Цитогенетика эмбрионального развития - часть 47

Цитогенетика эмбрионального развития человека

358

После  установления  факта  хромосомного  дисбаланса  у  плода 

беременной  рекомендуется  детальное  ультразвуковое  исследование 

высокого  уровня.  Повторное  УЗИ  плода  с  установленным  цитогене-

тическим диагнозом позволяет выявить аномалии развития у плода, не 

отмеченные при первичном осмотре.

После прерывания беременности в I тримеcтре проводится цитогене-

тический анализ хромосомных препаратов из тканей и органов абортусов 

с  использованием  традиционных  цитогенетических  методов,  а  также 

методов  гибридизации  in situ  (методы  FISH)  и  молекулярных  методов. 

Весьма  желателен  уже  на  этом  этапе  патоморфологический  анализ 

материала абортуса.

После  искусственного  прерывания  беременности  во  II тримеcтре 

возможности  цитогенетической  диагностики  ограниченны  вследствие 

аутолиза большинства тканей плода. Лаборатории, где хорошо налажены 

методы  культивирования  тканей,  могут  применить  эти  методы  для 

верификации  кариотипа  плода,  однако  успешность  попыток  культи-

вирования  мацерированных  тканей  невелика.  Обязательным  является 

детальный  патоморфологический  анализ  в  соответствии  с  протоколом 

исследования случаев антенатальной гибели плода.

9.10. Эффективность пренатальной диагностики

Считается,  что  ПД  относится  к  числу  высокорентабельных  направ-

лений профилактической медицины, где отдача на каждый затраченный 

рубль составляет не менее 9–10 рублей. Достаточно заметить, что содер-

жание только одного ребенка с болезнью Дауна обходится государству не 

менее 150 000 рублей в год, и это при средней продолжительности жизни 

такого больного около 26 лет!

Естественно, что в целом эффективность ПД определяется частотой, 

с  которой  удается  выявить  плоды  с  тяжелыми  ВПР,  хромосомными  и 

моногенными  болезнями.  Наиболее  эффективна  в  отношении  ВПР  у 

плода  УЗ-диагностика,  которая  в  условиях  ультразвукового  скрининга 

позволяет  выявлять  50–80 %  всех  ВПР,  в  том  числе  практически  все 

ВПР,  при  которых  можно  рекомендовать  прерывание  беременности. 

Ультразвуковой  скрининг  особенно  эффективен  в  диагностике  ВПР 

центральной  нервной  системы,  где  по  данным  диагностического 

(медико-генетического)  центра  Санкт-Петербурга  [197]  его  эффек-

тивность  составляет  более  90 %,  а  также  множественных  ВПР  (66 %). 

359

Глава 9. 

Пренатальная диагностика хромосомных болезней

Наибольшие  трудности  представляет  диагностика  изолированных 

пороков серд ца (10 %), а также дефектов лицевого черепа и дистальных 

отделов конечностей (15 %). Важно подчеркнуть, что многие, особенно 

изолированные, пороки доступны оперативной коррекции. Поэтому до 

прерывания беременности плодом с ВПР женщине следует настоятельно 

рекомендовать консультацию врачей хирургов-неонатологов. Однако до 

принятия решения о постнатальной коррекции любых ВПР необходимо 

провести ПД с целью исключения хромосомных болезней.

ПД хромосомных или моногенных болезней, которые в подавля ющем 

большинстве пока недоступны лечению, как правило, завершается преры-

ванием беременности.

Эффективность  цитогенетической  ПД  в  значительной  мере  зависит 

от  показаний  к  пренатальному  кариотипированию,  а  также  от  срока 

беременности.

Результаты цитогенетических исследований (табл. 9.6) показывают, 

что хромосомный дисбаланс был выявлен в общей сложности у 352 

плодов  из  8000  (4,4 %).  Наибольшая  выявляемость  плодов  с  хромо-

сомными аномалиями, то есть эффективность ПД, отмечалась у женщин 

с УЗ-маркерами у плода (17,6 %), в группе носителей хромосомных 

перестроек (9,1 %), у женщин возрастной группы (4,0 %). У женщин, 

ранее родивших детей с хромосомными болезнями или МВПР, частота 

хромосомной патологии у плода оказалась существенно ниже (2,6 и 

2,2 % соответственно). В группе риска, сформированной по результатам 

биохимического скрининга выявлено 1,7 % плодов с хромосомными 

болезнями, в основном, с трисомией 21. В целом, полученные нами 

данные о частоте геномных мутаций у плода в стандартных группах 

риска  полностью  соответствуют  результатам  европейских  центров 

пренатальной диагностики. Однако суммарная частота хромосомного 

дисбаланса в различных центрах может варьировать в более широких 

пределах — от 1,5 до 7,3 % (см. табл. 5.4). Основной причиной таких 

колебаний  является  соотношение  групп  риска,  сформированных  по 

результатам  программ  пренатального  скрининга.  Так,  у  родителей-

носителей  хромосомных  аномалий  (группа  № 4,  табл. 9.6)  практи-

чески каждый 10-й плод оказывается носителем несбалансированного 

карио типа, как правило, обусловленного родительской хромосомной 

перестройкой.  Частота  хромосомных  болезней  у  плода  в  других 

группах  цитогенетического  скрининга  (группы  № 1–4,  табл. 9.6) 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

360

составляет  в  среднем  3,9 %,  что  в  6  раз  превышает  популяционную 

(0,6 %, группа № 7, табл. 9.6). Следует подчеркнуть, что в «возрастной» 

группе  частота  хромосомных  болезней  у  плода  зависит  от  соотно-

шения беременных разного возраста — чем многочисленнее окажется 

группа 35–38-летних, тем ниже будет доля плодов с возраст-зависимой 

анеуплоидией  (см. рис. 6.1,  а  также  раздел 9.4.3).  При  увеличении 

группы риска по биохимическому скринингу, где ожидаемая частота 

трисомии 21 у плода составляет ~ 2 % (см. раздел 9.4.2), общая частота 

выявляемой  патологии  будет  снижаться,  тогда  как  преобладание 

группы  с  УЗМ  хромосомных  болезней  у  плода  приведет  к  возрас-

танию эффективности выявления геномных мутаций. Мы не рассмат-

риваем здесь эффективность выявления хромосомной патологии при 

сочетании  показаний  к  пренатальному  кариотипированию.  Отметим 

только, что в группе сочетанных показаний (возраст ≥ 35 лет, биохи-

мические и ультразвуковые маркеры хромосомных болезней) частота 

геномных мутаций может достигать 10 % [72].

Как уже отмечалось, общая эффективность ПД варьирует и в зависи-

мости от срока беременности, что объясняется гибелью плодов с хромо-

сомным дисбалансом преимущественно в первой половине беременности. 

Наиболее наглядно это прослеживается в группе возраст ных беременных. 

Однако частота выявления трисомии 21 практически не зависит от срока 

беременности  (табл. 9.4).  Эти  данные  еще  раз  подтверждают  целесо-

образность  пренатального  кариотипирования  по  возрасту,  особенно  у 

беременных 39 лет и старше.

Неожиданно  высокой  (9,5 %,  табл. 5.3  на  с.  165)  оказалась  частота 

геномных мутаций, выявленных у плодов при проведении ПД после 26-

й  недели  беременности.  Учитывая  неоднозначное  отношение  к  преры-

ванию беременности в поздние сроки, проблеме кариотипирования плода 

в III тримеcтре необходимо уделить особое внимание.

9.11. Пренатальная диагностика

 в III триместре беременности

Ее главными недостатками и ограничениями являются медицинские 

и  морально-этические  проблемы,  возникающие  перед  врачом  и  самой 

беременной  женщиной.  Эти  проблемы  связаны  с  решением  судьбы 

жизнеспособного плода с наследственной или врожденной патологией. 

Что  же  касается  методической  части,  то  любые  инвазивные  вмеша-

361

Глава 9. 

Пренатальная диагностика хромосомных болезней

тельства, технически выполнимые во II тримеcтре, вполне применимы и 

в III тримеcтре беременности. При этом, однако, результативность карио-

типирования с использованием прямых препаратов из плаценты и культур 

клеток  амниотической  жидкости  крайне  низка,  а  проведение  кордо-

центеза в поздние сроки значительно чаще, чем во II триместре, может 

спровоцировать преждевременные роды, отслойку плаценты или другие 

осло жнения,  требующие  экстренного  вмешательства  акушеров-гинеко-

логов.  Поэтому  согласно  нашему  опыту  кордоцентез  в  III тримеcтре 

беременности необходимо проводить только в условиях стационара.

Другое  существенное  ограничение  заключается  в  том,  что 

един ственной  весомой  причиной  для  проведения  инвазивного 

вмешательства  с  целью  ПД  в  III тримеcтре  является  необходимость 

выработки  дальнейшей  тактики  ведения  беременности  и,  главное, 

способа  родоразрешения  с  учетом  состояния  матери  и  диагноза  у 

плода. В этой связи уместно обратить внимание на некоторые клини-

ческие  аспекты  пренатальной  диагностики.  Так,  одним  из  немногих 

противопоказаний  к  инвазивному  внутриматочному  вмешательству 

с целью получения плодного материала является угроза прерывания 

беременности,  симптомы  которой  могут  быть  проявлением  хромо-

сомного дисбаланса у плода [45]. Специальные исследования, прове-

денные  у  пациенток  с  клиническими  признаками  угрожающего  или 

начавшегося  аборта,  показали,  что  частота  хромосомных  аберраций 

у  плодов  при  угрозе  прерывания  беременности  существенно  выше, 

чем в контрольной группе, пренатальная диагностика которым была 

произведена по общепринятым правилам (6,5 и 1,8 % соответственно) 

[154]. Между тем, как правило, при наличии угрожающего прерывания 

беременности  назначается  сохраняющая  терапия,  при  этом  опера-

тивные вмешательства по получению плодного материала переносятся 

на более поздние сроки, что способствует проведению ПД не только 

хромосомных, но и моногенных болезней в III триместре.

Следует  отметить,  что  ни  сроки  беременности,  ни  характер 

инвазивных манипуляций во II и III тримеcтрах не регламентированы 

нормативными документами по пренатальной диагностике. При этом, 

согласно приказу МЗ РФ № 302 от 28.12.93, искусственное прерывание 

беременности при наличии врожденных пороков развития и наслед-

ственных заболеваний возможно на любом сроке. Однако проведение 

ПД  и  прерывание  беременности  по  ее  результатам  в  III тримеcтре 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

362

нельзя оправдать наличием такого приказа. Их следует рассматривать 

как безусловный дефект в организации и состоянии всей службы ПД 

врожденных и наследственных болезней.

Решение  вопроса  о  тактике  ведения  беременности  при  наличии 

нарушений развития плода определяется пренатальным консилиумом, 

включающим врача-генетика, врача УЗД, врача акушера-гинеколога, 

врача-неонатолога  и  других  профильных  специалистов.  Согласно 

существующему  федеральному  законодательству  независимо  от 

рекомендаций  специалистов  окончательное  решение  о  судьбе 

беременно сти принимает сама пациентка.

9.12. современные направления

 в пренатальной диагностике

Таковыми являются:

доимплантационная диагностика;

• 

диагностика по клеткам плода в крови матери.

• 

9.12.1. доимплантационная диагностика

Доимплантационная  диагностика  (ДД)  появилась  в  90-е  годы 

прошлого  века  благодаря  быстрому  развитию  методов  вспомога-

тельной репродукции и микрометодов, приемлемых для анализа генома 

единичных  клеток,  таких  как  методы  молекулярной  цитогенетики 

(различные варианты FISH) и молекулярной генетики (варианты ПЦР). 

В настоящее время список наследственных болезней, доступных для 

диагностики  на  доимплантационных  стадиях,  включает  не  только 

многие моногенные (муковисцидоз, фенилкетонурию), но и различные 

хромосомные болезни. Спектр заболеваний в настоящее время насчи-

тывает более 30 нозологий и включает все наиболее частые моногенные 

и хромосомные болезни [498]. К 2001 году в мире проведено около 

2500  доимплантационных  диагностик.  После  селекции  больных  и 

трансплантации в матку здоровых эмбрионов в 500 случаях родились 

здоровые  дети.  В  России  доимплантационная  диагностика  делает 

только первые шаги и проводится лишь в нескольких центрах вспомо-

гательных  репродуктивных  технологий  Москвы,  Санкт-Петербурга, 

Красноярска. Причем и в этих центрах она пока ограничена диагнос-

тикой пола плода (планирование семьи и Х-сцепленные заболевания), 

а также исключением наиболее частых хромосомных болезней.

363

Глава 9. 

Пренатальная диагностика хромосомных болезней

Следует  напомнить,  что  материалом  для  доимплантационной 

диагностики  являются  полярные  тельца  или  отдельные  бластомеры 

дробящейся  яйцеклетки,  полученные  микрургическим  путем  от 

доимплантационных  зародышей —  продуктов  экстракорпорального 

оплодотворения (см. главу 4). В зависимости от материала доимплан-

тационную  диагностику  можно  подразделить  на  преконцепционную 

(анализ  полярных  телец)  и  собственно  доимплантационную  (анализ 

бластомеров или клеток трофобласта).

Диагностика с использованием полярных телец позволяет выбирать 

для оплодотворения ооциты, не несущие генные и геномные мутации. 

Основная  проблема —  большая  вероятность  неточного  прогноза  

о генотипе ооцита при тестировании только первого полярного тельца. 

Определить наличие мутации можно только после завершения второго 

деления  мейоза,  то  есть  по  второму  полярному  тельцу,  которое 

образуется уже после оплодотворения яйцеклетки.

Вторая проблема обусловлена особенностями применения молеку-

лярно-генетических методов для диагностики единичной клетки. На 

результаты  ПЦР  могут  повлиять  различные  факторы,  в  частности, 

контаминация образца или условия проведения реакции.

Проблема  цитогенетического  анализа  полярных  телец  заклю-

чается в невозможности применения традиционных методов анализа 

метафазных хромосом. Поэтому для этих целей обычно используют 

метод гибридизации in situ с меченными флуорофорами ДНК-зондами, 

специфичными  к  участкам  отдельных  хромосом.  В  последние  годы 

разработаны  и  апробированы  методы  приготовления  хромосом  из 

полярных  телец  человека,  пригодных  для  стандартного  цитогенети-

ческого анализа. Предложенные модификации уже позволили провести 

анализ хромосомного набора в полярных тельцах с эффе ктивностью 

94,1 % [725, 871].

Таким образом, возможности для преконцепционной диагностики 

наследственных болезней уже реально существуют, однако, насколько 

нам известно, в России они пока не применяются. Сложности работы 

с  единичными  клетками  и  большая  вероятность  диагностических 

ошибок не оправдывают значительных финансовых затрат на прове-

дение преконцепционной диагностики.

Диагностика  на  изолированных  бластомерах  позволяет  получить 

точную  информацию  о  генотипе  эмбриона.  В  основном,  биопсия 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

364

бластомеров  осуществляется  на  стадии  8–10  клеток.  Поскольку 

на  ранних  стадиях  дробления  все  бластомеры  тотипотентны  (т.  е. 

взаимозаменя емы), удаление 1–2 клеток не сказывается на дальнейшем 

развитии  эмб риона.  Методически  анализ  единичных  бластомеров 

от дробящихся зародышей принципиально не отличается от анализа 

полярных телец.

Выбор  метода  молекулярной  диагностики  определяется  специ-

фикой исследуемой мутации и включает как метод ПЦР, так и более 

сложные  ДНК-методы.  Они  позволяют  проводить  диагностику 

наиболее  распространенных  моногенных  болезней —  аутосомно-

рецессивных  (муковисцидоз,  β-талассемия,  спинальная  амиотрофия 

Верднига–Гоффмана,  болезнь  Тея–Сакса),  аутосомно-доминантных 

(миотоническая  дистрофия,  синдром  Марфана,  хорея  Гентингтона), 

Х-сцепленных  (миодистрофия  Дюшенна  и  синдром  ломкой  X-

хромосомы), а также некоторых более редких болезней.

Цитогенетическая доимплантационная диагностика проводится на 

1–2 бластомерах методом FISH с использованием ДНК-зондов, специ-

фичных  к  прицентромерным  или  теломерным  районам  хромосом 

16, 18, 21, 13, X, Y. При гетерозиготном носительстве транслокации 

одним  из  родителей  для  диагностики  методом  FISH  используются 

цельнохромосомные и локус-специфичные ДНК-зонды.

Проблема  диагностики  численных  аномалий  кариотипа  ослож-

няется высокой частотой хромосомного мозаицизма на ранних стадиях 

эмб риогенеза  человека.  Доимплантационная  диагностика  на  этой 

стадии может быть рекомендована только в группах высокого риска 

рождения ребенка с наследственной патологией.

Более  надежная  доимплантационная  диагностика  может  быть 

проведена на стадии бластоцисты. На этой стадии зародыш состоит 

примерно из 60–100 клеток. При визуализации трофобласта и эмбрио-

бласта без ущерба для развития эмбриона можно удалить до 10 клеток 

трофобласта.  Следует,  однако,  учитывать,  что  культивирование 

эмб рионов in vitro в программах ЭКО крайне редко доводят до стадии 

бластоцисты, т. к. способность к имплантации таких эмбрионов может 

оказаться существенно сниженной.

Удивительные  возможности  доимплантационной  диагностики  

в  сочетании  с  другими  методами  вспомогательных  репродуктивных 

технологий  наглядно  продемонстрированы  в  исследованиях,  прове-

365

Глава 9. 

Пренатальная диагностика хромосомных болезней

денных в Институте генетики репродукции человека в Чикаго (США) 

[724]. Цель работы заключалась в попытке лечения 5-летней девочки, 

страдающей анемией Фанкони, обычно приводящей к смерти вслед-

ствие аплазии костного мозга.

Для этого от матери больного ребенка путем искусственной гормо-

нальной стимуляции с последующим оплодотворением in vitro сперма-

тозоидами  мужа  были  получены  более  30  зародышей.  С  помощью 

молекулярных методов вначале была проведена селекция зародышей, 

лишенных  мутации  гена  анемии  Фанкони.  На  втором  этапе  путем 

тестирования генов локуса HLA были отобраны здоровые зародыши, 

гистосовместимые  с  клетками  больной  девочки.  После  трансплан-

тации в матку матери удалось выносить и родить здорового мальчика, 

пуповинная кровь которого, полученная при рождении, была исполь-

зована в качестве донорской для больной девочки. Благодаря содержа-

щимся в пуповинной крови стволовым кроветворным клеткам девочка 

была спасена. В настоящее время брат и сестра соматически вполне 

здоровы. Естественно, что такое исцеление стало возможным благодаря 

серьезным успехам не только в доимплантационной диагностике, но 

и  в  других  современных  технологиях,  включая  клеточную  терапию  

с использованием стволовых клеток.

Таким  образом,  основное  (и  зачастую,  единственное)  преиму-

щество  диагностики  до  имплантации  заключается  в  возможности 

трансплантации генетически полноценных эмбрионов. Недостатками 

этого  подхода  являются  методические  трудности,  связанные  

с  необходимостью  работы  с  микроколичествами  материала,  ограни-

чения  диагностики  рамками  программ  ЭКО  и  большая  вероятность 

ошибочной диагностики.

Доимплантационная диагностика в России пока не имеет широкого 

распространения.  Она  проводится  только  в  нескольких  ведущих 

центрах  ЭКО,  весьма  дорогостоящая,  требует  специально  подготов-

ленных специалистов, оборудования и реактивов, чревата повышенной 

частотой  ошибок.  После  диагностики  до  имплантации  и  наступ-

ления  беременности  нередко  возникает  необходимость  проведения 

стандартной ПД на постимплантационных стадиях.

Более детально с методами, возможностями и ограничениями ПД  

в доимплантационный период можно ознакомиться в соответствующих 

руководствах и монографиях [384, 871, 873].