Цитогенетика эмбрионального развития - часть 60

Цитогенетика эмбрионального развития человека

462

матин, 3) метилирование ДНК, 4) цитологические факторы регуляции 

генной активности, 5) феногенетика хромосомной патологии. В заклю-

чительном разделе главы будут кратко рассмотрены перспективы диа-

гностики, профилактики и лечения хромосомных болезней.

11.1. особенности структурно-функциональной 

организации хромосом на начальных 

стадиях развития

Известно,  что  мужской  пронуклеус  несколько  крупнее  женского, 

а метафазные хромосомы из спермия, как правило, менее спирализо-

ваны, чем женские, что позволяет говорить о гетероцикличности ро-

дительских наборов хромосом в 1-м делении дробления (см. главу 1). 

На стадии двух бластомеров гетероцикличность гомологов мужского 

и женского пронуклеусов уже исчезает. При этом, как показано в экс-

перименте, на единичных метафазных пластинках 1-го деления дроб-

ления отмечается парное расположение гомологов, то есть вытянутые 

деспирализованные  хромосомы  мужского  пронуклеуса  прилежат  не-

посредственно к более спирализованным (коротким) гомологам жен-

ского пронуклеуса [144, 190]. Представить случайный вариант такого 

парного расположения всех гомологов вряд ли возможно. Интересно, 

что число гетерохроматиновых С-блоков в интерфазных ядрах мыши-

ных зародышей на стадии двух бластомеров примерно соответ ствует 

диплоидному (2n

 

 = 

 

40), тогда как на стадии четырех бластомеров их 

число уменьшается почти вдвое и становится таким, как в дефинитив-

ном интерфазном ядре [144]. Высказано предположение, что данный 

феномен, напоминающий спаривание гомологов в 1-й метафазе мейо-

за, свидетельствует о неслучайном расположении гомологичных хро-

мосом на начальных этапах формирования архитектоники ядра и, по-

видимому, имеет важное значение для нормальной функции хромосом 

на последующих стадиях развития [11]. Отметим, однако, что парное 

расположение гомологов в зиготе пока было зарегистрировано только 

у лабораторных мышей. Исследование поведения хромосом в 1-м де-

лении дробления у зародышей человека не проводилось. По этому не-

известно, в какой мере данный феномен имеет универсальный харак-

тер. Эти наблюдения позволяют предполагать, что у млекопитающих 

и, возможно, у человека основные события, связанные с формирова-

нием дефинитивного клеточного ядра, определяющие все дальнейшее 

463

Глава 11. 

Горизонты цитогенетики эмбрионального развития человека

развитие зародыша происходят в течение первых двух делений дроб-

ления.

Мы вернемся к этому феномену при рассмотрении проблемы фено-

генетики хромосомных аномалий (см. раздел 11.5). 

В настоящее время методом многоцветной гибридизации in situ с 

использованием цельнохромосомных проб проводится изучение 3-мер-

ного положения хромосом в интерфазном ядре [562]. Установлено, что 

хромосомы расположены в ядре не случайно, а занимают характерные 

для каждой пары территории. Такое взаиморасположение хромосом в 

ядре получило название функциональной компартментализации [490]. 

Координаты хромосомных территорий в интерфазном ядре зависят от 

длины хромосомы, ее структуры, времени репликации и функциональ-

ной активности [680]. Так, хромосомы с высокой концентрацией генов 

(например, хромосома 19) обычно занимают центральное положение, 

а хромосомы примерно того же размера с низкой концентрацией ге-

нов (хромосома 18) располагаются по периферии интерфазного ядра 

[702]. Пока такие исследования ограничены только клетками взросло-

го организма. Архитектоника ядра у эмбрионов остается практически 

неизученной. Отсутствует информация и о том, как меняется взаимо-

расположение хромосом в ядрах зародыша человека в разных зачатках, 

тканях и на разных стадиях развития. Между тем, нет сомнения в том, 

что такая динамика, безусловно, существует, и она важна для обеспе-

чения нормальной функции генома, то есть для транскрипции генов. 

Связь хроматина с внутренней ядерной мембраной, формирование пе-

тель ДНК транскрипционно активного хроматина, их взаимодействие 

с ядерным матриксом привлекает внимание многих исследователей и 

позволяет приблизиться к пониманию функции генома с позиции мо-

лекулярной цитогенетики [323, 348, 436].

Таким образом, комплексное изучение динамики микроархитекто-

ники клеточного ядра в процессе онтогенеза, начиная с самых ранних 

стадий развития, с использованием методов молекулярной цитогене-

тики, электронной микроскопии, биохимии и иммуногистохимии име-

ет принципиально важное значение для понимания функций генома, 

экспрессии генов и проблем феногенетики в процессах нормального и 

патологического развития зародышей человека.

Основным цитологически определяемым признаком начала функ-

циональной активности хромосом в эмбриогенезе является появление 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

464

ядрышек,  которые  хорошо  визуализируются  в  интерфазных  ядрах  и 

на  метафазных  хромосомах  после  окраски  азотнокислым  серебром 

(см. главу 10 и Приложение). Опыты на лабораторных мышах доказы-

вают, что кластеры рибосомных генов становятся функционально ак-

тивными на стадии поздних 2 бластомеров и выявляются на всех стади-

ях клеточного цикла, начиная со стадии 4 бластомеров [171]. Важные 

сведения об асинхронности транскрипции главных рибосомных генов 

в норме и у партеногенетических зародышей были получены в экспе-

риментах на мышах и крысах с использованием окадаевой кислоты, 

вызывающей преждевременную конденсацию хромосом [59]. Точные 

данные о стадии эмбриогенеза человека, на которой включается транс-

крипция рибосомных генов, пока отсутствуют. Наши предварительные 

результаты  свидетельствуют  о  том,  что  на  хромосомах  доимпланта-

ционных зародышей человека аргентофильные ядрышкообразующие 

районы  не  определяются.  Гранулы  азотнокислого  серебра  фиксиро-

вались по длине хромосом, иногда концентрировались в теломерных 

районах, но не выявляли аргентофильные белки в типичных районах 

локализации кластеров рибосомных генов. Необходимы дальнейшие 

исследования для выяснения качественных и количественных особен-

ностей экспрессии рибосомных генов у нормальных и патологических 

зародышей человека ранних стадий развития.

Применение окадаевой кислоты, как было показано в эксперимен-

тах,  с  успехом  может  быть  использовано  и  для  выявления  анеупло-

идных зародышей и выяснения их происхождения [55, 59]. Благода-

ря  возможности  визуализации  хромосом  на  стадии  G1  в  мужском  и 

женском пронуклеусах и во 2-м полярном тельце впервые оказа лись 

доступными  не  только  точная  регистрация  числа  хромосом,  но и  

опр е де ление  родительского  происхождения  анеуплоидии,  а  также 

оценка  частоты  пресегрегации  хромосом,  то  есть  возникновения  

в первом делении мейоза непарных хроматид. Такие исследования, к 

сожалению, пока не были проведены на зародышах человека. Поэтому 

информацию о частоте анеуплоидии у ранних зародышей человека и 

вкладе отцовского и материнского геномов в возникновение структур-

ных и численных хромосомных аномалий пока следует рассматривать 

только как ориентировочную.

Возможно, применение этого цитогенетического приема (окадаевая 

кислота) позволит прояснить проблему, связанную с необычно высокой 

465

Глава 11. 

Горизонты цитогенетики эмбрионального развития человека

(38–46

 

%) частотой мозаиков с трисомией или моносомией хромосом 

среди зародышей человека 4-го дня развития [388] и высокую частоту 

мозаичной моносомии у ранних спонтанных абортов [100, 139]. Дан-

ный подход может найти применение и для проверки интересной гипо-

тезы М. Голубовского о постзиготической диплоидизации у триплоид-

ных зигот как источнике необычных вариантов анеуплоидии, включая 

мозаицизм, химеризм и близнецовость у эмбрионов человека [445].

Важные  результаты  о  структурно-функциональной  организации 

хромосом на ранних стадиях развития были получены и в серии экспе-

риментов с использованием различных рестрикционных эндонуклеаз. 

В частности, таких, которые выявляют Alu-повторы, либо метилиро-

ванные участки хромосом (см. раздел 11.2) [143]. Весьма примечатель-

ным в этой серии исследований явилось и установление такого любо-

пытного факта, что частота сестринских хроматидных обменов в хро-

мосомах дробящихся зародышей в несколько раз выше, чем в клетках 

зародышей постимплантационных стадий или в клетках взрослых жи-

вотных. Высказано интересное предположение о связи частоты СХО с 

уровнем метилирования ДНК в эмбриогенезе [143].

Таким образом, результаты экспериментов на дробящихся мыши-

ных зародышах свидетельствуют о том, что структура хромосом зако-

номерно меняется в ходе дробления и отличается от таковой в дефи-

нитивных соматических клетках. Естественно, эта информация важна 

для выяснения надмолекулярных (хромосомных) механизмов контро-

ля ранних стадий развития, а потому представляет большой интерес 

для цитогенетики (цитогеномики) эмбриогенеза человека.

11.2. структурная и функциональная роль 

гетерохроматина

Важная роль в формировании и поддержании архитектоники кле-

точного  ядра  принадлежит  гетерохроматину.  Последний  представ-

ляет  собой  блоки  высокоповторяющихся  последовательностей  ДНК, 

различных  по  протяженности  и  нуклеотидному  составу.  Часть  из 

них — сателлитная ДНК околоцентромерных районов — расположе-

на в области центромеры (структурный гетерохроматин). На ее долю 

приходится 2–3

 

% всей ДНК клетки. Особенно значительные по раз-

мерам и числу повторов блоки сатДНК находятся в прицентромерных 

районах хромосом 1, 9 и 16. Другие гетерохроматиновые блоки, «рас-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

466

сеянные» по длине хромосомы представляют интеркалярный гетеро-

хроматин, на долю которого приходится до 45–50

 

% всей ДНК клетки. 

Это так называемая «лишняя» или «эгоистическая» ДНК, назначение 

которой в ядре остается загадочным. Наконец, различают еще факуль-

тативный  гетерохроматин,  представленный  неактивной  гетерохро-

матизированной Х-хромосомой в соматических клетках с женским ка-

риотипом ХХ, идентифицируемый цитологически в интерфазном ядре 

как тельце Барра, а также в половом XY-пузырьке в сперматоцитах на 

стадии пахитены.

Ранее было принято рассматривать конститутивный (структурный) 

гетерохроматин как функционально инертный компонент генома эука-

риот, в том числе и человека. В настоящее время это понятие претерпе-

вает серьезные изменения. Все больше появляется данных, подтверж-

дающих известную гипотезу А. А. Прокофьевой-Бельговской о важной 

роли гетерохроматина не только как структурного компонента генома, 

но и как возможного регулятора его активности [158]. Существенную 

роль в этом сыграли исследования последних лет, касающиеся тонкой 

структурно-функциональной  организации  гетерохроматина  в  ядре, 

его роли в поддержании микроархитектоники интерфазных хромосом 

(хромосомных территорий), участие в процессах рекомбинации и об-

разовании межхромосомных перестроек, а также в регуляции генной 

экспрессии [779, 824]. Подробно изучены и биомеханизмы репрессии 

гетерохроматина и расположенных в нем структурных генов [61, 398]. 

В  частности,  установлено,  что  триггерная  роль  в  репрессии  гетеро-

хроматина принадлежит коротким (20–23 п. о.) некодирующим двухце-

почечным молекулам РНК (малые интерферирующие РНК — siRNA), 

которые  синтезируются  на  коротких  повторяющихся  последователь-

ностях. Присоединение этих молекул РНК к ДНК индуцирует каскад 

биохимических реакций, приводящих к метилированию цитозиновых 

остатков CpG-динуклеотидов, гипоацетилированию гистонов, опреде-

ляющих  нуклеосомную  организацию  ДНК,  и  присоединение  к  этим 

фрагментам  особых  белковых  комплексов,  полностью  изолирующих 

ДНК от действия транскрипционных факторов и, таким образом, пре-

дотвращающих транскрипцию генов [779].

Вместе с тем, если роль гетерохроматина в стабилизации центро-

меры, в поддержании 3-мерной пространственной архитектоники ядра 

и  в  обеспечении  точности  процессов  рекомбинации  и  хромосомных 

467

Глава 11. 

Горизонты цитогенетики эмбрионального развития человека

перестроек уже может считаться доказанной, то значение гетерохро-

матина в регуляции генной активности пока остается в области пред-

положений и спекуляций.

Исключение,  пожалуй,  составляет  только  факультативный  гетеро-

хроматин Х-хромосомы, механизмы инактивации которой изучены до-

статочно подробно [587]. В опытах на мышах установлено, что инакти-

вация одной Х-хромосомы у особей женского пола происходит еще во 

время дробления зародыша и, по-видимому, знаменует собой первич-

ную дифференцировку функционально и морфологически однородных 

бластомеров  на  клетки  внутренней  клеточной  массы  (ВКМ)  и  клетки 

трофэктодермы  (см. главу 1).  Непосредственно  контролирует  инакти-

вацию ген XIST, расположенный в центре инактивации Х-хромосомы 

XIC – Xq13.1. Экспрессия этого гена приводит к синтезу специфическо-

го РНК-продукта размером 13

 

000 п. о., который быстро распределяется 

по всей Х-хромосоме и является триггером таких реакций как инакти-

вация ДНК (метилирование цитозиновых нуклеотидов), стабилизация 

гистонов  (метилирование  лизинов,  гипоацетилирование),  посадка  на 

хроматин специфических белковых комплексов, стабилизирующих спи-

рализацию  (гетерохроматизацию)  ДНК  и  препятствующих  действию 

факторов транскрипции (см. также раздел 10.2.2). Существенно, что у 

мышей и, по-видимому, у человека процесс инактивации Х-хромосомы 

в троф эктодерме и ее производных, в том числе в клетках цитотрофоб-

ласта  плаценты  неслучайный  и  затрагивает  почти  исключительно  Х-

хромосому отцовского происхождения, то есть поступившую с геномом 

спермия. В клетках ВКМ и ее производных этот процесс рандоминизи-

рован, то есть одинаково часто инактивируются отцовская или материн-

ская Х-хромосомы. Следовательно, все особи женского пола у лабора-

торных млекопитающих и у человека являются природными мозаиками 

по генам Х-хромосомы, что имеет существенное значение в половом ди-

морфизме проявления мутаций генов Х-хромосомы [42]. Важно, одна-

ко, подчеркнуть, что основные сведения об особенностях инактивации  

Х-хромосомы в эмбриогенезе пока получены в модельных эксперимен-

тах на мышах. Существуют данные, что у зародышей человека на стадии 

4–8 бластомеров наблюдается экспрессия гена XIST только на отцовской 

Х-хромосоме. Это дает основание предполагать, что в производных тро-

фобласта у человека, так же как и у лабораторных мышей происходит 

избирательная  гетерохроматизация  (инактивация)  именно  отцовской  

Цитогенетика эмбрионального развития человека

468

Х-хромосомы [573]. На каких стадиях происходит инактивация Х-хро-

мосомы в эмбриогенезе человека окончательно не выяснено и заслужи-

вает специального анализа.

Характерным для интеркалярного гетерохроматина, сравнительно 

небольшие по длине фрагменты которого [617] рассеяны по хромосо-

мам, является метилирование цитозиновых остатков СpG-динуклеоти-

дов в ДНК и лизина 9 в гистоне Н3. Перманентная репрессия генов, 

прилежащих к интеркалярному гетерохроматину, достигается за счет 

специального комплекса белков, которые обладают гистон-деацетилаз-

ной активностью и способствуют метилированию лизина 9 в гистоне 

Н3 [824].

Роль интеркалярного гетерохроматина в регуляции активности ге-

нов детально изучена на политенных хромосомах дрозофилы. Именно 

эксперименты на дрозофиле позволили придти к заключению, что гете-

рохроматин играет важнейшую роль в регуляции времени экспрессии 

генов, скорости клеточного деления, роста и даже дифференцировки, 

то есть контролирует все основные временные параметры индивиду-

ального  развития  [61,  84].  Каким  образом  регулируется  активность 

генов  у  млекопитающих  и  у  человека,  какова  роль  молекулярных  и 

надмолекулярных механизмов, а также гетерохроматина в реализации 

программы  индивидуального  развития  остается  малопонятным.  Ин-

тенсивные исследования этих актуальных вопросов генетики и цито-

генетики развития продолжаются [108, 348, 550].

Известно, что области гетерохроматина сильно обеднены генами. 

Существование структурных генов в гетерохроматине до настоящего 

времени  подвергается  сомнению.  Области,  богатые  интеркалярным 

гетерохроматином,  такие  как  G-диски  метафазных  хромосом,  содер-

жат в десятки раз меньше генов, чем их концентрация в эухроматине 

(R-дисках) [161, 258]. Вместе с тем, присутствие в С-гетерохроматине 

структурных генов ранее было показано у дрозофилы [712] и пашен-

ной полевки [807]. Наши эксперименты с ник-трансляцией in situ на 

метафазных  хромосомах  плода  человека  после  обработки  ДНКазойI 

или  метил-чувствительной  рестиктазой  НраII,  а  также  результаты 

опытов с антителами к метилцитозину (см. главу 10) доказывают де-

метилированное состояние С-гетерохроматина в хромосомах 1, 9 и 16. 

На прямых препаратах из клеток хориона и плаценты деметилирова-

ние  особенно  выражено  на  одном  из  гомологов  этих  хромосом.  Эти 

469

Глава 11. 

Горизонты цитогенетики эмбрионального развития человека

наблюдения в сочетании с литературными данными дают достаточно 

оснований для предположения о наличии структурных генов в С-ге-

терохроматине этих хромосом и у человека. Более того, по аналогии с 

гетерохроматиновыми генами дрозофилы и пашенной полевки, можно 

предполагать, что эти гены контролируют ранние стадии эмбриогене-

за человека. По завершении этих стадий происходит их необратимое 

выключение в соответствии с ранее описанным механизмом стабили-

зации (инактивации) гетерохроматина (см. выше). Уместно отметить, 

что  согласно  прямым  цитогенетическим  исследованиям  зародышей 

человека с хромосомными аномалиями также получены данные, поз-

воляющие сделать вывод о возможной генетической активности гете-

рохроматиновых районов хромосом в мейозе. Правда, при этом гете-

рохроматину отводится важная роль не как месту локализации ранних 

генов, а, скорее, как фактору, детерминирующему пространственную 

архитектонику ядра [117].

Таким  образом,  функции  гетерохроматина  в  эмбриогенезе,  как, 

впрочем, проблема гетерохроматина вообще, все еще далеки от своего 

решения. Более того, эта загадочная часть геномной ДНК в эмбриоге-

незе человека только начинает изучаться. Вместе с тем, нет сомнения, 

что исследования гетерохроматина представляют собой одно из магис-

тральных направлений в цитогенетике развития человека.

11.3. Метилирование дНК в эмбриогенезе

В  предыдущих  разделах  мы  неоднократно  обращались  к  процес-

су  метилирования  ДНК  как  к  универсальному  механизму  регуляции 

генной активности. Напомним, что согласно наиболее общепринятой 

точке зрения, выключение работы структурных генов происходит в ре-

зультате метилирования CpG-нуклеотидов в промоторных частях гена, 

вследствие чего становится невозможной посадка на ДНК фермента 

РНК-полимеразы  II,  и  процесс  транскрипции  полностью  блокирует-

ся [84]. Метилирование лежит в основе таких важных биологических 

феноменов как геномный импринтинг, аллельное исключение, инакти-

вация Х-хромосомы, оно играет важную роль в процессах онкогенеза 

[121,  128,  746,  883].  Исследовать  метилирование  на  цитологическом 

уровне можно при помощи реакции ник-трансляции с использованием 

метил-зависимой эндонуклеазы НраII (см. главу 10) либо путем гисто-

химического  выявления  участков  хромосом,  насыщенных  метилиро-