Цитогенетика эмбрионального развития - часть 19

Цитогенетика эмбрионального развития человека

148

4.6.2. Происхождение хромосомных мутаций

В зависимости от хромосом, участвующих в перестройке, методы 

идентификации ее родительского происхождения могут быть различ-

ными.

Так,  наличие  материала Y-хромосомы  в  любом  из  вариантов  пе-

рестроек  de novo  однозначно  свидетельствует  о  ее  происхождении  в 

сперматогенезе (рис. 4.22, 4.23). Однако точная локализация точек раз-

рыва, равно как и идентификация хромосомных маркеров, возможна 

лишь при использовании комплекса методов: традиционного кариоти-

пирования и специальных методов анализа. Например, дифференци-

альная деконденсация гетерохроматина, методы RBA и FPG в сочета-

нии с методом FISH, а также ПЦР-анализ [343, 898] доказывают перс-

пективность такого комплексного 

подхода при анализе аномалий в 

системе половых хромосом.

Точное  родительское  проис-

хождение структурных аберраций 

может  быть  установлено  лишь 

при  использовании  полиморф-

ных  локусов  ДНК.  Напомним 

(см. главу 3),  что  большинство 

структурных  перестроек,  возни-

кающих  de novo  (изохромосомы, 

Робертсоновские  и  реципрокные 

транслокации,  делеции,  инвер-

сии, дупликации, центрические и 

ацентрические фрагменты и пр.) 

(рис. 4.24),  уникальны  и,  соот-

ветственно,  требуют  индивиду-

ального подхода к установлению 

механизмов их происхождения.

Рис.4.22. 

Структурная 

перестройка  

Y-хромосомы.  Кариотип  плода  46,X,t(Y;15) 

(q12;q12).  Фрагмент метафазной  пластин-

ки  из  клетки  цито трофобласта  хориона. 

Окраска QFH/AcD.

Рис.4.23.  Структурная  перестройка 

Y-хромосомы  у  пациентки  с  синдро-

мом  Шерешевского–Тернера  (кариотип 

46,X,idic(Yp)). 

ФГА-стимулированные 

лимфоциты  периферической  крови. 

FISH c ДНК-зондом DYZ3

149

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

Рис. 4.24. Структурные перестройки хромосом. ФГА-стимулированные лимфоциты 

периферической  крови  (а–в)  и  цитотрофобласт  (10  недель  беременности)  (г):  а — 

del(Xp21::?) (FISH c локус-специфическим ДНК-зондом); б — dic(X) (FISH c ДНК-зон-

дом DXZ1); в — 46,ХХ/47,XX, + der(18) (FISH c цельнохромосомным ДНК-зондом 18); 

г — 45,XX,der(7;13) (окраска QFH/AcD)

 

а)  

б)

 

в)  

г)

Заключение

Таким  образом,  современные  цитогенетические  методы  исследова-

ния, дополненные при необходимости методами ДНК-анализа, позволяют 

проводить изучение геномных и хромосомных мутаций на разных эта-

пах онтогенеза человека и достаточно точно устанавливать механизмы их 

возникновения. В зависимости от стадии развития набор таких методов 

может быть различным. Каждый из рассмотренных подходов имеет свои 

недостатки и преимущества. Наиболее перспективным для цитогенети-

ки развития человека является комплексный подход, основанный на объ-

единении основных принципов цитогенетики гаметогенеза, пре- и пос-

тимплантационной диагностики и клинической цитогенетики. Прогресс 

способов получения материала плода для прижизненных лабораторных 

исследований предоставляет такую уникальную возможность.

ГлАвА 5 

ЧАсТоТА и сПеКТр ГеНоМНЫХ и 

ХроМосоМНЫХ МУТАЦиЙ в ГАМеТоГеНеЗе 

и НА рАЗНЫХ сТАдиЯХ вНУТриУТроБНоГо 

рАЗвиТиЯ ЧеловеКА

введение 

Хромосомные аномалии могут возникать на любой стадии онтоге-

неза. Последствия несбалансированных нарушений генома для разви-

вающегося организма особенно драматичны, когда такие нарушения 

происходят  еще  в  гаметах,  во  время  оплодотворения  или  на  ранних 

стадиях  дробления.  При  этом  хромосомные  аномалии,  характерные 

для  про-  и  преэмбрионального  периодов  развития  человека,  имеют 

свои качественные и количественные особенности. Последние обус-

ловлены специфическими пространственными и временными особен-

ностями созревания мужских и женских гамет (глава 1), различной эф-

фективностью презиготической селекции генетически неполноценных 

гамет в оогенезе и сперматогенезе, а также селекции несбалансирован-

ных геномов до имплантации и в процессе дальнейшего развития. 

5.1. Хромосомные аномалии в гаметогенезе

Преобладающее большинство геномных и хромосомных мутаций 

возникает в мейозе. Многие из них оказываются летальными и при-

водят к гибели зиготы на самых ранних стадиях ее развития. Поэтому 

оценка частоты возникновения хромосомных аномалий в гаметогене-

зе, которая основана на результатах непосредственного анализа хромо-

сомного набора гамет, представляется наиболее корректной. 

151

Глава 5. 

Частота и спектр геномных и хромосомных мутаций

5.1.1. сперматогенез

Как уже отмечалось (см. главу 4), сведения о частоте спонтанных 

хромосомных  аномалий  в  зрелых  сперматозоидах  человека  могут 

быть получены при помощи метода FISH либо путем прямого анализа 

хромосомного  набора  мужского  пронуклеуса  после  гетерологичного 

оплодо творения (см. 4.2.2.3). 

Основные итоги хромосомного анализа методом FISH с маркиро-

ванием всех хромосом, за исключением хромосом 19 и 22, позволяют 

утверждать, что частота гетероплоидных сперматозоидов в норме не 

превышает 1,5

 

% [451]. Установлено также, что участие разных хро-

мосом в образовании анеуплоидных сперматозоидов не равноценно. 

Так, у клинически здоровых доноров частота гетероплоидных спер-

матозоидов,  определенная  с  помощью  ДНК-проб,  специфичных  к 

прицентромерным районам хромосом 7 и 18, варьирует в пределах 

0,61–0,81

 

% [420]. Поскольку одноцветная FISH не позволяет отли-

чить дисомные по какой-либо хромосоме сперматозоиды от дипло-

идных,  полученные  результаты  отражают  их  суммарную  частоту, 

которая соответствует опубликованным данным для клинически здо-

ровых доноров спермы. Наиболее подвержены нерасхождению хро-

мосомы 1, 9, 16, 21, X и Y [451].

При исследовании в общей сложности более 3 млн спермиев пока-

зано,  что  частота  дисомных  по  разным  хромосомам  сперматозоидов 

варьи рует  в  широких  пределах  у  различных  групп  доноров  и  паци-

ентов. Существенно, что у пациентов с аномальными морфофункци-

ональными  параметрами  спермограммы  доля  гетероплоидных  спер-

матозоидов значительно выше, чем у доноров спермы, причем такая 

зависимость имеет линейный характер [4].

Методом  гетерологичного  оплодотворения  проанализировано  в 

общей сложности более 20 тысяч хромосомных комплементов зрелых 

сперматозоидов от здоровых доноров в возрасте от 18 до 65 лет [451].  

В этих исследованиях было установлено, что соотношение X- и Y-несу-

щих сперматозоидов у здоровых доноров соответствует теоретически 

ожидаемому 1:1, а наличие хромосомных аберраций не сказывается на 

подвижности и оплодотворяющей способности сперматозоидов. При 

этом частота структурных хромосомных аберраций в зрелых сперма-

тозоидах здоровых мужчин составляет 6–7

 

%, а частота анеуплоидии 

1–4

 

%  [536,  770].  Индивидуальная  частота  хромосомных  аберраций  

Цитогенетика эмбрионального развития человека

152

у доноров варьирует от 12–20

 

%. При этом их большая часть (до 13

 

%) 

приходится на структурные аберрации, а самым частым типом анома-

лий (до 50

 

%) являются хромосомные разрывы. Далее, в порядке убы-

вания, встречаются ацентрические фрагменты, хромосомные пробелы, 

дицентрические и маркерные хромосомы, изохромосомы, транслока-

ции, делеции, дупликации и комплексные хромосомные перестройки. 

Частота и спектр структурных перестроек не зависят от индивидуаль-

ных особенностей, а также от условий капацитации [451]. Единствен-

ным фактором, увеличивающим частоту аберраций, оказался возраст 

донора [224, 312]. При этом влияние возраста было показано только 

для  структурных  аберраций,  но  не  для  численных  аномалий  [451]. 

Факторы,  влияющие  на  частоту  хромосомных  аберраций,  возникаю-

щих в мейозе, более подробно рассмотрены в главе 6.

Частота анеуплоидных сперматозоидов у здоровых мужчин состав-

ляет в среднем 1–4

 

%, при этом гипогаплоидия превалирует над гипер-

гаплоидией (3,3 и 1,7

 

% соответственно) [451]. Несоответствие частот 

гипер-  и  гипогаплоидных  сперматозоидов,  по-видимому,  обусловлено 

артефактной утратой хромосом в процессе приготовления препаратов, 

причем чаще утрачиваются мелкие хромосомы и хромосомы из много-

численной группы С (большие субметацентрические хромосомы 6–12).

Суммарные результаты нескольких масштабных исследований [223, 

598] свидетельствуют о том, что частота нерасхождения хромосом 21, 

X, Y, 1, 9 и 16 повышена по сравнению с другими хромосомами, тогда 

как дисомии 6 и 17 не отмечены ни в одном из 17

 

998 сперматозоидов, 

исследованных после гетерологичного оплодотворения. Обращает на 

себя внимание, что хромосомы с увеличенными гетерохроматиновыми 

районами (1, 9, 16, Y) чаще других подвержены нерасхождению [451]. 

Эти результаты подтверждают гипотезу о гетерохроматине как факто-

ре, влияющем на расхождение хромосом [354]. В то же время районы 

ядрышковых организаторов не оказывают заметного влияния на сегре-

гацию хромосом, за исключением хромосомы 21. Частота сперматозо-

идов c анеуплоидией по ядрышкообразующим хромосомам групп D и 

G вполне сопоставима со средней частотой анеуплоидии по хромосо-

мам других групп [451].

Одной  из  современных  модификаций  метода  гетерологичного 

оплодо творения  является  метод  введения  спермиев  человека  непо-

средственно в овулировавшие яйцеклетки лабораторных мышей. В на-

153

Глава 5. 

Частота и спектр геномных и хромосомных мутаций

ших экспериментах проведена инъекция подвижных сперматозоидов 

от 10 пациентов с нарушением фертильности в ооциты мыши. Всего 

проанализировано  183  метафазные  пластинки  мужских  пронуклеу-

сов. Суммарная частота гипергаплоидии составила 5,71

 

%, гипогапло-

идии —  8,57

 

%.  Структурные  перестройки  были  единичны  (0,4

 

%)  и 

представлены маркерными, кольцевыми хромосомами и транслокаци-

ей. Таким образом, общая частота хромосомных аберраций в зрелых 

сперматозоидах у мужчин с нарушением фертильности составила око-

ло 14

 

% [193]. Эта величина несколько превышает таковую у здоровых 

мужчин (~ 10

 

%), определенную в условиях гетерологичного оплодо-

творения (см. выше). Интересно отметить, что в отличие от здоровых 

доноров, доминирующим типом хромосомных аберраций в спермато-

зоидах у пациентов с нарушением фертильности оказалась анеупло-

идия  (трисомии  и  моносомии).  Преобладание  анеуплоидии  в  наших 

исследованиях  отчасти  обусловлено  использованием  для  инъекций 

спермиев с аномальной морфологией головки (78 из 183), что косвенно 

указывает на их пониженную оплодотворяющую способность.

Таким  образом,  данные  различных  методов  исследования  свиде-

тельствуют о том, что у здоровых мужчин до 10

 

% сперматозоидов не-

сут хромосомную аномалию, причем структурные перестройки встре-

чаются чаще, чем численные.

5.1.2. оогенез

В отличие от сперматогенеза, где уже реальна объективная оценка 

частоты спонтанных хромосомных аберраций в зрелых гаметах, дан-

ные об их частоте в оогенезе пока ориентировочны. Прежде всего, это 

связано с тем, что полноценный цитогенетический анализ женских га-

мет возможен только в ооцитах на стадии метафазы II, полученных в 

условиях ЭКО. Кроме того, в этих исследованиях обычно используют 

яйцеклетки, непригодные для оплодотворения in vitro, уже имеющие 

признаки дегенерации. Наконец, для оценки частоты гетероплоидии в 

ооцитах иногда используют косвенный подход, основанный на резуль-

татах цитогенетического анализа 1-го или 2-го полярных телец.

Тем  не  менее,  в  настоящее  время  с  помощью  соответствующих 

методических  приемов  (см. 4.3)  получены  сведения  о  частоте  спон-

танных хромосомных аберраций и в оогенезе человека. В целом, они 

свидетельствуют о более высокой частоте нерасхождения хромосом в 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

154

процессе оогенеза по сравнению со сперматогенезом (см. выше). Бо-

лее того, данные сравнительной цитогенетики свидетельствуют о том, 

что у человека уровень спонтанной гетероплоидии в оогенезе сущест-

венно выше, чем у других млекопитающих [380].

5.1.2.1. Метафаза I

В доступной литературе мы не нашли данных о частоте спонтан-

ных хромосомных аберраций в метафазе 1-го мейотического деления 

ооцитов  человека.  Разработка  методов  визуализации  хромосом  1-го 

полярного тельца (см. 4.3.1) позволяет надеяться, что такая информа-

ция скоро будет получена [871].

5.1.2.2. Метафаза II

Большинство данных, касающихся анализа хромосом в оогенезе у 

человека, получено на препаратах ооцитов, не оплодотворившихся в 

культуре in vitro и блокированных на стадии метафазы второго деления 

мейоза (MII). Анализ данных литературы позволяет сделать вывод о 

высокой частоте и широком диапазоне различных типов хромосомных 

аномалий  в  ооцитах  человека  в  МII.  Так,  частота  ооцитов,  несущих 

одну  или  более  хромосомную  аберрацию,  в  разных  сериях  исследо-

ваний варьирует от 4

 

% [386] до 58

 

% [897]. Значительная вариабель-

ность полученных результатов может быть обусловлена как методами 

приготовления хромосомных препаратов, существенно влияющих на 

качество  метафазных  пластинок,  так  и  трудностями  идентификации 

и подсчета конденсированных хромосом. Нельзя не отметить и отсут-

ствие  унифицированного  подхода  к  отбору  ооцитов  и  метафазных 

пластинок для анализа.

Однако  результаты  многочисленных  зарубежных  исследований 

[302, 424, 574, 905], а также собственные данные [36, 37] свидетель-

ствуют о высоком уровне спонтанной анеуплоидии в ооцитах на ста-

дии  МII  и  подтверждают  тенденцию  к  ее  увеличению  с  возрастом 

женщины. Так, в наших исследованиях из 133 овулировавших ооцитов 

человека,  пригодных  для  цитогенетического  анализа  на  стадии  МII, 

30  оказались  анеуплоидными,  причем  частота  гипер-  и  гипогаплои-

дии была одинаковой (14 и 16 ооцитов соответственно), что косвенно 

свидетельствовало  об  адекватности  использованного  метода  приго-

товления хромосомных препаратов. В 19 случаях (63,3

 

%) в образова-

155

Глава 5. 

Частота и спектр геномных и хромосомных мутаций

нии анеуплоидных ооцитов принимали участие отдельные хроматиды 

(табл. 5.1). Не исключено, что их наличие обусловлено преждевремен-

ным разделением центромер или так называемым «предделением» [424], 

которое  встречается  на  этой  стадии  с  частотой  до  30

 

%  [574].  Так  как 

практически все исследования проведены на ооцитах с признаками де-

генерации, нельзя исключить, что преждевременное разделение центро-

мер было обусловлено именно этим обстоятельством [449], либо связано 

с методическими артефактами. Однако существование такого механизма 

нерасхождения хромосом в оогенезе доказано в прямых экспериментах на 

мышах в условиях применения окадаевой кислоты — препарата, вызыва-

ющего преждевременную спирализацию хромосом [55, 57].

Частота  диплоидных  ооцитов  в  нашем  исследовании  составила  9

 

% 

(табл. 5.1). При этом в 11 случаях 1-е полярное тельце отсутствовало, а в 

одном ооците с кариотипом 46,ХХ было обнаружено дегенерировавшее по-

лярное тельце, содержащее диплоидный набор хромосом, что доказывало 

его происхождение из тетраплоидного оогония. Диплоидные ооциты, воз-

никающие  из  тетраплоидных  оогониев  вследствие  нарушения  цитотомии 

или в результате слияния двух оогониев встречаются достаточно редко [52]. 

По-видимому, основной причиной образования диплоидных ооцитов являет-

ся блокада анафазы I, которая приводит к персистенции в ооплазме второго 

диплоидного набора хромосом.

Структурные аномалии хромосом обнаружены в 10 ооцитах, причем 

во всех случаях они сочетались с анеуплоидией (табл. 5.1). К сожалению, 

попытки идентифицировать структурные аберрации оказались безуспеш-

ными.

Эти наблюдения хорошо согласуются с результатами аналогичных 

исследований,  проведенных  в  Великобритании.  При  кариотипиро-

вании 1397 ооцитов на стадии МII в 151 (11

 

%), была выявлена анеу-

плоидия, причем более чем в половине случаев она была обусловлена 

преждевременным делением центромеры, результатом чего было по-

явление непарных (лишних) хроматид [614]. В этих же исследовани-

ях была четко установлена прямая корреляция частоты хромосомных 

аберраций  в  ооцитах  МII  с  возрастом  женщины.  У  женщин  моложе 

27 лет она составляла около 7,4

 

%, тогда как у женщин старше 39 лет 

достигала 39

 

% [603].

Таким образом, частота хромосомных аберраций, регистрируемая 

в оогенезе на стадии метафазы второго мейотического деления, очень