Цитогенетика эмбрионального развития

Цитогенетика эмбрионального развития человека

398

ваются только клетки с числом активных ЯОР, не выходящим за рамки

нормального диапазона изменчивости [107, 669].

Жесткий отбор по числу аргентофильных ЯОP справедлив только

при допущении, что активность ЯОР индивидуальной хромосомы не-

изменна. Между тем, в норме активно транскрибируется не более по-

ловины всех р-генов [652], при этом активность некоторых ЯОР может

изменяться как в сторону увеличения, так и уменьшения в зависимости

от их сочетания в конкретном кариотипе для «настройки» оптимально-

го числа активных генов рРНК в клетке. Эти изменения могут иметь

стадиоспецифичный характер. Поэтому логично предположить, что и

при нормальном кариотипе, и при частичной анеуплоидии по ЯОР, уже

на самых ранних стадиях развития определяется число копий р-генов,

диапазон их активности, а также оптимальный уровень транскрип-

ции. При наличии в кариотипе целой дополнительной ЯО-хромосомы

многие параметры функционирования индивидуальных ЯОР, характе-

рные для нормального кариотипа, нарушаются. Так, согласно нашим

данным, при трисомиях 21 и 13 заметно возрастает по сравнению

с нормальным кариотипом доля хромосом группы D с вариабельными

ЯОР. Любопытно, что несмотря на общую тенденцию к снижению ак-

тивности ЯОР родительских хромосом, общий уровень транскрипции

р-генов не только заметно выше нормального, но и в значительной сте-

пени обусловлен высокой активностью ЯОР хромосом группы D, пре-

имущественно хромосомы 13. Наконец, при трисомиях ни для одной

из хромосом не установлено зависимости функционирования ее ЯОР

от родительской принадлежности. Этот факт, возможно, указывает на

то, что в условиях хромосомного дисбаланса регуляция работы всей

системы генов рРНК, если и осуществляется, то иначе, чем в норме.

Следует отметить, что при таких сублетальных трисомиях как три-

сомии 13 и 21 вклад дополнительной дозы активных р-генов на фоне

дисбаланса генетического материала целой хромосомы дискримини-

ровать достаточно трудно. Поэтому вопросы о влиянии добавочных

ЯОР на работу системы р-генов, а также всего генома по-прежнему

остаются открытыми.

Особый интерес вызывают механизмы взаимодействия, регуляции

и контроля дифференциальной транскрипции генов, в том числе и ге-

нов рРНК, специфичных для каждого родительского ЯОР [84]. Одним

из таких универсальных механизмов является уже упоминавшееся

399

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

метилирование ДНК, которому отводят ключевую роль в регуляции

транскрипции на уровне всего генома. Учитывая важную роль метили-

рования в реализации генетической программы эмбрионального раз-

вития человека, представляется целесообразным подробно рассмот-

реть существующие на эту тему данные.

10.2. Метилирование дНК как универсальный

механизм регуляции активности генов

В реализации наследственной информации на разных стадиях он-

тогенеза решающая роль принадлежит процессам молекулярной и

надмолекулярной (эпигенетической) регуляции функции генома. Под

эпигенетической изменчивостью понимают изменения дифферен-

циальной экспрессии генов, наследуемые в ряду митотических де-

лений клетки без нарушения нуклеотидной последовательности

ДНК. В настоящее время описаны два молекулярных эпигенетических

механизма: модификация гистонов и метилирование ДНК.

Метилирование — обратимая ковалентная модификация ДНК, проис-

ходящая в результате присоединения метильной группы к углероду в 5-м

положении цитозинового нуклеотида с образованием 5-метилцитозина.

В геномах млекопитающих, в том числе у человека, 5-метилци-

тозин преимущественно входит в состав динуклеотидов 5′-CG–3′

(так называемые CрG-динуклеотиды) — 70–80

% цитозина в со-

ставе CрG-динуклеотидов представлены 5-метилцитозином [231,

817]. Их небольшое число содержится в последовательностях 5′-

CpNpGp–3′ или асимметричных последовательностях 5′-CрА–3′ и

5′-CрТ–3′ [673]. В процессе эволюции происходит постепенная эли-

минация CрG-динуклеотидов, в результате чего их доля в геномах

высших эукариот составляет только 5–10

% от теоретически ожида-

емой [232]. Метилирование играет важную роль в этом процессе,

т. к. потеря большинства CрG-сайтов обусловлена превращением

метилированного цитозина в тимин в результате спонтанного деза-

минирования (рис. 10.6).

Распределение CрG-динуклеотидов по различным участкам гено-

ма млекопитающих неравномерно. В транскрипционно инертном

хроматине (гетерохроматине) CрG-динуклеотиды расположены с

частотой приблизительно 1 : 80. Гетерохроматин характеризуется

наличием метилированной, поздно реплицирующейся ДНК, труднодо-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

400

5-метилцитозин

цитозин

урацил

тимин

S-

аденозилметионин

S-аденозилгомоцистеин

Гидролитическое

дезаминирование

Репликация

ДНК

метилтрансфераза

Деметилаза

Репарация с

помощью ДНК

урацилгликозилазы

Дезаминирование

Рис. 10.6. Схема взаимного превращения цитозина и 5-метилцитозина и их мутаци-

онные изменения

ступной для транскрипционных факторов, а также соответствующим

набором гистонов и cпецифической нуклеосомной организацией. Для

функционально активного хроматина (эухроматина) более хара-

ктерны участки ДНК (500–5000 п. н.), называемые CрG-островка-

ми, в которых плотность CрG-динуклеотидов в пять раз больше, чем

в среднем по геному. Цитозин в эухроматине, как правило, находится

в неметилированном состоянии. Хроматин, содержащий CрG-остров-

ки, мало спирализован, отличается высокой степенью ацетилирования

коровых гистонов, практически полным отсутствием гистона Н1 и

сла бо выраженной нуклеосомной организацией. Все эти особенности

строения ДНК эухроматина позволяют ему активно взаимодействовать

с транскрипционными факторами. Согласно последним данным,

в ге но ме человека насчитывается около 29 000 CрG-островков, кото-

рые в основном расположены в промоторных областях и/или экзонах

всех генов «домашнего хозяйства» (house keeping genes) и некоторых

тканеспецифичных генов [326, 869].

Основными ферментами, обеспечивающими процесс метилиро-

вания в эукариотической клетке, являются метилтрансферазы. На се-

401

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

годняшний день идентифицировано три метилтрансферазы: DNMT1,

DNMT3A, DNMT3B. Ген метилтрансферазы-1 мыши (Dnmt1) высо-

коконсервативен [256], и его ортологи идентифицированы у разных

видов, в том числе и у человека (DNMT1) [512]. Продукт гена Dnmt1

поддерживает метилированное состояние ДНК в делящихся клетках.

Метилируя вновь синтезированную ДНК, метилтрансфераза-1 обес-

печивает воспроизведение родительского паттерна метилирования

в дочерних цепях ДНК после каждого раунда репликации (рис. 10.7).

Отсутствие фермента приводит к снижению общего уровня метили-

рования и гибели эмбрионов [572]. Однако эмбриональные стволовые

клетки таких мышей жизнеспособны и сохраняют способность к ме-

тилированию de novo, что указывает на наличие других метилаз [349].

Именно к таким метилазам относятся ферменты Dnmt3a и Dnmt3b

[689]. Совместное действие метилаз приводит к метилированию CрG-

динуклеотидов в неметилированной и полуметилированной ДНК

in vitro [688] (рис. 10.7).

Мутации в гене DNMT3B человека, приводящие к инактивации

каталитического домена фермента, идентифицированы у пациентов

с ICF-синдромом (Immunodeficiency, Centromeric instability, Facial

anomalies) Синдром ICF — аутосомно-доминантное заболевание, ос-

C G

G C

5’

3’

5’

C G

G C

5’

3’

5’

C G

G C

5’

3’

5’

C G

G C

5’

3’

5’

РРЕЕП

ПЛ

ЛИ

ИК

КААЦ

ЦИ

ИЯ

ДЕМЕТИЛИРОВАНИЕ

ПОДДЕРЖИВАЮЩЕЕ

МЕТИЛИРОВАНИЕ

Dnmt1

Dnmt3a, Dnmt3b

МЕТИЛИРОВАНИЕ

de novo

Dnmt3a, Dnmt3b

Рис. 10.7. Метилирование de novo и сохранение родительских схем метилирования в

раундах репликации

Цитогенетика эмбрионального развития человека

402

новными клиническими признаками которого являются лицевые ано-

малии, дефицит IgA и Т-клеток, инфекции верхних дыхательных путей

и склонность к злокачественным новообразованиям. Цитогенетичес-

кой характеристикой синдрома является нестабильность центромер-

ных гетерохроматиновых районов хромосом 1, 9, 16 и реже 2 и 10,

возникающая вследствие их гипометилированного состояния [306].

Статус метилирования в клетке может изменяться под влиянием

вредных факторов окружающей среды, в частности, тяжелых метал-

лов. Так, внутриклеточное накопление никеля вызывает нарушение

в структуре гетерохроматина, что, в свою очередь, приводит к гипер-

метилированию ДНК и инактивации близлежащих генов [333]. Малые

дозы кадмия при краткосрочном воздействии вызывают ингибирова-

ние метилтрансферазы и гипометилирование ДНК, в то время как при

его долгосрочном воздействии наблюдается обратный эффект, т. е. ак-

тивация метилтрансферазы и гиперметилирование ДНК [390].

Таким образом, эпигенетические изменения ДНК могут являться

одним из способов ответа организма на постоянно изменяющиеся фак-

торы окружающей среды.

Корреляция между экспрессией генов и степенью метилирования

ДНК выявлена в начале 1980-х годов [261, 372, 745]. Установлено, что

метилирование может влиять на интенсивность транскрипции как пу-

тем изменения эффективности связывания позитивных и негативных

факторов транскрипции с регуляторными участками генов, так и через

формирование неактивных участков хроматина (рис. 10.8) [262, 660].

Согласно первому механизму, 5-метилцитозин ингибирует связы-

вание c ДНК некоторых факторов транскрипции (АР-2, c-Myc/Myn,

цAMP-зависимый активатор CREB, E2F, NF-kB), мишенями для ко-

торых являются последовательности, содержащие CpG-нуклеотиды.

Однако некоторые транскрипционные факторы (SР-1, CTF) не чувс-

твительны к метилированию и связываются с участками ДНК, лишен-

ными CpG-динуклеотидов (рис. 10.8) [829].

В реализации второго механизма участвуют белки, которые специ-

фично связываются с метилированными СрG-динуклеотидами и ин-

гибируют присоединение к ДНК факторов транскрипции (рис. 10.8)

[466, 660]. Основная роль в этом процессе принадлежит метилцито-

зинсвязывающему комплексу (МЦСК), состоящему из 5 основных

белков: MBD1, MBD2, MBD3, MBD4 и MeCP2. Все белки этого комп-

403

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

Pol

MeCP2

MeCP1

1) Прямое взаимодействие 2) Специфические транскрипционные

с транскрипционным фактором репрессоры

Взаимодействие

ТФ с ДНК

невозможно!

Репрессия

посредством

MeCP2

Репрессия

посредством

MeCP1

-- CH

HDAC

Примеры ТФ:

Чувствительные к метилированию

AP-2, E2F, NF-kB, CREB, Myc/Myn;

Нечувствительные к метилированию

SP-1, CTF

Рис. 10.8. Возможные механизмы репрессии транскрипции посредством изменения

метилирования цитозина [792]

лекса, за исключением MBD4, выполняют репрессорную функцию пу-

тем изменения структуры хроматина. Белок MBD4 участвует в репара-

ции и предотвращает мутационные изменения метилцитозина [466].

MeCP2 является основным репрессорным белком комплекса МЦСК.

При его связывании с одиночными CpG-динуклеотидами репрессорный

эффект распространяется на несколько сот пар нуклеотидов. Белок состо-

ит из двух доменов: метилцитозинсвязывающего (MBD), отвечающего за

узнавание 5-метилцитозина, и репрессорного (TRD), имеющего сродство

к гистондеацетилазе и обеспечивающего блок транскрипции [661]. Взаи-

модействие ацетилаз с белком MeCP2 определяет ацетилирование около

% гистонов. Считается, что именно деацетилирование гистонов лежит

в основе инактивации гетерохроматина. При помощи специфических ан-

тител было установлено, что белок МеСР2 локализован преимуществен-

но в G-сегментах метафазных хромосом. Эмбрионы мыши, гомозиготные

Цитогенетика эмбрионального развития человека

404

по делеции гена МеСР2, погибают до рождения, что указывает на важную

роль белка МеСР2 в эмбриональном развитии [828].

Мутация в гене MеCP2, локализованном в X-хромосоме челове-

ка, приводит к развитию прогрессирующего нейродегенеративного

заболевания — синдрому Ретта. Характерные симптомы у пациенток на-

чинают проявляться в возрасте от 6 до 18 месяцев в виде прогрессирую-

щей ум ственной отсталости с утратой речевых способностей, аутизма и

атаксии. Мальчики с мутацией этого гена нежизнеспособны и умирают

вскоре после рождения [760].

Вторым метилцитозинсвязывающим белком является MBD2. Этот

белок, как и гистондеацетилазы HDAC1, HDAC2 и гистонсвязывающие

белки RbAp46, RbAp48, входит в состав комплекса MeCP1. В отличие от

МеСР2, для связывания с ДНК ему необходимо несколько CpG-динуклео-

тидов. Учитывая слабое сродство комплекса MeCP1 к метилированной

ДНК предполагается, что он выполняет вспомогательные функции в про-

цессе генной репрессии [611].

В настоящее время установлено, что для репрессии транскрипции

необходимо как метилирование ДНК, так и деацетилирование гисто-

нов. Остается, однако, неясным, что является первичным, т. е. опре-

деляет ли метилирование ДНК изменения в компактизации хромати-

на, либо изменения в упаковке хроматина маркируют участки ДНК,

где должно происходить метилирование de novo (рис. 10.9). С одной

стороны, специфические последовательности ДНК могут взаимодей-

ствовать с метилтрансферазами, a последующее присоединение к ДНК

метилцитозинсвязывающих белков и гистонацетилазного комплекса

приводит к стабилизации хроматина и невозможности присоединения к

ДНК транскрипционного комплекса (рис. 10.9, а). С другой стороны, сама

структура хроматина может определять последовательности генома, ко-

торые должны подвергаться метилированию de novo (рис. 10.9, б). Более

вероятно, что вначале осуществляется метилирование определенных

последовательностей ДНК, а затем изменяется структура хроматина,

в состав которого они входят [666, 744]. Не исключено также, что обе

программы просто дополняют друг друга, обеспечивая в процессе кле-

точной дифференцировки как длительное (перманентное) выключение

крупных информационных блоков активного хроматина (конформаци-

онные изменения), так и более лабильное (транзиторное) выключение

отдельных генов (метилирование).

405

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

метилаза

5-метилцитозин

МЦСК

Деацетилазный комплекс

Метилирование

de novo

Метилирование

de novo

Метелированная

ДНК

Метелированная

ДНК

Присоединение

МЦСК

Присоединение

деацетилазного

комплекса

Присоединение

деацетилазного

комплекса

Деацетилированный

конденсированный

хроматин

Гистоновый кор

Присоединение МЦСК

и стабилизирующего

хроматин комплекса

а)

б)

Рис. 10.9. Взаимосвязь между метилированием цитозина в молекуле ДНК и ацети-

лированием гистонов: а — метилированные участки ДНК определяют локализацию

сайтов связывания деацетилазного комплекса; б — присоединение деацетилазного

комплекса детерминирует участки, в которых должно происходить метилирование

ДНК [666]

Таким образом, метилирование ДНК, влияя на функциональ-

ную активность генов и на конформацию хроматина, выполняет

множество функций, одни из которых доказаны, другие активно

обсуждаются. Так, показана важная роль метилирования в регуляции

экспрессии тканеспецифичных генов, в клеточной дифференцировке,

в процессах репликации и репарации ДНК, в поддержании геномной

стабильности [127]. Предполагается, что метилирование играет важ-

ную роль в защите генома от мобильных генетических элементов [256,

682], а также в супрессии «чужеродных» генов, доставленных в клетки

с целью коррекции наследственных дефектов [78]. Метилирование в

районах с малой плотностью генов, в частности, в участках прицентро-

мерного гетерохроматина, по-видимому, необходимо для стабилизации

структуры, поддержания конформации и целостности хромосом [392].

В то же время, метилирование цитозина в составе CpG-динуклеотидов

в регуляторных элементах генов, как правило, подавляет экспрессию.

Наиболее подробно механизмы репрессии генов, обусловленные ме-

тилированием, изучены в отношении такого феномена как геномный

импринтинг — одного из вариантов эпигенетической наследствен-

а)

б)

Цитогенетика эмбрионального развития - часть 52