Цитогенетика эмбрионального развития - часть 48

Цитогенетика эмбрионального развития человека

366

9.12.2. Неинвазивные методы пренатальной диагностики

Любое хирургическое вмешательство при заборе плодного материала 

неизбежно сопряжено с риском осложнений. Так, удаление бластомеров 

при доимплантационной диагностике может вызвать замедление темпов 

дробления и остановку развития эмбриона на ранних стадиях. После имп-

лантации инвазивное вмешательство с целью получения ворсинок хорио на 

или плаценты, околоплодных вод или крови из пуповины может привести 

к гибели плода и спонтанному прерыванию беременности. Поэтому раз-

работка неинвазивных методов пренатальной диагностики, позволя ющих 

избежать любых осложнений, представляется вполне оправданной.

Поиски методов получения плодного материала, исключающие хирурги-

ческое вмешательство, велись в двух направлениях. Одно из них включало 

изучение возможностей использования клеток плода из влагалища и цер-

викального канала матки; второе — клеток плода, циркулирующих в крови 

беременной женщины. Кратко рассмотрим основные достижения и недо-

статки этих подходов для диагностики хромосомных болезней.

9.12.2.1. Клетки плода в трансцервикальных образцах 

Еще в 1893 году было показано, что клетки трофобласта зародыша 

человека  могут  мигрировать  из  плаценты  в  маточную  вену  и  дости-

гать легких. Столетие спустя они были обнаружены и в цервикальном 

канале  матки  [213].  Механизмы  проникновения  клеток  трофобласта  

в цервикальный канал до сих пор не изучены, однако наличие клеток 

трофобласта в образцах цервикальной слизи было доказано различными 

методами.

Для получения трансцервикальных образцов на сроках беременнос-

ти 6–15 недель предложено несколько способов — соскобы и смывы 

со стенок канала, аспирация цервикальной слизи [213]. В зависимости 

от способа получения образцы в большей или меньшей мере конта-

минированы клетками материнских тканей, при этом эмбриональные 

клетки,  представленные  клеточными  элементами  плацентарных  тка-

ней, составляют около 30–50

 

% клеточного состава [273].

Для исследования полученного образца используется комплексный 

подход, который включает ПЦР для анализа высокополиморфных КТП 

и  FISH  c прицентромерными пробами на нативных  клетках и  после 

кратковременного культивирования, которое позволяет также провес-

ти кариотипирование [213].

367

Глава 9. 

Пренатальная диагностика хромосомных болезней

Использование  трансцервикальных  образцов  не  нашло  широкого 

применения  в  клинической  практике.  В  основном  это  обусловлено 

методическими  трудностями  работы  с  заведомо  контаминированными 

образцами, что резко снижает диагностическую ценность этого подхода. 

Несмотря на то, что некоторыми исследователями продемонстрирована 

высокая эффективность получения материала и его анализа для опреде-

ления пола плода и распространенных анеуплоидий [213], другие авторы 

получили результат лишь в 44 % случаев [677]. Кроме того, до сих пор 

не определен риск осложнений после получения плодного материала, так 

как все исследования были проведены непосредственно перед абортом. 

Редкие случаи, где этот анализ был дополнен традиционными методами 

пренатальной  диагностики  [677],  не  дают  оснований  определить  риск 

прерывания  беременности,  что  имеет  принципиальное  значение  для 

внедрения метода в медицинскую практику.

9.12.2.2. Клетки и дНК плода в крови матери 

В последние годы предприняты усилия по разработке методов прена-

тальной  диагностики  с  использованием  клеток  плода,  выделенных 

из  крови  матери.  Количество  клеток  плода,  циркулирующих  в  крови 

беременной,  оценивается  как  крайне  незначительное —  в  среднем  1×10–

4–10–6.  Однако  до  сих  пор  остается  дискуссионным  вопрос  о  динамике 

их  количества  на  разных  сроках  беременности,  а  также  сохранности  

в организме матери после родоразрешения или прерывания беременности.

Состав клеток плода в кровяном русле матери варьирует и представлен 

как элементами собственно крови плода, в том числе ядерными эритро-

цитами, так и клеточными элементами плаценты [23, 66, 384].

Предварительным этапом анализа является фракционирование крови 

беременной. Клеточная сортировка осуществляется с помощью методов 

проточной  цитофлуориметрии,  магнитной  активации  или  проточного 

центрифугирования. Все методы, применяемые для этих целей, позволяют 

обогатить  образец  клетками  плодного  происхождения.  Предприняты 

успешные попытки получения воспроизводимых в стандартных лабора-

торных условиях результатов с использованием ступенчатого центрифу-

гирования в градиенте плотности фиколла [66], либо путем отбора таких 

клеток  на  предметных  стеклах  при  помощи  иглы  микроманипулятора 

после предварительной окраски обогащенной суспензии для выявления 

фетального гемоглобина.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

368

Для  анализа  плодных  клеток,  выделенных  из  кровяного  русла 

матери,  как  правило,  применяются  высокотехнологичные  методы 

молекулярной  генетики  и  цитогенетики.  На  них  уже  продемонстри-

рованы  возможности  диагностики  пола  плода  и  распространенных 

анеуплоидий [23, 66, 678].

Исследование клеток плода в крови матери на практике может быть 

использовано не столько для диагностических целей, сколько с целью 

формирования  групп  высокого  риска  рождения  больного  ребенка. 

Однако  их  широкое  применение  в  режиме  скрининга  недоступно 

для широкой клинической практики по причине высокой стоимости. 

В то же время, методы, основанные на анализе плодного материала, 

представленного в крови матери, в некоторых случаях могут оказаться 

един ственно  возможным  методом  диагностики,  например,  при 

состоя ниях угрожающего выкидыша.

Интересным и многообещающим кажется предложенный недавно 

подход, основанный на анализе внеклеточной ДНК плода в крови матери 

[577].  Предполагают,  что  ДНК  вследствие  деградации  клеток  плода 

попадает  в  плазму  материнской  крови,  где  может  быть  обнаружена 

при помощи ПЦР. В настоящее время поступили сообщения уже из 

нескольких лабораторий мира об успешной диагностике по ДНК плода 

в крови матери резус-принадлежности и пола плода [478, 728].

Очевидно, что диагностика по клеткам плода в крови матери, равно 

как и доимплантационная диагностика, не могут быть альтернативой 

ПД  с  использованием  стандартных  инвазивных  методов  в  устано-

вленные сроки беременности. Именно благодаря высокой точности и 

минимальной опасности для матери и плода инвазивные методы прена-

тальной диагностики завоевали столь широкую популярность во всем 

мире.  Совершенствование  этих  стандартных  подходов  в  сочетании  

с повышением разрешающей способности молекулярных и цитогене-

тических методов исследования можно рассматривать как реальную 

перспективу развития пренатальной диагностики XXI века.

9.12.3. Комбинированный пренатальный

 скрининг хромосомных болезней в I тримеcтре

В  последнее  время  появляется  все  больше  сообщений  об  эффек-

тивности  ПД  в  I тримеcтре  беременности  в  наиболее  удобные  для 

хорионбиопсии  сроки  с  10-й  по  12-ю  недели  беременности  (см. 

369

Глава 9. 

Пренатальная диагностика хромосомных болезней

раздел 9.4.2).  Диагностика  основана  на  большой  дискриминационной 

силе двух маркерных сывороточных белков: свободной β-субъединицы 

хорионического гонадотропина и белка А, ассоциированного с беремен-

ностью (PAPP-A), и одновременной детекции двух новых УЗ-маркеров: 

толщины  воротникового  пространства  и  визуализации  назальных 

костей.  Такое  тестирование  позволяет  с  высокой  эффективностью  (до 

85 %) формировать группы высокого риска по рождению детей с хромо-

сомной  патологией  (болезнь  Дауна).  Анализ  обширного  клинического 

материала  свидетельствует  о  том,  что  увеличение  толщины  воротни-

кового пространства (ТВП) у плода более 2,5 мм, выявляемое при ультра-

звуковом скрининге на 11–14-й неделе беременности является серьезным 

маркером хромосомных болезней (выявляемость более 30 %) и аномалий 

сердца (почти 90 %).

Первая  публикация  об  отсутствии  носовых  костей  (НК)  как  УЗ-

маркере болезни Дауна появилась в 2001 г. [211] и сразу привлекла к себе 

пристальное внимание специалистов. При проспективном исследовании 

установлено отсутствие НК у 73 % плодов с болезнью Дауна (43 из 59). 

Дальнейшие исследования показали, что сочетание биохимиче ского (free 

β-HCG  +  PAPP-A) и ультразвукового скрининга (ТВП  +  НК) позволяет 

выявлять  до  97,5 %  плодов  с  хромосомными  аномалиями,  особенно  с 

болезнью  Дауна,  при  сравнительно  низком  (до  1,5 %)  числе  ложнопо-

ложительных  результатов.  Рассмотренный  вариант  комбинированного 

биохимического  и  ультразвукового  скрининга  в  I тримеcтре  беремен-

ности оказывается более эффективным, чем во II. Естественно, что ПД  

в первом триместре значительно предпочтительней, чем во втором, и для 

самой женщины.

Дальнейшим  шагом  в  совершенствовании  ПД  в  I тримеcтре  явилась 

разработка  методов  биохимического  и  ультразвукового  скрининга  с 

использованием  новых  высокоэффективных  автоматических  программ 

расчета  комбинированного  риска,  применение  которых  сокращает  время 

выдачи ответов до 1–2 часов. Это позволило в ряде стран Западной Европы 

(Великобритания) организовать специальные клиники разовых посещений 

для оценки риска хромосомных болезней (болезни Дауна) у плода: OSCAR 

(One Step Clinic for Assessment of Risk). С учетом их высокой пропускной 

способности  и  эффективности,  несомненных  удобств  для  беременных, 

организация  подобных  клиник  в  России  явилась  бы  важным  государс-

твенным шагом на пути профилактики хромосомных болезней.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

370

9.12.4. Молекулярная диагностика

 хромосомных болезней

Кариотипирование  плода  на  любом  сроке  беременности 

представляет собой длительный, кропотливый труд врачей-цитогене-

тиков, который нередко является основным фактором, лимитирующим 

объем и эффективность работы центров ПД.

В последние годы разработана и уже широко применяется за рубежом 

молекулярная  диагностика  наиболее  частых  анеуплоидий,  таких  как 

трисомия 21 (синдром Дауна), трисомия 13 (синдром Патау), трисомия 

18 (синдром Эдвардса), моносомия Х (синдром Шерешевского–Тернера), 

другие  нарушения  числа  гоносом.  На  долю  этих  хромосом  приходится 

почти  99 %  нарушений  кариотипа,  совместимых  с  живорождением  и 

приводящих к хромосомным болезням в постнатальном периоде. Метод 

получил  название  флуоресцентной  количественной  ПЦР  (Quantitative 

Fluorescent  PCR —  QF-PCR).  Принцип  метода  заключается  в  одновре-

менной  амплификации  полиморфных  по  длине  небольших  фрагментов 

ДНК, расположенных на каждой из вышеперечисленных хромосом. При 

этом благодаря использованию в реакции ПЦР специальных флуорохромов 

каждый  из  продуктов  амплификации  легко  дискриминируется  после 

разделения  на  электрофорезе,  а  применение  специального  сканера  для 

считывания гелей позволяет точно определить дозу амплифицированной 

ДНК каждого фрагмента отдель ной хромосомы. Наличие тройной дозы 

(трех  копий)  какого-нибудь  фрагмента  доказывает  трисомию  соответс-

твующей хромосомы, двойной дозы — нормальный диплоидный набор, 

а одинарной — моносомию. Результаты детекции количественных хромо-

сомных  аберраций  с  помощью  молекулярных  методов  приведены  на 

рисунке 9.11. Быстрота анализа (в среднем, 24–27 часов), эффективность 

98 %,  практическое  отсутствие  ложноположительных  или  ложноотри-

цательных  результатов,  огромная  пропускная  способность  (одновре-

менное сканирование 300–3000 образцов) открывают большие диагнос-

тические  перспективы  перед  этим  методом,  уже  получившим  второе 

название — тест быстрого скрининга анеуплоидии (ТБСА).

Важно подчеркнуть, что этот тест отнюдь не подменяет традици-

онного  кариотипирования,  но  позволяет  оперативно  выявить  плоды  

с  хромосомной  патологией,  в  том  числе  и  с  хромосомным  мозаи-

цизмом,  кариотип  которых  будет  в  дальнейшем  детально  проанали-

зирован.

371

Глава 9. 

Пренатальная диагностика хромосомных болезней

Таким образом, ТБСА следует рассматривать как важное подспорье 

для кариотипирования, как новый эффективный скринирующий тест, 

который может быть с успехом применен для анализа образцов амни-

отической жидкости или хориона/плаценты у женщин групп высокого 

риска, сформированных по результатам биохимического и ультразву-

кового скрининга.

Серьезным недостатком ТБСА является достаточно высокая стои-

мость приборного обеспечения и реагентов для проведения QF-PCR.

9.12.5. Генная и клеточная терапия плода

По мере выяснения контролирующих механизмов раннего эмбрио-

генеза  человека  все  более  реальной  становится  клеточная  и  генная 

терапия плода. Более того, несмотря на существующие ограничения 

в  этой  области  в  отношении  человека,  в  этом  направлении  уже 

достигнуты  вполне  реальные  успехи.  В  частности,  путем  заменного 

переливания пуповинной крови плода во II–III триместрах беремен-

ности  в  нашем  институте  уже  удается  спасти  ребенка  от  гемолити-

ческой  болезни,  развивающейся  вследствие  Rh-конфликта  между 

матерью  и  плодом  [112].  Не  менее  удивительными  представляются 

Рис. 9.11. Метод количественной ПЦР (QF-PCR)

4                             6

4                   5                 6

Ɍɪɢɫɨɦɢɹ 2:1

ATTT

4

6

Ⱦɢɫɨɦɢɹ 1:1

Ɉɬɫɭɬɫɬɜɢɟ

ɢɧɮɨɪɦɚɬɢɜɧɨɫɬɢ

Ɍɪɢɫɨɦɢɹ 1:1:1

Цитогенетика эмбрионального развития человека

372

и результаты лечения бесплодия у женщин путем инъекции в овули-

ровавшие,  но  неполноценные  яйцеклетки  микрообъемов  ооплазмы 

с  находящимися  в  них  митохондриями  из  ооцитов,  полученных  от 

здоровой женщины с нормальной репродуктивной функцией [639].

На уровне экспериментов пока остается коррекция многих насле-

д ственных  дефектов  обмена,  болезней  печени,  кроветворения  и 

системы свертывания крови путем введения через пуповинную вену 

взвеси здоровых клеток печени от медицинского абортуса [284, 430, 

853]. Реально предполагать, что создание таких искусственных химер 

может предотвратить развитие основного заболевания. Как при этом 

будет развиваться иммунологический статус плода? Каковы иммуно-

логические  взаимоотношения  между  клетками  донора  и  реципиента 

в  зависимости  от  срока  беременности,  на  котором  проводилась 

трансплантация?  Может  ли  и  каким  образом  проявиться  реакция 

HLA  несовместимости  донора  и  реципиента?  Как  долго  остаются 

жизнеспособными и сохраняются ли в постнатальном периоде транс-

плантированные  клетки?  Все  эти  вопросы  пока  активно  изучаются 

в  экспериментах  на  крупных  млекопитающих.  Некоторые  из  таких 

исследований  близки  к  клиническим  испытаниям.  Ярким  примером 

успешного  применения  методов  клеточной  терапии  в  клинической 

практике является рассмотренный нами случай лечения моногенной 

наследственной  болезни — анемии  Фанкони  с  помощью  стволовых 

клеток пуповинной крови (см. раздел 9.12.1).

В настоящее время, однако, накоплено мало информации о судьбе 

чужеродных генов в организме плода. Между тем, установлено, что 

эффективность  генной  терапии  существенно  выше  при  введении 

чужеродных генных конструкций в активно пролиферирующие ткани. 

Считается  поэтому,  что  коррекция  многих  генетических  дефектов 

должна  начинаться  еще  внутриутробно,  задолго  до  клинических 

проявлений заболевания [10].

Огромные  горизонты  перед  наукой  и  практикой  открывают 

исследования  стволовых  клеток  из  доимплантационных  зародышей 

человека  и  из  пуповинной  крови.  Во  многих  странах  уже  созданы 

банки  пуповинной  крови  для  лечения  острых  лейкозов  и  других 

заболеваний  у  детей.  Активно  обсуждается  и  уже  внедряется  в 

практику  идея  создания  индивидуальных  банков  стволовых  клеток 

(ИБСК) пуповинной крови для каждого новорожденного. Такой ИБСК 

373

Глава 9. 

Пренатальная диагностика хромосомных болезней

может иметь огромное значение при лечении различных заболеваний 

в постнатальном периоде как у самого ребенка, так и у его близких 

родственников. Такие банки с емкостью в несколько тысяч образцов 

уже  созданы  в  различных  странах  Западной  Европы  и  Америки. 

Создание таких банков на коммерческой основе уже предпринимается 

и в России.

Таким  образом,  дальнейшее  совершенствование  генетической 

карты  репродуктивного  здоровья  (ГКРЗ),  поиск  и  анализ  мутаций  

в регуляторных генах, клеточная и генная терапия плода представляют 

собой передний край ПД.

Заключение

Положения  современной  ПД  можно  суммировать  в  следующих 

основных выводах.

При  планировании  семьи  супружеской  паре  показано  проспек-

тивное  медико-генетическое  консультирование  с  целью  первичной 

оценки  риска  ВПР  и  наследственных  болезней,  для  предоставления 

информации  о  преконцепционной  профилактике.  По  желанию 

супругов возможно генетическое тестирование с целью формирования 

генетической карты репродуктивного здоровья (ГКРЗ).

Важны: ранняя постановка беременной на учет в женской консуль-

тации, УЗ-обследование на 10–11-й неделях для регистрации точного 

срока  беременности,  направление  женщины  на  инвазивную  ПД  

в  I тримеcтре  при  наличии  абсолютных  показаний:  возраст  39  лет 

и  старше,  наличие  хромосомных  перестроек  у  одного  из  супругов, 

МВПР или хромосомные болезни у предыдущего ребенка, по резуль-

татам  ультразвукового  скрининга,  проведение  комбинированного 

ультразвукового  (ТВП  +  НК)  и  биохимического  (β-ХГЧ   +  РАРР-А) 

скринингов,  дополненных  при  необходимости  кариотипированием 

плода после инвазивной ПД, высокий риск моногенных болезней.

Во II тримеcтре ПД включает скринирование маркерных сыворо-

точных  белков  (АФП  и  ХГЧ)  на  15–18-й  неделях  беременности, 

оценку  риска  болезни  Дауна  (табличные  данные  или  компьютерная 

программа), направление женщин с риском более 0,5 % на инвазивную 

ПД с целью получения биоптатов плаценты или амниоцитов (до 20-й 

недели  беременности),  лимфоцитов  пуповинной  крови  плода  (после 

20-й  недели  беременности)  для  пренатального  кариотипирования,