Цитогенетика эмбрионального развития - часть 42

Цитогенетика эмбрионального развития человека

332

эффективные методы хромосомного анализа клеток плода и зароды-

шевых оболочек. В зависимости от срока беременности и задач иссле-

дования материалом для хромосомного анализа могут служить клетки 

амниотической жидкости, хориона, плаценты и лимфоциты пуповин-

ной крови плода, полученные тем или иным инвазивным способом (см. 

раздел 9.6). Все эти клетки, как установлено, имеют плодное проис-

хождение и по своим генотипическим характеристикам соответствуют 

клеткам самого плода. В нашем центре наиболее часто используются 

клетки хориона (I триместр) или клетки плаценты (II триместр), полу-

ченные с помощью трансабдоминальной хорионбиопсии или плацен-

тобиопсии. Хромосомные препараты из тканей хориона или плацен-

ты готовят прямым методом, детально рассмотренным нами ранее в 

методиче ских рекомендациях [16] и в соответствующем руководстве 

[192] (см. также Приложение).

Преимущества  и  недостатки  цитогенетического  анализа  при  ис-

пользовании разных методов получения хромосомных препаратов из 

образцов плодного материала суммированы в таблице 9.7. Использо-

вание в большинстве центров комплекса цитогенетических и молеку-

лярно-цитогенетических методов диагностики позволяет получить на-

иболее полную информацию о кариотипе плода на различных стадиях 

внутриутробного развития.

9.7.1. особенности цитогенетического анализа

 клеток различного плодного происхождения

Основные принципы получения и анализа препаратов подробно об-

суждены в главе 4. Здесь лишь кратко напомним особенности исполь-

зования образцов материала для пренатального кариотипирования.

9.7.1.1. Клетки амниотической жидкости

Клетки амниотической жидкости (КАЖ) представлены нескольки-

ми типами различного происхождения:

клетки амниотической оболочки (собственно амниоциты);

• 

эпителиальные  клетки  плода  (эпидермиса,  пищеварительного 

• 

тракта, мочеполовых и дыхательных путей, слизистой ротовой 

полости).

Количественный  и  качественный  состав  КАЖ,  а  также  конце-

нтрация жизнеспособных клеток имеют индивидуальную вариабель-

333

Глава 9. 

Пренатальная диагностика хромосомных болезней

ность и зависят от стадии развития. Оптимальными для ПД являются  

амнио циты, которые обычно активно пролиферируют и являются спе-

цифическими для данной культуры. Наиболее часто для культивирова-

ния используют амниотические клетки, полученные в срок 15–18 не-

дель беременности. Использование для этих целей амниоцитов более 

ранних (12–14 недель беременности) или более поздних (после 20-й 

недели беременности) сроков принципиально возможно, но, как пра-

вило, резко осложняет и удлиняет процесс диагностики.

Стандартное  культивирование  амниоцитов  с  момента  получения 

образца АЖ до кариотипирования занимает 14–21 день. К недостаткам 

можно отнести высокую стоимость культуральных питательных сред 

и  оборудования,  что  немаловажно  для  отечественных  лабораторий,  

а также высокую (до 2

 

%) вероятность контаминации образца клетка-

ми материнского происхождения.

9.7.1.2. Клетки ворсин хориона (плаценты)

Клетки  ворсинчатого  хориона  (плаценты),  доступные  для  ПД,  

имеют различное происхождение:

клетки цитотрофобласта (дифференцируются на стадии морулы);

• 

клетки мезенхимы (дифференцируются на стадии бластоцисты).

• 

Для  хромосомного  анализа  по  клеткам  хориона  или  плаценты  

используют два основных метода.

1. Длительное культивирование: растущие в монослое первичные 

культуры имеют гетерогенный клеточный состав с преимущественным 

ростом фибробластоподобных клеток мезенхимальной стромы ворсин. 

Образование колоний или рыхлого монослоя происходит обычно к 10–

12 дню культивирования. Основными недостатками метода являются 

длительность культивирования и контаминация культур материнскими 

клетками.

2.  «Прямые»  препараты.  Метод  анализа  «прямых»  препаратов 

базируется на исследовании спонтанно делящихся клеток цитотрофо-

бласта без их предварительного культивирования в сроки от 10 до 20 

недель беременности.

Нами  разработаны  собственные  модификации  прямого  метода — 

метод «стряхивания — отпечатывания» и ускоренный прямой метод, 

которые  позволяют  получать  препараты  из  хориона/плаценты,  удов-

летворяющие всем критериям кариотипирования. В сочетании с флуо-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

334

ресцентными методами дифференциальной окраски хромосом резуль-

тативность этих методов превышает 99

 

%.

Следует подчеркнуть, что эти модификации пригодны для приго-

товления препаратов хромосом из тканей с высокой естественной ми-

тотической активностью, включая любые ткани и органы зародыша. 

Интерфазные ядра, обработанные таким способом, вполне пригодны 

для метода FISH со специфическими ДНК-зондами, что важно при ве-

рификации цитогенетического пренатального диагноза.

9.7.1.3. лимфоциты пуповинной крови плода

Для хромосомного анализа крови плода используют стандартную 

методику стимулирования лимфоцитов фитогемагглютинином (ФГА).

Этот метод дает наиболее адекватное представление о хромосом-

ном статусе плода и настоятельно рекомендуется для кариотипирова-

ния плода в случае хромосомного мозаицизма в плаценте, а также при 

наличии пороков развития не только во II, но как показывает наш опыт 

и в III тримеcтре беременности. В последнем случае кариотипирова-

ние плода позволяет разрешить вопрос о тактике ведения беременнос-

ти, родов и неонатального периода.

9.7.2. основные принципы цитогенетического

 анализа в пренатальной диагностике

При  пренатальном  кариотипировании  следует  руководствовать-

ся  рекомендациями,  принятыми  в  отечественной  и  международной 

клинической цитогенетике [92, 408, 547], а также нормативными до-

кументами МЗ РФ (Приказ МЗ РФ № 316 от 30.12.1993). Заключение  

о  кариотипе  должно  соответствовать  правилам  Международной  но-

менклатуры хромосом [510]. 

Программы  контроля  качества  цитогенетических  исследований  

в учреждениях медико-генетической службы включают состав и ква-

лификацию  персонала,  оборудование  и  реактивы,  а  также  ряд  пара-

метров,  касающихся  непосредственного  выполнения  хромосомного  

анализа [123].

В  связи  с  увеличением  числа  центров  ПД,  а  также  отсутствием  

единой системы контроля качества, представляется целесообразным рас-

смотреть основные требования к организации работы цитогенетических  

335

Глава 9. 

Пренатальная диагностика хромосомных болезней

подразделений,  обратив  особое  внимание  на  критерии  качества  прена-

тального кариотипирования. 

9.7.2.1. состав и квалификация персонала

Согласно нормативам (Приказ МЗ РФ № 316 от 30.12.1993), цито-

генетическая пренатальная диагностика осуществляется коллективом, 

состоящим  из  специалистов  с  высшим  и  средним  специальным  об-

разованием. При этом штатная структура цитогенетического подраз-

деления должна иметь не менее двух ставок врачей-цитогенетиков и 

соответствующее им число ставок фельдшеров-лаборантов. При этом 

каждый врач-цитогенетик должен выполнить 160 пренатальных карио-

типов в год.

9.7.2.2. оборудование

Необходимым  условием  точности  проводимых  исследований  яв-

ляется  соответствующее  им  лабораторное  оборудование,  контроль  и 

сертификация которого осуществляются по определенной схеме.

9.7.2.3. реактивы

Следует особо подчеркнуть, что необходимо заблаговременно про-

верять качество всех реактивов, используемых для приготовления ра-

бочих растворов. Во избежание повторных технических ошибок реко-

мендуется учитывать и анализировать их характер и частоту в режиме 

лабораторной базы ошибок.

9.7.2.4. Показатели качества

 цитогенетических исследований

Число анализируемых метафаз. Для препаратов из культур кле-

ток  достаточным  считается  наличие  20–50  метафазных  пластинок 

на предметное стекло. Качество «прямых» препаратов из цитотрофо-

бласта хориона или плаценты, как отмечалось выше, можно считать 

удовлетворительным, если на стекле присутствует более 10 метафаз, 

пригодных  для  подсчета  и  анализа  структуры  хромосом.  При  этом 

независимо от способа приготовления препаратов разброс хромосом 

признается  хорошим,  если  наложения  хромосом  отсутствуют  или 

представлены небольшим числом (1–2) в более 80

 

% пластинок, и пло-

хим,  если  многочисленные  наложения  хромосом  встречаются  более 

чем в 20

 

% метафаз.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

336

Качество окраски. Для ориентировочной оценки уровня разреше-

ния рекомендуется произвести подсчет числа G-сегментов в хромосо-

мах 1 и 2 с умножением полученной суммы на 6. Качество окраски 

признается хорошим, если ее четкость при уровне разрешения ~ 550 

сегментов позволяет идентифицировать четыре G

 + 

-сегмента на 18q и 

3 — на 11p, 7q33 и 7q35, особенно если удается визуализировать сег-

мент 22q13.2. Такой уровень (400–550 сегментов на гаплоидный набор) 

достаточен  для  стандартного  кариотипирования.  Для  анализа  мик-

роперестроек  хромосом  требуется  более  высокое  разрешение  (> 800 

сегментов), которое достигается при использовании репликационных 

вариантов дифференциального окрашивания.

Время  анализа.  Промежуток  времени  от  момента  получения 

плодного  материала  до  постановки  цитогенетического  диагноза  за-

висит  от  методических  особенностей  выполняемого  исследования, 

пропускной способности лаборатории, диагностической сложности 

конкретного случая, необходимости уточняющих лабораторных ме-

роприятий  и т. д.  Оптимальным  для  кариотипирования  по  клеткам 

ворсин хориона является срок 3–7 дней, клеток амниотической жид-

кости —  10–16  дней,  лимфоцитов  пуповинной  крови —  4–7  дней. 

Большую часть времени составляет этап культивирования, тогда как 

собственно анализ хромосомных препаратов в стандартном режиме 

занимает  1–1,5  рабочих  дня.  Однако  реальные  сроки  цитогенети-

ческой  диагностики  могут  варьировать  в  широком  диапазоне.  Так, 

высоко технологичный и продуктивный метод FISH позволяет прово-

дить анализ по интерфазным ядрам на препаратах некультивирован-

ных клеток за 1–2 дня. Этот метод широко используется за рубежом 

для экспресс-диагностики наиболее распространенных анеуплоидий. 

Разработанный нами ускоренный прямой метод приготовления пре-

паратов из цитотрофобласта в сочетании с окрашиванием хромосом 

флуорохромом Hoechst 33258 позволяет провести традиционное ка-

риотипирование и при необходимости выдать цитогенетическое за-

ключение в день получения материала.

Увеличение  времени  анализа,  оптимального  для  каждого  метода, 

обусловлено  либо  техническими,  либо  диагностическими  проблема-

ми. К техническим проблемам можно отнести низкий митотический 

индекс и неудовлетворительное качество метафазных пластинок, что 

требует просмотра всех полученных препаратов. Возможные неудачи 

337

Глава 9. 

Пренатальная диагностика хромосомных болезней

при  цитогенетическом  исследовании  обусловлены,  как  правило,  от-

сутствием  метафазных  пластинок,  пригодных  для  анализа.  Средние 

стандарты  технических  (неполучение  результата  при  наличии  жиз-

неспособных клеток) и культуральных (отсутствие адекватного роста 

клеток) неудач при кариотипировании по клеткам амниотической жид-

кости и хориона составляют 1,5 и 2

 

% соответственно, а по лимфоцитам 

перифериче ской крови — 5

 

% [123]. Накопленный нами опыт (более 

8000 пренатальных диагностик) показывает, что результативность ана-

лиза по клеткам цитотрофобласта на «прямых» препаратах из хориона 

и плаценты, а также по ФГА-стимулированным лимфоцитам пуповин-

ной крови оказывается выше (в среднем 99,8

 

%) [88]. Причины невоз-

можности проведения цитогенетического анализа в 0,2–0,4

 

% случаев 

были рассмотрены нами в соответствующих разделах (глава 4). Вместе 

с тем, отсутствие или недостаточное число метафаз на «прямых» пре-

паратах далеко не всегда связано с нехваткой материала, полученного 

при хорион- или плацентобиопсии. Однако вес образца должен состав-

лять ≥ 10 мг для ускоренного метода и ≥ 15 мг для кратковременных 

культур, а в случае совмещения прямых методов с культивированием 

клеток в монослое — ≥ 30 мг.

Диагностическим  проблемам  и  способам  их  решения  посвящен 

специальный раздел этой главы. Отметим только, что сложные случаи  

требуют не только применения дополнительных методик для уточнения 

первичного  цитогенетического  заключения,  но  и  кариотипирования 

родителей,  что  задерживает  постановку  цитогенетического  диагноза 

как минимум на неделю.

Правила  кариотипирования.  Заключение  о  кариотипе  должно 

базироваться на идентификации и анализе структуры всех хромосом на 

2–3 метафазных пластинках. Для заключения о кариотипе минимальное 

число пластинок должно составлять 11–15. Такой объем исследования 

позволяет исключить хромосомный мозаицизм с вероятностью более 

95 %.  Мозаичная  форма  геномных  мутаций  устанавливается  при 

наличии не менее двух клеток с однотипным изменением кариотипа, 

что требует увеличения размера анализируемой выборки (подробнее  

о статистических проблемах диагностики мозаицизма см. [187]).

Особенности  получения  информации  о  кариотипе  плода  при  ис-

пользовании  различных  методик,  обусловленных  спецификой  иссле-

дуемого материала, описаны в главе 4.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

338

Следует отметить, что системы анализа изображений с программ ным 

обеспечением  для  кариотипирования  целесообразно  использовать 

в  интерактивном  режиме.  Ни  одна  из  существующих  в  настоящее 

время программ для автоматического кариотипирования не является 

совершенной, и любая предложенная в автоматическом режиме карио-

грамма нуждается в проверке. Разница между программами состоит 

только в числе ошибок в кариограмме, полученной при автоматиче ской 

раскладке идеальных метафазных пластинок с хорошим разбросом и 

отличной G-окраской хромосом. Как правило, требуется коррекция 2–

5 и более ошибок, вызванных неправильным распознаванием гомоло-

гичных  и  негомологичных  хромосом  и  неадекватным  размещением 

их  в  ячейках  раскладки.  Следует  напомнить,  что  под  кариотипом 

понимают  совокупность  морфологических  особенностей  полного 

хромосомного  набора  единичной  соматической  клетки  [134,  510]. 

Поэтому в кариограмме, которая является систематизированной харак-

теристикой  кариотипа,  должны  быть  представлены  гомологичные 

хромосомы,  идентифицированные  на  одной  метафазной  пластинке. 

Недопустимо использовать при составлении кариограммы хромосомы, 

принадлежащие разным наборам, т. е. из разных клеток.

Формулировка цитогенетического диагноза. Цитогенетический 

диагноз  должен  быть  сформулирован  в  точном  соответствии  

с рекомендациями Международной системы цитогенетической номен-

клатуры  хромосом  [510].  С  основными  правилами  Международной 

цитогенетической  номенклатуры,  переведенными  на  русский  язык, 

можно  ознакомиться  в  изданиях  отечественных  авторов  [38,  124].  

В  любых  случаях  нестандартного  кариотипа  цитогенетическую 

формулу  целесообразно  сопровождать  развернутым  заключением, 

в  котором  интерпретируется  цитогенетический  диагноз,  а  также 

поясняются указанные в формуле особенности хромосомного набора.

В заключение следует отметить, что при стандартном кариотипи-

ровании  исключается  носительство  всех  геномных  мутаций  (анеуп-

лоидий  и  полиплоидий)  и  Робертсоновских  транслокаций,  а  также 

многих реципрокных транслокаций и некоторых инверсий, особенно 

если они изменяют морфологию хромосом, вовлеченных в перестройку. 

Возможность точной идентификации хромосомных аберраций зависит 

от разрешающей способности использованного метода дифференциа-

льной  окраски  и  в  целом  ряде  случаев  представляет  значительные 

339

Глава 9. 

Пренатальная диагностика хромосомных болезней

трудности.  Принимая  также  во  внимание  статистические  проблемы 

диагностики хромосомного мозаицизма даже в пределах одной ткани, 

важно подчеркнуть, что стандартное пренатальное кариотипирование 

позволяет исключить хромосомные болезни с вероятностью > 99 %, 

что, к сожалению, недостаточно для абсолютной гарантии рождения 

здорового ребенка.

9.7.3. диагностические проблемы

 кариотипирования плода

Трудности при ПД могут представлять как геномные, так и хромо-

сомные мутации, некорректная интерпретация которых может привести 

к диагностическим ошибкам. Сложными для цитогенетического анализа 

и  требующими  уточнения  являются  многие  наследуемые  аберрации 

хромосом,  все  случаи  структурных  перестроек,  возникшие  de novo, 

не идентифицированные сверхчисленные маркерные хромосомы, мозаи-

 цизм хромосом и однородительская дисомия (ОРД).

Учитывая  различную  диагностическую  и  прогностическую  значи-

мость выявленных изменений кариотипа, а также разрешающую способ-

ность  уточняющих  диагностических  мероприятий,  рассмотрим  кратко 

каждую из этих проблем, а также оптимальные варианты их решения.

9.7.3.1. структурные перестройки

 хромосом, возникшие 

de novo

Если показанием для кариотипирования плода является носитель-

ство  структурной  перестройки  одним  из  родителей,  то  при  выборе 

способа  инвазивного  вмешательства  необходимо  учитывать  особен-

ности хромосомной аберрации. К сожалению, разрешающая способ-

ность цитогенетического анализа на «прямых» препаратах хориона по 

сра внению с препаратами из культивированных клеток плода (лимфо-

цитов или амниоцитов) невысока. Поэтому точная диагностика в I три-

меcтре беременности ограничена Робертсоновскими транслокациями, 

а также другими перестройками, существенно меняющими морфоло-

гию хромосом. При реципрокных транслокациях, в образовании кото-

рых принимают участие равноценные по размеру и сходные по рисунку 

дифференциальной исчерченности участки хромосом, предпочтитель-

нее проводить диагностику по лимфоцитам пуповинной крови. Ана-

логичных рекомендаций следует придерживаться и в случаях парацен-