же срока гетерохроматин хромосомы 16 обоих гомологов характеризо-

вался наличием сигнала. Известно, что трисомия 16 является наиболее 

частой хромосомной аномалией у ранних спонтанных абортусов (31

 

% 

от  всех  трисомий),  особенно  при  анэмбрионии.  При  развивающейся 

беременности  она  крайне  редка  и  ограничена  исключительно  цито-

трофобластом. Возможно, в первом триместре дисбаланс, обусловлен-

ный дополнительной хромосомой 16, частично компенсируется за счет 

метилирования и инактивации, возможно, «ранних генов», локализо-

ванных в прицентромерном гетерохроматине. Этот механизм, однако, 

оказывается неэффективным на более поздних стадиях. Данное пред-

положение требует, несомненно, более детальных исследований.

Характер метилирования был изучен также в ФГА-стимулированных 

лимфоцитах пуповинной крови плода 23/24 недель развития с кариоти-

пом  47,ХХ, + 13.  По  гетероморфизму  коротких  плеч  хромосом  13  было 

установлено отцовское происхождение дополнительной хромосомы при 

нерасхождении в первом делении мейоза. При сравнении характера мети-

лирования гомологов хромосомы 13 выявлено различие в районе 13q11, 

являющемся  R-сегментом.  Так,  на  дополнительной  хромосоме  отцовс-

кого происхождения в этом участке хромосомы после обработки HpaII 

сигнал отсутствовал, т. е. этот сегмент был гиперметилирован, тогда как 

после обработки MspI было характерно включение меченых нуклеотидов 

в тождественный район всех трех хромосом (рис. 10.21).

Рис. 10.21. Различия в характере метилирования района 13q11 между гомологичны-

ми хромосомами в ФГА-стимулированных лимфоцитах пуповинной крови плода при 

трисомии 13. Ник-трансляция in situ с предобработкой HpaII: a – метафазная плас-

тинка; б – триада хромосом 13. Наличие ник-трансляционного сигнала в районе 13q11 

отмечено знаком « + », отсутствие — знаком «–»

 

а) 

 б)

429

Глава 10.

 структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

Таким  образом,  в  обоих  случаях  трисомии  было  зарегистрирова-

но  изменение  статуса  метилирования  отдельных  локусов  на  допол-

нительных хромосомах, что косвенно указывало на их инактивацию. 

Возможно, таким способом осуществляется реализация некоего «ком-

пенсаторного  механизма».  Безусловно,  гипотеза  об  избирательной 

компенсации дозы генов на уровне хромосомных сегментов в случае 

наличия дополнительных хромосом в кариотипе основана пока на еди-

ничных фактах. Однако их накопление и детальный анализ, возможно, 

позволят  выяснить  механизмы,  действующие  в  несбалансированных 

кариотипах.

10.4. Анализ особенностей метилирования 

метафазных хромосом человека с помощью 

моноклональных антител

Одним  из  прямых  подходов,  позволяющих  непосредственно  ре-

гистрировать статус метилирования хромосом, являются опыты с ис-

пользованием специфических антител к 5-метилцитозину (АТ-МеС). 

Моноклональные АТ-МеС получены и апробированы на хромосомах 

млекопитающих в 1974 году Первые же эксперименты показали пер-

спективность их использования для изучения особенностей метилиро-

вания интерфазных ядер и метафазных хромосом человека [307, 368, 

632, 717].

Учитывая крайне скудную информацию об особенностях диффе-

ренциальной окраски хромосом человека с использованием антител к 

5-метилцитозину, на первом этапе нами был исследован статус мети-

лирования хромосом в ФГА-стимулированных лимфоцитах перифери-

ческой крови у взрослых доноров.

10.4.1. Принцип метода и новый вариант 

дифференциальной окраски — М-сегментация

Техника иммуноцитохимического окрашивания метафазных плас-

тинок с использованием моноклональных антител к 5-метилцитозину 

подробно изложена в Приложении. Отметим только, что одним из клю-

чевых этапов в процессе связывания АТ-МеС с участками, содержа-

щими метилированный цитозин, является денатурация хромосомной 

ДНК. При апробировании двух наиболее распространенных способов 

денатурации — УФ-облучение и воздействие 2М HCl — в качестве оп-