Цитогенетика эмбрионального развития - часть 43

Цитогенетика эмбрионального развития человека

340

трических и перицентрических инверсий. Наибольшие трудности при 

анализе  хромосом  даже  из  культивированных  клеток  представляют 

небольшие по размеру перестройки, особенно если они локализованы 

в теломерных G-отрицательных сегментах хромосом. Следует подчер-

кнуть, что практически во всех случаях семейного носительства пе-

рестроек  целесообразно  проводить  сравнительный  анализ  хромосом 

плода и родителей, используя комплекс методов дифференциального 

окрашивания и FISH с ДНК-зондами, необходимых для идентифика-

ции конкретной перестройки.

Спонтанные  хромосомные  аберрации,  то  есть  перестройки,  не 

унаследованные от кого-либо из родителей при подтвержденном от-

цовстве, пренатально встречаются относительно редко (0,06–0,20

 

% от 

всех исследований) [749]. В наших исследованиях их частота состави-

ла 0,07

 

% (у 5 из 7579 плодов).

При обнаружении хромосомной перестройки, действительно воз-

никшей  de novo,  невозможно  полностью  исключить  сопутствующие 

микроперестройки  и,  следовательно,  несбалансированность  хромо-

сомного набора, и, тем более, определить наличие генных мутаций в 

точках разрывов. В этой ситуации, согласно рекомендациям Европей-

ского общества перинатологов, риск рождения ребенка с какими-либо 

аномалиями развития оценивается в 10

 

% [749].

Принимая во внимание, что информация о развитии плода, полу-

ченная  с  помощью  УЗИ,  ограничена  оценкой  состояния  отдельных 

органов и систем, желательно во всех случаях неясного цитогенетиче-

ского  диагноза  проводить  кариотипирование  биологических  роди-

телей.  К  таким  случаям  относятся  также  структурно  полиморфные 

участки хромосом, которые необходимо дифференцировать от струк-

турных аномалий:

прицентромерные гетерохроматиновые районы хромосом 1, 16 и 

• 

особенно 9 (варианты 9qh, 9ph, 9phqh);

спутники на коротких плечах хромосомы 17 и на длинном плече 

• 

Y-хромосомы;

вариабельные размеры коротких (р) плеч акроцентрических хро-

• 

мосом групп D и G;

длинное плечо Y-хромосомы, включая район Yqh.

• 

Стандартная схема диагностики структурных перестроек, в том числе 

при отсутствии информации о кариотипе родителей на момент проведения  

341

Глава 9. 

Пренатальная диагностика хромосомных болезней

Несбалансированная

хромосомная

перестройка

Структурный

полиморфизм

Cемейная форма 

Cбалансированный кариотип

Нормальный фенотип

Биопсия хориона или плаценты

Структурная перестройка, 

несбалансированный

кариотип

Кариотипирование родителей

УЗИ 2-го уровня

Кордоцентез

Сверхчисленная

маркерная

хромосома

Сбалансированная

хромосомная

перестройка

De novo

Пролонгирование

беременности

УЗИ и

допплерометрия

в динамике

Прерывание

беременности

Семейная форма?

Идентификация точек разрыва

de novo, 

сбалансированный кариотип??

Нормальный фенотип

Пренатальный

консилиум

de novo, 

сбалансированный кариотип?

Аномалии развития

Т е с т и р о в а н и е О Р Д

Биопсия хориона или плаценты

Структурная перестройка

, 

несбалансированный

кариотип

Кариотипирование родителей

УЗИ 2-го уровня

Кордоцентез

Сверхчисленная

маркерная

хромосома

Сбалансированная

хромосомная

перестройка

De novo

Пролонгирование

беременности

УЗИ и

допплерометрия

в динамике

Прерывание

беременности

Семейная форма?

Идентификация точек разрыва

De novo 

Сбалансированный кариотип?

Нормальный фенотип

Пренатальный

консилиум

De novo, 

Сбалансированный кариотип?

Аномалии развития

Т е с т и р о в а н и е О Р Д

Рис. 9.5. Принципиальная схема пренатальной диагностики хромосомных мутаций

Цитогенетика эмбрионального развития человека

342

анализа, предполагает ряд диагностических мероприятий (рис. 9.5). При 

обнаружении структурной перестройки (или подозрении на ее наличие) 

необходимо уточнить ее происхождение, т. е. провести кариотипиро-

вание  родителей.  В  любом  случае  необходимо  определить  сбалан-

сированность  аберрации,  для  чего  предпринять  попытки  уточнения 

точек разрывов методом FISH с использованием локус-специфичных 

ДНК-зондов.  При  установлении  родительской  принадлежности 

сбалансированной хромосомной аберрации рекомендуется пролонги-

рование беременности с УЗ-контролем в динамике. Если установлен 

факт  возникновения  морфологически  сбалансированной  аберрации 

de novo, необходимо проинформировать беременную о высоком риске 

отклонений  в  развитии  плода,  а  также  о  возможных  психических  и 

физических  нарушениях  у  ребенка  после  рождения.  Рекомендации 

по  ведению  беременности  в  этом  случае  целесообразно  выраба-

тывать на пренатальном консилиуме с привлечением неонатологов и 

педиатров. В случае несбалансированного кариотипа, обусловленного 

перестройкой de novo или унаследованного от родителей вследствие 

сегрегации  перестроенных  хромосом,  рекомендуется  прерывание 

беременности. Следует подчеркнуть, что кариотипирование родителей 

при обнаружении любой хромосомной перестройки у плода является 

обязательным,  т. к. имеет  принципиальное значение  не  только  для 

диа г нос тики при настоящей беременности, но и для прогноза здоровья 

будущих детей. Зачастую носители структурных перестроек выявляются 

именно в таких ситуациях.

Носители хромосомных мутаций (реципрокных и Робертсоновских 

транслокаций,  изохромосом,  маркерных  хромосом)  относятся  также  

к группе повышенного риска по ОРД у плода. Наличие хромосомных 

перестроек  приводит  к  образованию  гамет  с  частичной  или  полной 

анеуплоидией,  при  последующей  коррекции  которой  возникает  ОРД 

по хромосомам или сегментам хромосом, вовлеченных в перестройку. 

В этих группах, a priori имеющих риск ОРД у плода, целесообразно  

заранее  предусмотреть  получение  пуповинной  крови  одновременно 

для цитогенетической и молекулярной диагностики во избежание пов-

торных инвазивных манипуляций.

Особенного  внимания  заслуживают  Робертсоновские  транслока-

ции с участием хромосом 14 и 15. Риск ОРД составляет 0,65

 

%, если 

аберрантная  хромосома  образована  негомологичными  хромосомами, 

343

Глава 9. 

Пренатальная диагностика хромосомных болезней

и  66

 

% —  если  она  представлена  транслокацией  между  гомологами 

или изохромосомой [868]. В случаях обнаружения при пренатальном 

карио типировании  таких  структурных  перестроек,  наследуемых  или 

возникших de novo, рекомендуется тестирование ОРД.

9.7.3.2. Маркерные хромосомы

Маркерными  хромосомами  обычно  обозначают  сверхчисленные 

хромосомы неизвестного происхождения. Некоторые из них являются 

результатом  внутрихромосомных,  другие —  межхромосомных  пере-

строек.  Условно  маркерные  хромосомы  можно  подразделить  на  не-

сколько групп:

по происхождению (возникшие 

• 

de novo и наследуемые);

по форме геномной мутации (мозаичные и немозаичные);

• 

по морфологии (спутничные, т. е. содержащие короткие плечи 

• 

акроцентрических хромосом, и несателлитные).

Маркерные  хромосомы  в  пренатальном  периоде  выявляются 

с  частотой  0,6–0,96 : 1000  [482].  В  зависимости  от  генетического 

материала,  входящего  в  состав  маркерной  хромосомы,  они  могут 

сопровождаться  пороками  или  задержкой  развития  плода,  иметь 

серьезные клинические проявления сразу после рождения, затрагивать 

только  репродуктивную  или  ментальную  функции,  либо  феноти-

пически  никак  не  проявляться.  Определение  природы  маркерных 

хромосом  всегда  представляет  значительные  трудности,  однако  их 

идентификация при пренатальном кариотипировании, даже если они 

относятся к семейным формам, имеет принципиальное значение для 

тактики дальнейшего ведения беременности.

При обнаружении маркерной хромосомы у плода необходимо ка-

риотипировать  родителей  для  установления  происхождения  маркера 

(семейная форма или мутация de novo), провести идентификацию мар-

кера всеми доступными методами и определить форму анеуплоидии 

(полная или мозаичная).

Прогноз  более  благоприятен,  если  один  из  фенотипически  нор-

мальных родителей (а также его родственники c нормальными репро-

дуктивной функцией и интеллектом) является носителем идентичной 

маркерной  хромосомы,  представленной  в  той  же  форме  (мозаичной 

или полной).

Стандартный  алгоритм  идентификации  маркерной  хромосомы 

включает  различные  методические  приемы  (рис. 9.6).  На  первом  этапе 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

344

Сверхчисленная маркерная хромосома

Ag-ЯОР окраска

Ag

+

-ЯОР

Ag

-

-ЯОР

FISH c rDNA

rDNA

+

rDNA

-

FISH с ДНК-зондами, специфичными к

центромерным районам хромосом

групп D и G

FISH с ДНК-зондами, специфичными

к центромерным районам всех

хромосом набора

cen

+

cen

-

mar > 17p                                    

Многоцветная FISH с

район-специфичными ДНК-

зондами (МСВ)

mar < 17p                                    

FISH с локус-специфичными

прицентромерными ДНК-

зондами

Микродиссекция и

«обратная»FISH

Cравнительная геномная

гибридизация (CGH)
Многоцветная гибридизация

с хромосом-специфичными

ДНК-зондами (M-FISH)

Тестирование

сегментной ОРД

Рис. 9.6. Алгоритм идентификации сверхчисленных маркерных хромосом: 

rDNA

 + 

 — наличие кластеров рибосомных генов; 

rDNA

–

 — отсутствие рибосомных генов; 

cen

 +  

— наличие центромерного района какой-либо из хромосом; 

cen

- 

— отсутствие центромерного района какой-либо из хромосом;

17р  —  короткое  плечо  хромосомы  17  как  репер  для  оценки  размера  маркерной 

хромосомы (mar).

 

345

Глава 9. 

Пренатальная диагностика хромосомных болезней

устанавливается  наличие  ядрышкообразующих  районов  хромосом 

(ЯОР), для чего используется метод Ag-окраски. Однако известно, что не 

все ЯОР являются Ag-положительными, то есть содержащими активные 

кластеры рибосомных генов. В этой ситуации рекомендуется проведение 

FISH с рДНК-зондом. Следующим шагом в идентификации сателлитных 

маркеров является установление принадлежности конкретной акроцен-

трической  аутосомы  методом  FISH  с  ДНК-зондами,  специфическими 

к прицентромерным районам всех акроцентриков [207]. Несателлитная 

маркерная  хромосома  может  состоять  из  материала  любого  участка 

генома.  Прежде  всего,  рекомендуется  провести  FISH  с  различными 

прицентромерными  ДНК-зондами,  что  позволит  установить  ее  прина-

длежность к конкретной хромосоме. Отсутствие сигнала, специфического 

для прицентромерного района какой-либо из 24 хромосом (22 аутосомы, 

Х  и  Y),  может  указывать  на  наличие  у  маркерной  хромосомы  участка  

с неоцентромерной активностью.

Во всех случаях маркерных хромосом необходимо устанавливать 

наличие  эухроматинового  материала,  что  не  всегда  достигается 

методами  дифференциального  окрашивания.  Проблемы  идентифи-

кации  маркерных  хромосом,  особенности  методических  приемов, 

включая  получение  и  применение  микродиссекционных  ДНК-проб, 

а  также  различные  варианты  методов  FISH,  детально  рассмотрены  

в специальных методических и учебных пособиях [165, 167].

После идентификации в семейной маркерной хромосоме эухрома-

тинового материала необходимо убедиться, что ее наличие в кариотипе 

плода не приводит к частичной трисомии, а отсутствие — к частичной 

моносомии  по  содержащимся  в  маркере  сегментам.  В  тех  случаях, 

когда маркер является производным хромосом, для которых известен 

эффект импринтинга, рекомендуется исключение сегментной ОРД.

Общий  риск  аномалий  развития  у  плода  при  сверхчисленных 

маркерных  хромосомах,  возникших  de novo,  составляет  около  8 % 

для сателлитных маркеров (состоящих из коротких плеч акроцентри-

ческих  аутосом,  несущих  рибосомные  гены)  и  27 % — для  несател-

литных маркеров [749].

9.7.3.3. Мозаицизм хромосом

Диагностика хромосомного мозаицизма была подробно рассмотрена 

в главах 4 и 7. В этом разделе обсуждаются оптимальные пути решения 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

346

проблем,  возникающих  при  обнаружении  на  препаратах  клеток  

с  различным  хромосомным  набором.  Вероятность  такого  события  

в пренатальной диагностике определяется спецификой исследуемого 

материала  и  зависит  от  методов  приготовления  препаратов.  Однако 

в  каждом  случае  необходимо  определить,  является  ли  мозаицизм 

артефактным,  т.  е.  обусловлен  методическими  погрешностями,  или 

он  реально  отражает  кариотип  плода.  Если  мозаицизм  обнаружен  

в  клетках  плаценты,  необходимо  выяснить,  ограничен  ли  он  только 

этим органом или присутствует в соматических тканях зародыша, то 

есть является истинным. Особое внимание, которое уделяется мозаи-

цизму в ПД, связано с тем, что в отличие от полных форм хромосомного 

дисбаланса многие мозаичные трисомии оказываются совместимыми 

с развитием и живорождением. При этом тяжесть клинических прояв-

лений, в том числе и в пренатальном периоде, не обнаруживает прямой 

корреляции  с  представительностью  аномальной  клеточной  линии  

в тканях, доступных для исследования.

Наиболее наглядным примером артефактного мозаицизма является 

моносомия,  возникающая  вследствие  утраты  хромосом  в  процессе 

приготовления  препаратов.  К  разряду  артефактов  можно  отнести  и 

псевдомозаицизм,  обусловленный  спорадическим  нерасхождением 

хромосом  в  одной  клетке  и  ее  способностью  к  клонообразованию 

в  условиях  in vitro.  Реальный  мозаицизм  необходимо  отличать  от 

химеризма.  Напомним,  что  химера —  это  особь,  развивающаяся  из 

разных зигот после их слияния.

Обнаружение межклеточных различий по хромосомным наборам 

может быть также следствием контаминации исследуемого плодного 

образца клетками материнского происхождения. Риск ошибок, обуслов-

ленных контаминацией, составляет 0,16 % при культивировании КАЖ 

и до 0,4 % при долгосрочном культивировании клеток ворсин хориона. 

Риск  ошибочных  результатов  снижается  при  сокращении  времени 

культивирования.  При  использовании  «прямого»  метода  приготов-

ления препаратов вероятность обнаружения метафазной пластинки из 

клеток других тканей, кроме клеток цитотрофобласта, крайне мала.

Источником проблем диагностики по лимфоцитам плода является 

контаминация образца пуповинной крови околоплодными водами и ма-

теринской кровью. КАЖ, которые не способны к пролиферации в сус-

пензионной культуре, а также незначительный объем амниотической  

347

Глава 9. 

Пренатальная диагностика хромосомных болезней

жидкости  в  образце  пуповинной  крови  не  влияют  на  процесс  куль-

тивирования  лимфоцитов.  Однако  по  мере  снижения  концентрации 

клеток крови и увеличения объема амниотической жидкости в полу-

ченном образце возрастает риск культуральных неудач. К серьезным 

диагностическим  ошибкам  обычно  приводит  примесь  материнской 

крови. Поэтому чрезвычайно важно контролировать чистоту каждого 

образца пуповинной крови. Во избежание недоразумений тест на кон-

таминацию желательно проводить в присутствии акушера-оператора 

непосредственно в предоперационной.

Особого внимания заслуживают характер и тип хромосомных ано-

малий.  Так,  тетраплоидия,  в  отличие  от  других  геномных  мутаций, 

обусловлена  исключительно  нарушением  кариотомии  и  цитотомии 

при митотическом делении клеток трофобласта. При физиологически 

прогрессирующей  беременности  она  всегда  ограничена  плацентой. 

Тетраплоидные  метафазные  пластинки,  особенно  эндомитозы,  отно-

сительно  часто  наблюдаются  на  «прямых»  препаратах  из  хориона  и 

плаценты, а также на препаратах культивированных амниоцитов. Как 

правило, тетраплоидия представлена мозаичной формой 2n/4n, однако 

в некоторых случаях нормальные диплоидные метафазы в анализиру-

емом образце хориона или плаценты могут отсутствовать. В отличие 

от тетраплоидии, которую в определенной степени можно считать ва-

риантом нормального развития плаценты или же отнести к артефакту 

при культивировании клеток, триплоидия независимо от формы (пол-

ной  или  мозаичной),  всегда  сопровождается  пороками  и  задержкой 

развития плода.

Подозрение  на  плацентарный  мозаицизм  должно  возникать  при 

обнаружении  летальных  или  сублетальных  хромосомных  аномалий 

на препаратах из хориона или плаценты при отсутствии пороков раз-

вития у плода. За исключением аутосомных моносомий, которые, как 

правило, обусловлены методическими артефактами, и тетраплоидии, 

все остальные случаи мозаичных кариотипов (мозаичная триплоидия, 

мозаичная  трисомия  по  любой  хромосоме  набора  и  моносомия  Х), 

независимо от пропорции аномальных клеток, нуждаются в дополни-

тельных исследованиях.

Последовательность диагностических мероприятий представле-

на на рисунке 9.7. На первом этапе для установления ОПМ жела-

тельно провести анализ долгосрочных культур. На втором – анализ