Цитогенетика эмбрионального развития - часть 49

Цитогенетика эмбрионального развития человека

374

ультразвуковой  скрининг  на  18–22-й  неделях  беременности  для 

выявления врожденных пороков развития.

В России диагностируется более 40 различных моногенных болезней 

(табл. 9.8),  10  наиболее  распространенных  из  них  диагностируются 

пренатально в НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН.

Инвазивная ПД в III тримеcтре беременности проводится в условиях 

стационара  для  выработки  тактики  ведения  беременности  и  родов; 

решение об инвазивной ПД на поздних сроках беременности принимается 

консилиумом (акушер-гинеколог, педиатр, генетик, специалист УЗД).

Наиболее перспективными направлениями в развитии ПД являются 

комбинированный скрининг МСБ (β-ХГЧ  +  РАРР-А) и ультразвуковой 

скрининг (ТВП  +  НК) в I тримеcтре беременности, перспективным для 

ПД в России представляется создание однодневных центров оценки 

риска  болезни  Дауна  у  плода,  внедрение  эффективного  и  высокоп-

роизводительного  метода  молекулярной  диагностики  хромосомных 

болезней (QF-PCR).

ГлАвА 10  

осоБеННосТи

 сТрУКТУрНо-ФУНКЦиоНАлЬНоЙ  

орГАНиЗАЦии ХроМосоМ 

в ЭМБриоГеНеЗе ЧеловеКА

введение 

Комплексный  анализ  особенностей  эмбриогенеза  в  условиях 

хромосомных  аберраций — один  из  важных  подходов  к  изучению 

роли  индивидуальных  хромосом  в  развитии  человека.  Естественно, 

что прижизненное исследование зародышей с помощью УЗ-аппаратов, 

дополненное  детальным  патоморфологическим  анализом  аутоп-

сийного  материала,  безусловно,  расширяет  наши  представления  

о роли дисбаланса различных хромосом в патологии эмбриогенеза по 

сравнению  с  более  ранними  наблюдениями,  выполненными  только 

на  материале  спонтанных  абортов.  Вместе  с  тем,  учитывая  особен-

ности структурно-функциональной организации каждой хромосомы, 

сложность и уникальность ее генного состава, включающего не только 

структурные  гены,  но  и  регуляторные  последовательности,  в  том 

числе и факторы транскрипции, контролирующие функции не только 

генов  своей  хромосомы,  но  и  генных  ансамблей  других  хромосом, 

остается  актуальным  использование  других,  более  тонких  подходов 

к анализу функции целых хромосом и их отдельных сегментов. Для 

этих  целей  применяются  специальные  методы,  позволяющие  визуа-

лизировать  непо средственно  на  цитологических  препаратах  активно 

работающие гены, точнее кластеры генов, сосредоточенные в опреде-

ленных  участках  хромосом.  К  ним  относятся  метод  избирательной 

окраски  работающих  рибосомных  генов,  методы  рестрикции  in situ, 

методы ник-трансляции in situ и другие молекулярные методы, ранее 

применявшиеся  только  в  экспериментах  с  изолированной  ДНК. 

Доступность материала позволяет уже сегодня проводить исследования 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

376

на любой стадии эмбриогенеза человека с целью изучения особенностей 

репликации хромосом, паттернов их метилирования, состояния гетеро-

хроматина, функции ядрышкообразующих районов и др. В данной главе 

суммированы некоторые результаты исследований особенностей струк-

турно-функциональной  организации  хромосом  у  эмбрионов  и  плодов 

человека.

10.1. особенности структурной

 организации ядрышкообразующих

 районов хромосом человека

Почти половина общей транскрипционной активности клетки прихо-

дится на долю генов, кодирующих рРНК. У человека кластеры рибосом-

ных генов располагаются в спутничных нитях пяти пар акроцентрических 

хромосом (13, 14, 15, 21 и 22) в областях ЯОР. Гены рРНК в них построе-

ны в виде длинных повторов по типу «голова к хвосту». Каждая единица 

транскрипции рРНК в таком повторе кодирует 18S, 5,8S и 28S рРНК, пе-

речисленные в порядке их расположения, начиная с 5’-конца. Участки, ко-

дирующие единицы рРНК, высококонсервативны, тогда как по промежу-

точным (спейсерным) участкам наблюдается значительная межвидовая и 

внутривидовая изменчивость в разных группах эукариот [866].

Транскрипция рДНК является сложным многоэтапным процессом, 

происходящим в интерфазном ядрышке начиная с поздней телофазы и 

вплоть до следующего митоза. Одна молекула РНК-полимеразы I счи-

тывает сразу три гена, соответствующих трем типам кодируемых РНК, 

а также оба внутренних спейсера, синтезируя 45S про-рРНК. Во время 

транскрипции  45S  про-рРНК  остается  связанной  с  соответствующи-

ми рибосомными белками, предотвращающими ее деградацию. В ходе 

последующего процессинга она расщепляется на 18S, 5,8S и 28S субъ-

единицы рРНК, которые транспортируются в цитоплазму, а спейсеры 

разрушаются ядерными нуклеазами [174].

В  процесс  транскрипции  р-генов  вовлечены  не  только  основные 

ферменты транскрипционного комплекса, но и комплекс кислых бел-

ков, обладающих повышенным сродством к ионам серебра и получи-

вших название Ag-ЯОР белков [169]. Предполагается, что основными 

факторами, влияющими на качественный и количественный состав ар-

гентофильных  ядрышковых  белков,  являются  пролиферативный  ста-

тус клетки и стадия клеточного цикла [222].

377

Глава 10.

 структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

Основные  аргентофильные  компоненты  интерфазного  ядрышка 

представлены белком С23, или нуклеолином (105кДа), а также белком 

В23, или нумотрином (39кДа) [769]. При переходе из фазы S в фазу 

G2 общее количество этих белков значительно возрастает [222]. Эти 

свойства Ag-ЯОР  белков  используются  в  клинической  практике  для 

оценки пролиферативного статуса клеток и определения процентного 

соотношения клеток на разных стадиях клеточного цикла в малигни-

зированных тканях [104].

Во время митоза, когда транскрипция рибосомных генов приоста-

навливается,  связанными  с  ЯОР  остаются  менее  5

 

%  белков,  таких 

как  РНК-полимераза  I,  фактор  UBF  и  многокомпонентный  фактор 

SL I [846].

Разработанный в середине 1970-х годов метод селективной окрас-

ки  нитратом  серебра  кислых  белков  в  районах  ядрышковых  органи-

заторов [480] доказывает наличие выраженного функционального по-

лиморфизма хромосом человека по рибосомным генам. В сочетании 

с  методом  гибридизации  in situ  с  мечеными  ДНК-зондами,  позволя-

ющими оценить размеры кластеров р-генов, этот метод дает реальные 

возможности  для  изучения  транскрипционной  активности  р-генов  

непосредственно на препаратах метафазных хромосом [463].

10.1.1. Полиморфизм ядрышкообразующих

 районов (Яор) хромосом

Для характеристики функционального состояния ЯОР метафаз-

ных хромосом предложена полуколичественная система визуальной 

оценки размеров гранул серебра, отражающих степень активно-

сти  кластера  р-генов  в  условных  единицах —  4-балльная  [107] 

(рис. 10.1)  и 5-балльная [117]. Аналогичная система применяется 

и для визуальной оценки числа копий р-генов по размерам гибри-

дизационного сигнала в районах ядрышковых организаторов после 

проведения  гибридизации  in  situ  (FISH)  с  использованием  рДНК-

зонда [3] (рис. 10.2).

К настоящему времени твердо установлена выраженная вариабель-

ность  (полиморфизм)  числа  аргентофильных  ЯОР  на  клетку,  разли-

чная интенсивность их окраски в разных ЯО-хромосомах и в разных 

клетках одного организма, а также межиндивидуальный полиморфизм 

по всем этим признакам.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

378

Рис.10.1. Четырехбалльная система оценки размеров гранул серебра на индивидуаль-

ных ЯОР. Цифрами отмечены соответствующие баллы

Рис.10.2. Четырехбалльная система оценки интенсивности гибридизационного сиг-

нала на индивидуальных ЯОР. Цифрами отмечены соответствующие баллы

Общее  число  копий  рибосомных  генов  в  геноме  человека  соста-

вляет около 400, соответственно в каждом из десяти ЯОР хромосом 

содержится  около  40  тандемно  повторяющихся  кластеров  р-генов. 

Эти  кластеры  распределены  по  ЯО-хромосомам  весьма  неравноме-

рно. Более того, уровень экспрессии отдельных ЯОР может не соответ-

ствовать количеству содержащихся в них копий р-генов [107, 505]. Эти 

различия в структурной организации и функциональной активности и 

определяют межхромосомный полиморфизм ЯОР.

Рисунок окрашивания каждого ЯОР генетически детерминирован и 

наследуется как простой менделевский признак, однако отмечаются и ис-

ключения. Так, в разных клетках характер серебрения одного-двух ЯОР, 

при относительной стабильности окраски остальных ядрышковых орга-

низаторов, обычно неодинаков. Это приводит к появлению внутриинди-

видуального  межклеточного  полиморфизма  [180].  Согласно  исследова-

ниям в постнатальном периоде онтогенеза человека рисунок ЯОР может 

меняться в зависимости от типа клеток [375, 696], вида ткани [505, 629],  

а также возраста [39, 571]. Транскрипционная активность отдельных ЯОР 

варьирует также у детей и их родителей [505, 830].

379

Глава 10.

 структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

Наконец, наблюдаются межиндивидуальные различия как по чис-

лу хромосом с функционально активными ЯОР в кариотипе, так и по 

их суммарной активности. Основной причиной межиндивидуального 

полиморфизма является случайная комбинаторика 5 пар акроцентриче-

ских хромосом, несущих разное количество копий генов рРНК [101]. 

Пределы варьирования суммарной активности ЯОР достаточно широ-

ки,  однако  не  выходят  за  рамки  определенных  пороговых  значений, 

за пределами которых дисбаланс генов, локализованных в ЯОР, может 

быть причиной различных фенотипических нарушений [107].

10.1.2. Механизмы регуляции

 функциональной активности рибосомных генов

Функциональный полиморфизм ЯОР может быть обусловлен как 

числом транскрибируемых копий р-генов, так и колебаниями их транс-

крипционной активности.

К изменению числа копий р-генов в кластере (делеции части копий 

либо  их  тандемной  дупликации)  приводит  неравный  кроссинговер, 

который может происходить как между гомологичными ядрышкооб-

разующими хромосомами, так и вследствие негомологичной рекомби-

нации в мейозе [636].

Вместе с тем, при наследовании число копий генов рРНК в каждой 

ЯО-хромосоме,  как  правило,  остается  неизменным.  Сохранение  

в  большинстве  случаев  определенного  уровня  активности  индиви-

дуальных  ЯОР,  возможно,  обеспечивается  равным  распределением 

между дочерними хромосомами рДНК-транскрипционного комплекса, 

который  и  определяет  тип  экспрессии  соответствующих  кластеров 

ЯО-генов [846].

Нередко  транскрипционная  активность  некоторых  ЯОР  при 

передаче  потомству  меняется.  Эта  изменчивость  позволяет  предпо-

ложить возможность наследования не жестко закрепленного признака, 

а  некоторого  диапазона  потенциальной  изменчивости  в  функциони-

ровании ЯОР индивидуальных акроцентрических хромосом [180]. Не 

исключено, что реализация этих потенций осуществляется с помощью 

присутствующих в геноме так называемых «молчащих» рибосомных 

генов [103]. Возможно, эти резервные гены рРНК могут в определенных 

условиях  реактивироваться,  однако  природа  «молчащих»  р-генов  и 

факторов, влияющих на их работу, остаются до сих пор невыясненными. 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

380

В  какой-то  мере  вариабельность  функционирования  стру ктурно 

идентичных  кластеров  рибосомных  генов  объясняет  двухступен-

чатая модель активации ЯОР [908]. Она предполагает вероятностное 

связывание транскрипционных факторов с разными ЯОР в клетке. На 

первом  этапе  определенное  количество  транскрипционных  факторов 

случайным образом связывается с р-генными кластерами, так что любой 

ЯОР  равновероятно  может  присоединить  требуемые  факторы  транс-

крипции.  В  том  случае,  если  в  клетке  присутствуют  гетероморфные 

ЯОР, наибольший по размерам ЯОР наиболее вероятно будет связывать 

большее количество факторов и, следовательно, иметь большую транс-

крипционную активность. На втором этапе происходит кооперативное 

связывание  оставшихся  факторов  транскрипции,  имеющих  большее 

сродство  к  промоторам  тех  копий  р-генов,  которые  на  первом  этапе 

уже связали ферменты транскрипционного комплекса. В основе этого 

процесса  могут  лежать  такие  механизмы  как  локальная  перестройка 

хроматина в ЯОР или «усиливающее» действие определенных транс-

крипционных агентов, локализованных в спейсерных участках рДНК. 

Кооперативное  связывание  приводит  к  активации  тех  ЯОР,  которые 

присоединили  факторы  транскрипции  на  первом  этапе.  Оставшиеся 

ЯОР будут активироваться только в том случае, если первично активи-

рованных копий р-генов недостаточно для нормальной жизнедеятель-

ности клетки. Таким образом, двухступенчатая модель активации ЯОР 

предполагает существование определенной «иерархии» активации ЯОР, 

при  которой  больший  по  размеру  р-генный  кластер  будет  проявлять 

соответственно большую транскрипционную активность.

Принимая во внимание, что копийность кластеров р-генов и уровень 

их активности не всегда коррелируют друг с другом, следует допустить 

существование механизмов регуляции уровня экспрессии. Предполагается, 

что основную роль могут играть метилирование рДНК, ацетилирование 

гистонов, изменение структуры хроматина, а также инактивация р-генов, 

обусловленная эффектом положения [450].

Одним  из  основных  доказательств  ключевой  роли  метилирования  

в регуляции активности рибосомных генов являются опыты с использо-

ванием аналога цитозина — 5-азацитидина, который вызывает демети-

лирование ДНК. При введении этого агента в культуру клеток в период 

репликации  ДНК  происходит  деспирализация  и  реактивация  ранее 

«молчащих» р-генов [22, 505, 591].

381

Глава 10.

 структурно-функциональная организация хромосом в эмбриогенезе

Для  инактивации  рибосомных  генов  необходимо  метилирование 

определенных положений в гене рРНК. Так, в экспериментах на мышах 

было  установлено,  что  для  репрессии  р-генов  достаточно  метили-

рования  единственного  СpG  динуклеотида  в  регуляторной  области, 

которое  затрудняет  связывание  активатора  транскрипции  рДНК 

фактора UBF и тем самым предотвращает и формирование транскрип-

ционного комплекса. Этот эффект усиливается, если метилированным 

оказывается энхансер, расположенный перед промоторной областью 

р-гена  [775].  Для  инактивации  транскрипции  гена  рРНК  человека 

необходимо метилирование положений –96, –102 и –347 в ДНК промо-

торной области [768].

На следующем этапе инактивации рДНК с ней связывается NoRC 

(Nucleolar Remodelling Complex) — особый белковый комплекс ремо-

делирования хроматина [750]. Он вызывает гетерохроматинизацию за 

счет метилирования рДНК и деацетилирования гистонов. Ассоциация 

с кластерами рДНК транскрипционного комплекса на всем протяже-

нии клеточного цикла, его сохранность в митозе, когда экспрессия по-

давлена, свидетельствуют о том, что репрессия транскрипции р-генов 

обратима [439]. При этом метилирование является своеобразным ме-

ханизмом клеточной памяти. После репликации на вновь синтезиро-

ванных нитях ДНК метилированные цитозины ранее инактивирован-

ных рибосомных генов являются маркерами для белков-репрессоров 

[813],  изменяющих  нуклеосомную  структуру  хроматина  в  кластере 

р-генов [321, 584].

Предполагается  также,  что  дополнительным  фактором,  влияющим 

на функциональную активность ЯОР, является присутствие блоков кон-

ститутивного гетерохроматина (С-блоков) в участках, смежных с р-ген-

ными кластерами [450]. Ярко выраженный эффект положения отмечен 

у шимпанзе, у которых ЯОР часто фланкированы блоками конститутив-

ного гетерохроматина, и именно поэтому рДНК оказывается подвержен-

ной репрессии в участках, прилежащих к С-блокам. Для человека подоб-

ный эффект положения ЯОР характерен в меньшей степени, возможно, 

потому, что С-блоки в прицентромерном районе обычно присутствуют 

только с одной стороны от кластера р-генов, которые оказываются «за-

жатыми» между участками конститутивного гетерохроматина.

Таким образом, функциональная активность ЯОР и число содержа-

щихся в них копий генов рРНК взаимосвязаны, при этом активность