содержание .. 51 52 53 54 ..

Цитогенетика эмбрионального развития - часть 53

Цитогенетика эмбрионального развития человека

406

ности, при котором специфический характер дифференциальной

активности генов определяется полом организма, от которого эти

гены унаследованы [19, 20].

10.2.1. Метилирование дНК и геномный импринтинг

У млекопитающих, насекомых и высших цветковых растений отцов-

ские и материнские гены могут проявлять дифференциальную супрессию

уже на ранних стадиях онтогенеза. При этом наблюдается видимое иска-

жение менделевских правил наследования отдельных признаков. В участ-

ках генома, подверженных импринтингу, экспрессируется только одна

аллель — отцовская или материнская. Иными словами, экспрессия им-

принтированного гена в организме-потомке определяется его родитель-

ским происхождением, то есть зависит от того, передается ли он геномом

спермия или яйцеклетки. Данные по геномному импринтингу у челове-

ка были суммированы на конференции National Institute of Child Health

(USA) [893]. Они подробно рассмотрены в ряде отечественных обзоров и

сборников [63, 120, 121, 128].

Молекулярные механизмы этого явления в настоящий момент до

конца неясны. Однако доказано, что в механизме импринтинга основ-

ная роль принадлежит модификации белков хроматина и ДНК, в ча-

ст ности, процессам ацетилирования гистонов и метилирования генов.

Детали импринтинга в родительских половых клетках, его сохранение

в клетках эмбриона и роль в регуляции экспрессии генов в эмбриоге-

незе, долгое время оставались неясными. За последние годы в изуче-

нии феномена геномного импринтинга достигнуты серьезные успехи:

1) определены cis-действу ющие последовательности, играющие важ-

ную роль в контроле импринтинга, 2) установлено время появления и

элиминации импринтов в половых клетках, 3) выяснена динамика ме-

тилирования импринтированных генов в пре- и постнатальном онто-

генезе, 4) показана кластерная локализация импринтированных генов

в геноме, 5) установлена асинхронность репликации импринтирован-

ных генов.

Важнейшие события, связанные с геномным импринтингом, про-

исходят еще в гаметогенезе. При этом как в мужских, так и в женских

гаметах вначале происходит стирание (удаление) предсуществующих

импринтов, унаследованных от родителей, а затем устанавливаются

собственные импринты в соответствии с полом особи.

407

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

Для развивающихся половых клеток характерна последовательная

смена двух событий: тотальное деметилирование ДНК и ее реметили-

рование. К 12–13 дням эмбрионального развития мышей ДНК в пер-

вичных половых клетках находится в неметилированном состоянии

независимо от пола зародыша [361, 363]. К 15–16 дням развития про-

исходит реметилирование большинства последовательностей генов

(за исключением CpG-островков). При этом различия в характере ме-

тилирования отцовских и материнских хромосом сохраняются только

в нуклеотидных последовательностях некоторых генов [361, 363].

Следует отметить, что общее деметилирование ДНК, характерное

для ранних стадий развития половых клеток, касается также и всех

импринтированных генов [843]. Так, показано, что еще на 12,5 день

развития в первичных половых клетках импринтированные гены Igf2r,

p57, Kip2, Peg1, Peg3, Snrpn, U2afrs1 находятся в неметилированном

состоянии [404, 843]. Единственная последовательность, которая, по-

видимому, может избегать общего деметилирования в раннем развитии

половых клеток, — это 5’-район гена Xist, ответственного за инактива-

цию одной из Х-хромосом у зародышей женского пола, необходимой

для компенсации дозы генов [746].

В оогенезе у мышей процесс метилирования de novo происходит на

стадии роста ооцитов вскоре после рождения. Это было показано для

некоторых повторяющихся последовательностей [481], для гена Igf2r

[843], а также трансгенов — чужеродной ДНК, включенной в геном

ооцита [288].

В мужских половых клетках время установления импринтинга точно

не выяснено. По всей видимости, метилирование генов Н19 и Igf2 про-

исходит также вскоре после рождения, о чем косвенно свидетельствует

высокий уровень метилтрансферазы Dnmt1 в ядрах сперматогониев.

После оплодотворения и вплоть до стадии бластоцисты происхо-

дит глобальное деметилирование генома зародыша, то есть стираются

импринты мужских и женских геномов. У мыши однокопийные гены

деметилируются в течение первых делений дробления и остаются

гипо метилированными до стадии поздней гаструлы. Импринтирован-

ные сайты мужского генома деметилируются к 8-клеточной стадии,

а полностью гаметический импринтинг стирается уже на стадии мору-

лы (8–16 бластомеров) [646]. Тотальное деметилирование на началь-

ных стадиях дробления, по-видимому, отражает процесс дедиферен-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

408

цировки геномов мужского и женского пронуклеусов и приобретение

геномом дробящегося зародыша плюриопотентного состояния. Проис-

ходящий на стадии морулы процесс компактизации ведет к первичной

дифференцировке на внутреннюю клеточную массу и трофэктодерму

(см. главу 1) и сопровождается быстрой утратой тотипотентности кле-

ток трофобласта. Дальнейшая дифференцировка клеток внутренней

клеточной массы с образованием трех зародышевых листков сопро-

вождается установлением характерного для каждого из них паттерна

метилирования. Таким образом, происходит активация одних и ин-

активация других комплексов генов в результате чего формируется

окончательная генетическая программа, обеспечивающая нормальное

развитие целого зародыша и его отдельных зачатков [448, 646, 747].

Стадия бластоцисты характеризуется началом тотального метилиро-

вания ДНК зародыша de novo. Предположительно, метилирование про-

исходит в период от 5,5 до 6,5 дней развития мыши, то есть вскоре после

имплантации. К 6,5 дням все однокопийные гены, не имеющие CpG-ост-

ровков, уже метилированы. В то же время гены, содержащие CpG-остров-

ки, гомеобоксные гены и активные аллели импринтированных генов ме-

тилируются de novo на более поздних стадиях развития. Как уже упоми-

налось, первичные половые клетки, т. е. клетки будущих дефинитивных

гамет, избегают метилирования de novo вплоть до момента заселения

гонад (у мышей — 11,5 дней развития). Метилирование в этих клетках

происходит только после 14-го дня развития [747].

Аллель-специфический паттерн метилирования, установленный

еще в эмбриональный период, сохраняется и в соматических клетках

взрослых индивидов. Так, в культивируемых фибробластах функцио-

нирует только отцовская аллель гена Igf2, тогда как материнская аллель

этого гена экспрессируется только при добавлении в культуру клеток

ингибитора метилтрансферазы — 5-азадеоксицитидина [212].

Изменения эпигенотипа, приводящие к ослаблению или нару-

шению установившегося импринтинга, способствуют развитию па-

тологических состояний клетки, в частности, ее злокачественному

перерождению. В этой связи особый интерес представляет изучение

молекулярных механизмов установления и поддержания аллель-спе-

цифичного метилирования.

В настоящее время предполагается существование, по крайней мере,

двух механизмов узнавания импринтированных участков генома.

409

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

Согласно одному из них, прямые тандемные повторы, находящиеся

в CG-обогащенных последовательностях и ассоциированные с райо-

нами дифференциального метилирования, могут являться молеку-

лярными маркерами импринтированных генов [665]. Действительно,

при изучении первичной структуры импринтированных генов было

установлено, что большинство из них содержат в своих регуляторных

областях прямые тандемные повторы. Сравнительный анализ таких

повторов не выявил высокой гомологии их последовательностей. Од-

нако высокое содержание гуанина, сходная протяженность и характе-

рная локализация по отношению к кодирующей части гена позволили

предположить, что эти последовательности могут исполнять роль мо-

лекулярных маркеров импринтированных генов. По-видимому, такие

повторы могут формировать альтернативные вторичные шпилечные

структуры ДНК или специфичные хроматиновые домены, которые,

в свою очередь, могут маркировать участки, в которых будет происхо-

дить метилирование de novo в гаметах или в клетках зародыша [327].

Согласно второму механизму, важная роль в аллель-специфичной

экспрессии генов принадлежит транскриптам импринтированных ал-

лелей. Рассмотрим этот механизм на примере одного из трех генов, для

которых доказано существование антисмысловых транскриптов. Так,

для материнской аллели гена Igf2r у мыши показан синтез антисмыс-

лового транскрипта, функция которого заключается в подавлении экс-

прессии отцовской аллели этого же гена, результатом чего становится

моноаллельная экспрессия материнского гена [500]. Мутации, нару-

шающие синтез такого антисмыслового РНК-транскрипта, приводят

к экспрессии отцовского гена Igf2r [569].

10.2.2. инактивация Х-хромосомы

Ярким примером регуляции активности генов, ключевым звеном

которой является нетранслируемый транскрипт, является инактивация

Х-хромосомы в соматических клетках самок млекопитающих.

Процесс инактивации начинается на определенном участке, так на-

зываемом «центре инактивации Х-хромосомы», в котором картирован

ген Xist (Х-инактивирующий специфический транскрипт). Ген Xist име-

ет три промотора — Р0, Р1 и Р2. Если транскрипция осуществляется с

промоторов Р1 и Р2, то образуется стабильный транскрипт размером

15 000 п. о., если с промотора Р0 — возникает нестабильный продукт.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

410

Пере ключение транскрипции с промотора Р0 на Р1\Р2 коррелирует с

началом процесса инактивации Х-хромосомы [755]. Накопление спе-

цифических стабильных РНК-транскриптов по длине Х-хромосомы

ведет к образованию так называемой «РНКовой шубы», которая посте-

пенно покрывает всю Х-хромосому и детерминирует ее инактивацию.

В функционально активной Х-хромосоме ген Xist инактивирован. Суп-

рессия гена Xist определяется метилированием CpG-динуклеотидов в

последовательности 5’-GCGCCGCGG–3’ (от – 44 до – 36), располо-

женной в промоторной области гена Xist [447]. Наличие или отсутс-

твие метилирования этого участка определяет активность гена Xist на

доимплантационной стадии развития. Показано, что после обработки

культивируемых клеток 5-азацитидином происходит частичная реак-

тивация генов Х-хромосомы, что свидетельствует о значимой роли ме-

тилирования в создании и поддержании ин активированного состояния

Х-хромосомы [645, 778]. У эмбрионов мыши в доимплантационный

период (3,5–4-й день развития) в трофэктодерме и в первичной эндо-

дерме наблюдается импринтированная экспрессия гена Xist, причем

инактивируется преимущественно отцовская аллель. Для тканей само-

го зародыша характерна случайная инактивация Х-хромосомы [418].

10.2.3. Болезни, обусловленные

нарушениями метилирования

Выше уже упоминалось о двух сравнительно частых моногенных

заболеваниях (ICF-синдром и синдром Ретта), которые обусловлены

мутациями в генах метилтрансфераз. На сегодняшний день имеются

сведения более чем о 30 заболеваниях, основой которых являются на-

рушения метилирования ДНК, приводящие к аномалиям процесса им-

принтинга и, как следствие, к «болезням импринтинга» [120, 121, 128].

В основу классификации болезней импринтинга может быть положен

уровень организации генетического материала (геном, хромосомы,

гены), на котором проявляется эффект геномного импринтинга [120].

Нарушения на уровне целого генома приводят к развитию хорионэпи-

телиомы — злокачественной опухоли, возникающей при беременно-

сти из клеток трофобласта при наличии в них только отцовского гено-

ма и утрате генома ооцита, т. е. являющихся продуктом диспермного

оплодотворения (андрогенеза). Нарушения на хромосомном уровне,

обусловленные полной или частичной однородительской дисомией

411

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

хромосом или их сегментов, содержащих импринтированные гены,

могут осложнять течение беременности (плацентарная недостаточ-

ность) или проявляться после рождения (хромосомные болезни) [403,

532]. Импринтированные гены обнаружены на многих хромосомах

человека — 1, 5, 6, 11, 14, 15, 19, 20, Х. Два больших кластера имприн-

тированных генов локализованы на хромосомах 11 и 15. Патологичес-

кий эффект импринтинга, связанный с однородительской дисомией,

описан для хромосом 1, 2, 4–11, 13–16, 19, 20, 22 и Х. На генном уров-

не наиболее яркими примерами являются синдром Прадера–Вилли и

синдром Ангельмана, обусловленные мутациями, либо нарушениями

функций в кластере импринтированных генов в проксимальной час-

ти длинного плеча хромосомы 15. Предположительно с феноменом

геномного импринтинга связывают особенности наследования таких

частых заболеваний как маниакально-депрессивный психоз, хорея

Гентингтона, шизофрения, аутизм, миотоническая дистрофия.

10.2.4. роль метилирования в онкогенезе

Сохранение паттерна метилирования ДНК, характерного для каж-

дого типа клеток, важно для обеспечения их нормальной жизнедея-

тельности и функции. Вместе с тем, в настоящее время накапливается

все больше фактов, что его нарушение может играть существенную

роль в процессах трансформации нормальных клеток в опухолевые.

Изменения статуса метилирования широко распространены при спо-

радических раковых заболеваниях человека, характеризующихся гипо-

метилированием на уровне генома и локальным абберантным гиперме-

тилированием CpG-островков [861]. При этом оба процесса, одновре-

менно происходящие в разных районах генома, могут предшествовать

озлокачествлению [334]. Важная роль в онкогенезе принадлежит спон-

танному дезаминированию 5-метилцитозина в определенных районах

генов, которое приводит к точковым мутациям — заменам С на Т

(рис. 10.10). 24

% мутаций в гене опухолевого супрессора белка p53

составляют замены С→Т в динуклеотидах CpG, что является одной

из причин, детерминирующих образование солидных опухолей [658,

836]. Известно, что в гене p53 содержится около 290 CpG-динуклео-

тидов. При этом точковые замены в 23 CpG-динуклеотидах, располо-

женных в районе, кодирующем ДНК-связывающий домен, составляют

треть от общего числа мутаций в этом гене [560]. Установлена опре-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

412

деленная зависимость между расположением «горячих точек» мута-

ций и локализацией опухоли. Так, в гене р53 мутационные изменения

в кодонах 175, 248, 273 характерны только для опухолей молочной же-

лезы, яичника и для лейкемии [798], а в кодоне 157 — лишь для опухо-

лей легкого у курящих пациентов [709].

Существует три гипотезы, объясняющие роль гипометилирования

в индукции злокачественных образований — активация протоонкогенов,

хромосомная нестабильность и активация латентных ретротранспазонов

[836]. При этом уровень озлокачествления в определенной мере коррели-

рует со степенью метилирования геномной ДНК [776, 795].

Важную роль в опухолевой трансформации нормальных клеток

может играть и процесс гиперметилирования, в особенности, если он

затрагивает промоторные области генов онкосупрессоров (рис. 10.10).

Ген ретинобластомы pRb был первым из множества генов, для которых

была доказана взаимосвязь между гиперметилированием их промото-

ров и инактивацией транскрипции [435]. Такой же механизм регуляции

характерен и для генов, контролирующих клеточный цикл, дифферен-

цировку, апоптоз, репарацию ДНК, устойчивость к наркотическим

веществам, детоксикацию и т. д. [108]. Нередко гиперметилирование

промоторной области генов коррелирует с увеличением уровня актив-

Спонтанное

дезаминирование

Примеры: р53

Точковые мутации

Активация протоонкогена

Инактивация опухолевых

супрессоров

Гипометилирование

ТФ

Гиперметилирование

Примеры: bcl-2 в CLL,

K-Ras в опухолях легкого

и прямой кишки

Примеры: Rb в

ретинобластоме р16

в солидных опухолях,

р15 при лейкемии и

миеломе

Активная транскрипция

ДНК

pol II

ДНК

pol II

Рис. 10.10. Предполагаемое значение спонтанного дезаминирования 5-метилцитози-

на, гипометилирования и гиперметилирования в онкогенезе [792]

413

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

ности ДНК-метилтрансфераз, что ведет к стабильному выключению

функций онкосупрессоров, а также генов, контролирующих клеточ-

ную пролиферацию или апоптоз [539].

Сегодня не вызывает сомнения, что изменение статуса метилирования

может предшествовать началу опухолевой трансформации нормальных

клеток при многих раковых заболеваниях. Считается, что дефекты мети-

лирования, обусловленные действием различных эндогенных и экзоген-

ных факторов в сочетании с предсуществующими мутациями онкогенов

и онкосупрессоров, создают, согласно известной «двухударной гипотезе»

[546], необходимые условия для бласт-трансформации и злокачественно-

го роста [72]. Открытие этих механизмов послужило толчком для разра-

ботки многочисленных генетических тестов ранней диагностики, лечения

и прогнозирования онкологических заболеваний на основе изучения ста-

туса метилирования многих генов.

Важно отметить, что столь существенные в процессах онкогенеза

гены, контролирующие клеточную пролиферацию, дифференцировку

и апоптоз, являются, посути, «эмбриональными» генами, т. е. генами,

ответственными за раннее эмбриональное развитие.

10.2.5. статус метилирования

хромосом в эмбриогенезе человека

Согласно многочисленным исследованиям на зародышах млекопи-

тающих метилирование ДНК представляет собой универсальный и, по-

видимому, основной метод регуляции активности генов в развитии. При

этом для нормального развития необходимо соблюдение исторически

сложившегося порядка метилирования и деметилирования генома. Как

уже упоминалось (см. раздел 10.2.1), характерный для родительских га-

мет паттерн метилирования ДНК полностью стирается на начальных

этапах дробления, на стадиях морулы — ранней бластоцисты происхо-

дит тотальное неспецифичное метилирование ДНК, после чего по мере

дифференцировки в каждом клеточном клоне (линии) устанавливается

новый, специфичный для него паттерн метилирования. Следовательно,

по мере дифференцировки клеток и формирования зародышевых листков

все более активными становятся процессы специфического деметилиро-

вания индивидуальных генов и целых хромосомных доменов [84].

Логично предполагать, что, исследуя паттерны метилирования ДНК

на разных стадиях, можно получить ценную информацию о порядке

содержание .. 51 52 53 54 ..