Цитогенетика эмбрионального развития

Цитогенетика эмбрионального развития человека

446

Морфометрические исследования гетерохроматиновых районов

проведены на препаратах хориона плодов 6–20 недель развития. Абсо-

лютные и относительные размеры С-блоков хромосом 1, 9 и 16 изме-

ряли на проекции с изображений метафазных пластинок, окрашенных

С-методом [148]. От каждого эмбриона анализировали по 10–20 мета-

фазных пластинок в интервале спирализации хромосомы 2 от 6,4 до

11 мкм (в этом интервале, согласно коэффициентам линейной регрес-

сии, не было выявлено отклонений от линейной зависимости).

Характер распределения абсолютных и относительных размеров

С-блоков для всех хромосом соответствовал нормальному. Средние

значения размеров С-блоков варьировали для каждой хромосомы и не

зависели от стадии развития (табл.10.7).

При сравнении полигонов частот абсолютных размеров С-блоков

хромосомы 1 обнаружено смещение распределения в сторону больших

значений для эмбрионов раннего (6–8 недель) по отношению к позд-

ним (18–20 недель) срокам развития (рис. 10.33, а) Для гетерохромати-

новых районов хромосом 9 и 16 такая зависимость не прослеживается

(табл.10.6).

Морфометрический анализ этих же сегментов хромосом 1, 9 и 16

в клетках цитотрофобласта был продолжен на препаратах, окрашен-

ных H33258/AcD. Выявляемые при таком способе окраски гетеро-

хроматиновые Q-сегменты исследовали при помощи полуавтомати-

Хромосома

Срок развития, нед.

Число

эмбрионов

Число

хромосом

Размер

С-сегментов



Х ± Sх, мкм

6–8

1,61 ± 0,07

1,48 ± 0,08

14–15

1,64 ± 0,14

18–20

1,39 ± 0,06

6–8

1,24 ± 0,04

1,29 ± 0,13

14–15

1,24 ± 0,10

18–20

1,31 ± 0,09

6–8

1,09 ± 0,03

1,03 ± 0,05

14–15

1,16 ± 0,07

18–20

1,08 ± 0,03

Таблица 10.7. Абсолютные размеры С-сегментов хромосом 1, 9 и 16 в клетках цито-

трофобласта на разных стадиях эмбрионального развития

447

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

ческой системы анализа изображений с программным обеспечением,

позволяющим точно измерять линейные размеры сегментов хромосом

(Видео-Тест, Карио 1.5). Для исключения межклеточного полимор-

физма от каждого из 129 эмбрионов исследовали по 1 метафазной

пластинке, на которых измеряли длину хромосом и соответствующих

Q-блоков. Уточнение границ блоков проводили по экстремумам произ-

водной кривой яркости. Длину гетерохроматинового сегмента опреде-

ляли в процентах от длины хромосомы.

Установлено, что характер распределения размеров Q-сегментов ге-

терохроматина хромосом 1, 9, 16 достоверно отличается от нормально-

го (Гауссового) распределения (tAs > 3) и аналогичен полученному на

первом этапе исследований С-сегментов (рис. 10.33, б). Вместе с тем,

0,5

1,5

2,5

3,5

1,24

1,37

1,5

1,63 1,76.

1,89

Ⱥɛɫɨɥɸɬɧɵɟ

ɪɚɡɦɟɪɵ

ɋ-ɛɥɨɤɨɜ (ɦɤɦ)

ɢɫɥɨ

ɜɚ

ɪɢ

ɚɧ

6-8 ɧɟɞɟɥɶ
18-20 ɧɟɞɟɥɶ

Относительные
размеры Q-блоков

Частота

вариант

9-12 недель

17-20 недель

)

Рис. 10.33. Распределение абсолютных (а) и относительных (б) размеров района 1qh

метафазных хромосом в клетках цитотрофобласта хориона и плаценты

Цитогенетика эмбрионального развития человека

448

интересно отметить, что при статистической обработке с использова-

нием дисперсионного анализа двухфакторных неравномерных комп-

лексов зависимость размеров гетерохроматиновых районов от стадии

развития оказалась значимой только для блоков 9qh и 16qh (F

1,00,

P > 0,05; F

10,82, P < 0,05; F

3,10, P < 0,01 соответственно). Разме-

ры этих же блоков достоверно отличались в цитотрофобласте и тка-

нях зародышевого происхождения у эмбрионов 6–10 недель развития

(табл. 10.8). Полученные нами результаты подтверждают полученные

ранее данные об увеличении размеров С-блоков хромосом 1, 9 и 16

в экстраэмбриональных тканях по сравнению с эмбриональными [119].

Учитывая очевидные недостатки морфометрического подхода, обу-

словленные выраженными межиндивидуальными различиями размеров

гетерохроматиновых блоков, зависимости их размеров от степени спи-

рализации хромосом и способов их окраски, а также от субъективных

факторов (способы измерений, пределы допускаемых по грешностей и

т. д.), данный подход едва ли может рассматриваться как перспектив-

Хромосома

№ эмбриона

Число проанализированных хромосом

Эмбриональные

клетки

Клетки

цитотрофобласта

23,5*

23,5**

119,5 **

15,5 ***

2 ***

23,5 **

37 **

20,5 **

59,5 **

47,5 **

98 **

25,5 **

21 **

Таблица 10.8. Сравнение относительных размеров Q-гетерохроматиновых блоков в

различных тканях плода (Т-критерий Уайта)

* p > 0,05.

** p < 0,01.

*** Нет критического значения.

449

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

ный в цитогенетике развития человека. Тем не менее, он позволил ус-

тановить различия в размерах гетерохроматиновых блоков хромосом 1,

9 и 16 в клетках хориона по сравнению с клетками соб ственно эмбрио-

нальных тканей и тенденцию к уменьшению линейных размеров этих

блоков с 6-й по 20-ю неделю внутриутробного развития.

Результаты морфометрического анализа в целом хорошо согласу-

ются с данными по структурно-функциональной организации хромо-

сом, полученными с помощью других, более чувствительных и более

специфичных методов (см. раздел 10.3, 10.4). Наличие крупных и, со-

ответственно, менее спирализованных блоков гетерохроматина в ци-

тотрофобласте хориона ранних зародышей человека хорошо согласу-

ется с их гипометилированным состоянием в клетках цитотрофобласта

и может свидетельствовать в пользу наличия функционально актив-

ных «ранних» генов в гетерохроматиновых районах этих хромосом.

Выявленная в ходе эмбрионального развития тенденция к уменьше-

нию размеров гетерохроматиновых блоков, которое сопровождается

их конденсацией и метилированием, подтверждается молекулярными

и иммуноцитохимическими методами. Эти данные служат косвенным

доказательством роли конститутивного гетерохроматина в инактивации

«ранних» генов.

10.6. особенности репликации

хромосом в эмбриогенезе человека

Репликация (репродукция) хромосом, состоящая в воспроизведе-

нии клеткой в каждом цикле деления полного набора хромосом, проис-

ходит на молекулярном уровне и касается двух основных компонентов

хромосомы — ДНК и гистонов.

Подходы к анализу репликации ДНК хромосом на цитологиче ском

уровне, разработанные в 1970–1980-е годы, основаны на введении в

пролиферирующие клетки предшественников ДНК в период синтеза

(S-фазы) и изучении особенностей их включения в отдельные сег-

менты хромосом на стадии метафазы после завершения репродукции.

Обычно в качестве модифицированного основания ДНК используют

аналог тимидина — 5-бромдезоксиуридин (БДУ). Репликационный

метод сегментации хромосом позволяет изучать синхронность реп-

ликации сегментов хромосом, обусловленную особенностями работы

репликационного комплекса, как внутри одного клеточного цикла, так

Цитогенетика эмбрионального развития человека

450

в нескольких делениях клетки. Так, долговременная инкубация клеток

с БДУ (в течение одного и более клеточных делений) используется для

регистрации сестринских хроматидных обменов [64] и оценки про-

должительности клеточного цикла [849]. Введение БДУ в S-периоде и

регистрация результатов на стадии метафазы того же клеточного цик-

ла позволяет изучать порядок репликации отдельных хромосом и их

сегментов (получение R-, G- или С-репликационной исчерченности)

[221, 320, 495]. Наиболее детальная характеристика паттерна реплика-

ции может быть получена при кратковременном (импульсном) введе-

нии БДУ в разные отрезки времени на протяжении S-периода. Регис-

трация участков хромосом, включивших БДУ, основана на изменени-

ях структуры хроматина и способности к окрашиванию некоторыми

флуорохромами (например, акридиновым оранжевым) или красителем

Гимза после УФ-облучения. Наибольшей чувствительностью обладает

иммуноцитохимический метод детекции БДУ с помощью специфиче-

ских антител, которые связываются с доступными эпитопами на одно-

нитевой ДНК независимо от структуры хроматина [320].

Эти цитологические подходы позволили установить основные за-

кономерности репликации сегментов хромосом и выявить взаимосвязь

процесса репликации с другими матричными процессами в хромосо-

мах эмбрионов человека.

Хорошо известно, что R-сегменты реплицируются в ранней S-фазе,

в то время как G- и С-сегменты — в поздней [474]. Показано также, что

в период R/G-перехода, когда прекращается репликация R-сегментов

и инициируется репликация G-сегментов, некоторые R- и G-сегмен-

ты реплицируются одновременно [276]. Этот период (средняя S-фаза)

характеризуется снижением или прекращением синтеза ДНК, возмож-

но, является контрольной точкой клеточного цикла [320]. Разделение

S-фазы достаточно условно, т. к. многочисленные периоды замедления

или остановки репликации ДНК указывают на существование множе-

ства перекрывающихся субфаз синтеза ДНК [196].

Тем не менее, репликация каждого сегмента в S-фазе строго упо-

рядочена [757, 758], а последовательность репликации участков хро-

мосом определяется их транскрипционной активностью [831]. Так,

при репликации генов до R/G-перехода наблюдается их экспрессия в

клетке, в то время как репликация данных локусов после R/G-перехо-

да сопровождается отсутствием транскрипционной активности [351,

451

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

405, 757, 759]. При этом изменение транскрипционного статуса вли-

яет на репликационный статус хромосомного сегмента. Время репли-

кации сегмента может изменяться в зависимости от типа ткани, что,

по-видимому, связано с транскрипционной активностью тканеспеци-

фичных генов. Например, в лимфоцитах хромосомы 4, 5, 8 и 13 закан-

чивают репликацию позже, чем в фибробластах почки, в то время как

хромосомы 15, 19, 20 и 22 реплицируются в лимфоцитах раньше, чем

в фибробластах [419].

Несмотря на то, что инициация времени репликации в индивиду-

альных сегментах хромосом находится под жестким генетическим

контролем, гомологичные сегменты могут реплицироваться асинх-

ронно, т. е. с некоторым интервалом во времени [371]. Следовательно,

контроль над репликацией сегмента в каждой отдельной хромосоме

осуществляется более строго по сравнению с регуляцией репликации

гомологичных сегментов [777]. Асинхронная репликация наиболее

выражена для импринтированных локусов, которые характеризуют-

ся различным функциональным статусом хроматина в гомологичных

хромосомах [575]. Так, если асинхронная репликация сегментов, со-

держащих импринтированные локусы, наблюдается в 40–90

% клеток

в разных тканях, то для остальных сегментов этот показатель не пре-

вышает 10

% [371]. Возможно, что механизмы асинхронной реплика-

ции сегментов, содержащих импринтированные и неимпринтирован-

ные локусы, могут быть различны [721].

Таким образом, время репликации, жестко взаимосвязанное с

транскрипционной активностью хроматина, можно рассматривать

как маркер функционального статуса сегмента хромосомы. Поэтому,

изучая особенности репликации отдельных хромосомных сегментов

в клетках эмбриональных и экстраэмбриональных тканей на разных

сроках развития, можно косвенно оценить их роль в процессе диффе-

ренцировки клеток эмбриона и хорион-аллантоидной плаценты.

Следует отметить, что при изучении порядка репликации хромосом-

ных сегментов хромосом необходимо иметь представление о продол-

жительности клеточного цикла в целом и S-фазы в частности. Извест-

но, что длительность стадий клеточного деления варьирует в разных

тканях и на разных этапах онтогенеза. Например, для ранних этапов

эмбриогенеза отмечена укороченная S-фаза с интенсивной реплика-

цией ДНК, которая обеспечивается увеличенным числом сайтов ини-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

452

циации репликации [653]. Однако сведения о временных параметрах

клеточного цикла в цитотрофобласте хориона и плаценты противоре-

чивы. Так, при длительности М-фазы не более 1 часа общая продолжи-

тельность клеточного цикла оценивается в 15 или 36 часов, а длитель-

ность S-фазы — от 5,5 до 10–16 часов, фазы G2 — 2–4 часа [33, 903].

Кроме того, при изучении клеточного цикла в условиях in vitro следует

учитывать особенности используемых методов. В частности, БДУ в

высоких концентрациях способен приводить к замедлению процесса

репликации вплоть до полного ее блокирования, что сопровождается

изменением длительности S-фазы [64, 320, 903]. Таким образом, изу-

чение параметров клеточного цикла представляет самостоятельный

научный интерес и требует использования специальных методов.

Стратегия нашего исследования заключалась в анализе метафазных

пластинок из спонтанно делящихся клеток цитотрофобласта и эмбри-

ональных тканей, которые находились на разных стадиях клеточного

цикла после 24-часовой инкубации в питательной среде, лишенной

синхронизирующих агентов. При инкубировании фрагментов тканей

в каждый культуральный флакон с определенной периодичностью им-

пульсно добавляли БДУ. Схема проведения экспериментов представле-

на на рисунке 10.34

. После фиксации материала и приготовления пре-

паратов «прямым» методом проводили регистрацию включения БДУ

в сегменты хромосом, используя моноклональные антитела к БДУ

(АТ-БДУ). Поэтому наше исследование последовательности реплика-

ции, по существу, сводилось к регистрации сегментов, реплицирую-

щихся одновременно в разные периоды времени на протяжении всего

периода инкубации. Избранный нами подход не требует четкого знания

о временных параметрах клеточного цикла, тем более что сведения о

продолжительности отдельных его стадий в клетках цитотрофобласта,

включая длительность S-фазы, согласно данным литературы значи-

тельно варьируют. Однако, используя в качестве маркера прохождения

клетками одного клеточного цикла наличие в одной из сестринских

хроматид БДУ [64], мы попытались уточнить продолжительность

S-фазы клеточного цикла в клетках цитотрофобласта хориона.

В клетках цитотрофобласта метафазные пластинки с флуоресцентным

сигналом АТ-БДУ только в одной из сестринских хроматид были полу-

чены после инкубации в течение 23 часов с добавлением БДУ на первые

Рисунок на цв. вкл.

453

Глава 10.

структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

два часа (рис. 10.35)

. Следовательно, в течение 24 часов клетки прошли

фазы G2, М, G1, S, G2 и снова вошли в митоз. Таким образом, с учетом

литературных данных о временных параметрах фаз М и G2 можно пред-

положить, что суммарная продолжительность фаз G1 и S в митотическом

цикле клеток цитотрофобласта составляет 15–17 часов [137].

При анализе характера репликационной структуры хромосом 500

метафазных пластинок из клеток эмбриональных тканей и цитотро-

фобласта хориона от 5–12-недельных эмбрионов, оказалось, что они

могут быть подразделены на несколько типов. После первых 6 часов

инкубации в большинстве метафазных пластинок включение БДУ на-

блюдалось преимущественно в R-сегменты. Однако в отдельных слу-

чаях сигнал АТ-БДУ был зарегистрирован также и в единичных G- и

C-сегментах. В следующие 8 часов инкубации характер репликацион-

ной исчерченности можно условно подразделить на пять типов: R-,

R + G-, G-, G + C- и C-сегментация. В последние 6 часов инкубации тип

сегментации соответствовал R + G-, G-, G + C- или C-рисункам [137].

Следует отметить, что при преимущественном включении БДУ в

R-сегменты флуоресцентные сигналы были представлены множест-

вом точек (рис. 10.36, а)

. Возможно, этот феномен, характерный для

ранней S-фазы, соответствует сотням репликационных вилок, рав-

номерно распределенным внутри нуклеоплазмы интерфазного ядра

[381] (рис. 10.36, б)

. При включении БДУ в поздней S-фазе репли-

кационный рисунок был представлен интенсивно флуоресцирующи-

ми четкими полосами, соответствующими G- и С-сегментам хромо-

сом (рис. 10.37, а)

, что, возможно, отражает уменьшение числа вилок

репликации при увеличении их размера [381] (рис. 10.37, б)

. Таким

образом, характер репликационного рисунка, полученного в резуль-

тате включения аналога тимидина в начале или конце S-фазы, может

служить косвенным маркером времени репликации того или иного сег-

мента.

В подавляющем большинстве метафазных пластинок в цитотро-

фобласте и реже — в клетках эмбриональных тканей наличие сиг-

нала АТ-БДУ было зарегистрировано в гетерохроматиновых райо-

нах хромосом 1, 9, 16, 15 и 22 и в некоторых G-сегментах (14–150 на

метафазную пластинку), что свидетельствовало об одновременнос-

ти их репликации (рис. 10.38)

. Интересно, что число и локализация

Рисунок на цв. вкл.

Цитогенетика эмбрионального развития - часть 58