Цитогенетика эмбрионального развития - часть 20

Цитогенетика эмбрионального развития человека

156

Таблица 5.1. Результаты цитогенетического анализа ооцитов человека на стадии 

метафазы II, не оплодотворившихся в условиях культуры

Кариотип

Число 

ооцитов

Норма

23,Х

79

Гипергаплоидия (n  =  14)

26,X, + D, + E, + E, + Fcht, + Gcht

26,X, + C, + C, + G, + Ccht, + Ccht

26,X, + B, + C, + E

24,X, + C

24,X, + E

24,X, + G

24,X, + C, + Ccht

23,X, + Echt, + Echt

23,X, + Acht, + Acht

1

1

1

4

2

2

1

1

1

Гипогаплоидия (n  =  16)

19,?X,-C,-E,-F,-F

19,X,-D,-F,-G,-G

20,?X,-C,-E,-E

20,?X,-C,-D,-D, + Ccht

21,?X,-C,-E, + Gcht

21,?X,-C,-C, + Acht, + Acht, + Ccht

21,X,-D,-E

21,X,-F,-F

21,X,-D,-G

22,X,-A

22,?X,-C

22,X,-E, + Echt, + Echt

22,X,-G

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

4

Сочетания нуллисомий и 

дисомий (n  =  8)

30,X, + C, + C, + D, + D, + D, + E, + E,-F, + G

25,?X,-C,-C, + D, + D, + E, + E, + Echt, + Echt

24,X, + C, + D,-G, + Gcht

23,X, + D,-G, + Gcht

22,X,-A, + D, + D,-F,-G, + Acht, + Acht, + Acht

21,?X,-C,-C,-C, + D, + D,-E, + Echt, + Echt

21,X, + C,-D,-E,-E

20,X, + C,-E,-E,-E,-F

1

1

1

1

1

1

1

1

Структурные аномалии 

(n  =  10)

25,X, + D, + G, + mar1, + mar2, + mar3, + mar4, + m

ar5

25,X, + C, + D, + Fcht, + mar1, + mar2

24,X, + F, + Ccht, + mar1, + mar2

24,X, + derB

24,X, + A, + C,-E, + Echt, + Echt, + mar1

23,X, + Acht, + mar 1

22,?X,der(B),-C,-C, + D

21,X,-E,-F, + Echt, + Echt, + mar1, + mar2

19,?X,-C,-E,-G,-G, + mar1, + mar2, + mar3, + mar4

18,?X,-C,-D,-D,-F,-G, + mar1, + mar2

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

Полиплоидия (n  =  13)

46,XX

44~47<2n>,XX

85~93<4n>,XXXX

6

6

1

157

Глава 5. 

Частота и спектр геномных и хромосомных мутаций

высока  и  по  некоторым  данным  затрагивает  почти  половину  всех 

ооцитов, завершивших первое деление созревания. Их большая часть, 

по-видимому,  не  способна  дать  начало  жизнеспособному  потомству. 

Однако многие из них могут быть оплодотворены и завершают вто-

рое мейотическое деление. Следует подчеркнуть, что практически все 

исследования  проведены  на  яйцеклетках,  имеющих  признаки  деге-

нерации, а потому не использованных в программе ЭКО. Возможно, 

именно этим можно отчасти объяснить столь высокую частоту хромо-

сомных аберраций в метафазе II.

5.1.2.3. Завершение мейоза

Прямые данные о частоте спонтанных хромосомных аберраций в 

ооцитах, завершивших 2-е деление мейоза, могут быть получены толь-

ко после оплодотворения, когда происходит отделение 2-го полярного 

тельца (см. 4.3.2). При этом объектом исследования могут быть хромо-

сомы женского пронуклеуса на стадии метафазы 1-го деления дробле-

ния, либо хромосомы 2-го полярного тельца (ВПТ).

К сожалению, как показывает анализ литературы, прямые данные 

о частоте хромосомных аберраций в ооцитах человека, завершивших 

мейоз, до настоящего времени отсутствуют. Вместе с тем, при опреде-

лении родительского происхождения анеуплоидии у плодов человека и 

новорожденных с использованием цитогенетических и молекулярных 

маркеров установлено, что около 20

 

% случаев анеуплоидии обуслов-

лено  нерасхождением  хромосом  во  2-м  делении  созревания  ооцита 

[449].  Определенная  информация  на  эту  тему  может  быть  получена 

при  анализе  ВПТ.  Однако  трудности  визуализации  таких  хромосом 

на обычных цитогенетических препаратах значительно снижают цен-

ность подобных исследований (см. 4.3.2). В пилотных исследованиях с 

применением метода FISH было установлено, что частота анеуплоид-

ных ВПТ составляет около 25

 

% [715, 725]. В какой мере эта величина 

отражает истинную частоту нерасхождения хромосом во 2-м делении 

созревания и суммарную частоту спонтанных хромосомных аберраций 

в оогенезе остается неизвестным.

Следует  подчеркнуть,  что  для  корректной  оценки  истинной  час-

тоты  аномальной  сегрегации  хромосом  в  оогенезе  требуются  одно-

временные исследования хромосомного набора в ооците и полярных 

тельцах. В экспериментах на ооцитах китайских хомячков показано, 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

158

что  при  запаздывании  хромосом  в  анафазе  гипогаплоидными  могут 

оказаться как полярное тельце, так и ооцит [628]. Исследования по-

добного рода на ооцитах человека единичны и ограничены FISH-ана-

лизом отдельных хромосом [725]. Однако возможности метода FISH 

с использованием хромосомспецифических ДНК-зондов ограничены 

анализом отдельных хромосом. Следовательно, многие анеуплоидии 

и практически все структурные аберрации, возникшие de novo, не ре-

гистрируются, что приводит к занижению реальной частоты возник-

новения хромосомных аберраций. Можно надеяться, что более точную 

информацию о частоте спонтанных хромосомных аномалий в оогене-

зе человека удастся получить с помощью разработанных в настоящее 

время  новых  подходов  к  цитогенетическому  анализу  2-го  полярного 

тельца (см. раздел 4.3.2) [415, 874].

Таким  образом,  частота  спонтанных  хромосомных  аберраций  в 

оогенезе человека изучена недостаточно. Имеются ориентировочные 

данные о ее необычно большой величине (до 50

 

%) в метафазе II мей-

оза и до 25

 

% после завершения мейоза. Однако, учитывая труднодо-

ступность материала, высокую частоту артефактов при приготовлении 

препаратов и анализе единичных метафазных пластинок, а также не-

совершенство методов хромосомного анализа, эти данные следует рас-

сматривать как предварительные.

5.2. Хромосомные аномалии в эмбриогенезе

Сравнительный анализ хромосомных аберраций у человека на раз-

ных этапах онтогенеза однозначно свидетельствует о существовании 

прямой зависимости их частоты от стадии развития. Такая динамика 

очевидна при сопоставлении результатов цитогенетических исследо-

ваний  спонтанных  абортусов  и  новорожденных  (70  и  0,5

 

%  соответ-

ственно). За последние годы, благодаря внедрению в практику методов 

пренатальной диагностики, накоплен обширный материал, анализ ко-

торого позволит представить более реальную картину частоты хромо-

сомных аберраций у человека.

5.2.1. доимплантационные стадии развития

Частота  спонтанных  хромосомных  аномалий  у  эмбрионов  человека 

доимплантационного периода (1–6-й дни развития, см. раздел 1.3) доста-

точно велика и варьирует от 5

 

% [220] до 100

 

% [654]. При этом среди мор-

159

Глава 5. 

Частота и спектр геномных и хромосомных мутаций

фологически неполноценных эмбрионов гетероплоидия достигает 86,6

 

% 

[704]. Прослеживается заметная зависимость гетероплоидии от возрас-

та матери. У 20–34-летних женщин частота гетероплоидных эмбрионов  

с нормальной морфологией составляет 16

 

%, у 35–39-летних — 37

 

%, а  

у 40–45-летних — 53

 

% [719]. Некоторое увеличение частоты гетеропло-

идии (53–54

 

%) отмечается при привычном невынашивании [244]. Нема-

ловажно, что при ICSI (инъекция сперматозоида или сперматиды в ци-

топлазму яйцеклетки) частота гетероплоидных эмбрионов также может 

возрастать, что, по-видимому, обусловлено увеличением частоты дипло-

идных мужских гамет при олигозооспермии [654].

Опубликованные  данные  свидетельствуют  о  высокой  частоте  гете-

роплоидии у ранних зародышей человека. Однако в большинстве случаев 

гетероплоидия на стадии 8–12 клеток представлена мозаичной формой, 

что,  возможно,  является  особенностью  нормального  эмбриогенеза  че-

ловека (см. ниже). Следует также отметить, что аномальные эмбрионы,  

в том числе и гетероплоидные, могут оказаться не способными к разви-

тию после трансплантации и погибнуть до или в процессе имплантации 

(средняя частота имплантации в программе ЭКО ~ 25–40

 

%).

Наиболее  обстоятельные  исследования  кариотипа  у  доимпланта-

ционных зародышей человека с применением традиционных методов 

хромосомного анализа выполнены на 816 дробящихся зародышах [521] 

и 447 зародышах на стадии бластоцисты [342]. В первом исследовании 

прокариотипировано 195 зародышей (23,9

 

%) и определена плоидность 

у 325 (39,8

 

%), во втором — у 182 зародышей (40,7

 

%) и установлена 

плоидность у 304 (68

 

%).

Суммируя имеющиеся данные, следует отметить необычно высо-

кую по сравнению с другими млекопитающими [56] частоту (40–60

 

%) 

геномных мутаций [331, 340]. При этом в зависимости от кариотипа 

все доимплантационные зародыши человека можно подразделить на 

5 типов: 1) полиплоидные, 2) эуплоидные, 3) гетероплоидные (полная 

форма), 4) мозаичные гетероплоидные, 5) неопределенные (бластоме-

ры отличаются по числу и набору хромосом).

5.2.1.1. Полиплоидия

Большая часть аномалий кариотипа в период дробления связана с 

нарушениями плоидности. Триплоидия как следствие диспермии явля-

ется наиболее частой патологией оплодотворения в условиях in vitro и 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

160

регистрируется по наличию трех пронуклеусов в зиготе [654]. В случа-

ях, когда наличие и число полярных телец, а также пронуклеусов вы-

зывает сомнения, невозможно отличить диспермию (3 пронуклеуса  +  2 

полярных  тельца)  от  дигинии  (3  пронуклеуса  +   1 полярное  тельце) 

[703].  Триплоидные  зиготы  непосредственно  после  первого  деления 

дробления, как правило, образуют три и более клеток, и реже — две 

[551]. В дальнейшем 3-клеточные эмбрионы чаще образуют мозаич-

ные формы полиплоидии, чем 2- или 4-клеточные [654]. Происхожде-

ние триплоидии также определяет судьбу дробящегося зародыша. Так, 

можно считать доказанным, что у дигинетических триплоидов хромо-

сомы всех трех пронуклеусов образуют единое двухполюсное веретено 

и имеют одну активную центросому [654]. У диспермных триплоидов 

первое  митотическое  деление  осуществляется,  по-видимому,  путем 

образования  трехполюсного  веретена  [358].  В  дальнейшем  аномаль-

ная  сегрегация  хромосом  может  приводить  к  истинной  триплоидии 

либо к формированию моза-

иков  (рис. 5.1).  Мозаицизм 

(1n/2n,  2n/3n)  может  быть 

также  обусловлен  асинх-

ронностью  формирования 

пронуклеусов  и  ошибками 

репликации  ДНК  в  первом 

митотическом  цикле  [377, 

378,  455].  Частота  трипло-

идных зародышей на ранних 

стадиях дробления [521], на 

стадии бластоцисты [342] и 

в  биоптатах  ворсин  хорио-

на  первого  триместра  [155, 

344] примерно совпадает и составляет в среднем около 2,5

 

%. Эти на-

блюдения указывают на отсутствие селекции против триплоидных за-

родышей.

Другой формой полиплоидии у зародышей человека является тет-

раплоидия, которая встречается в единичных случаях вплоть до стадии 

бластоцисты. Форма тетраплоидии (истинная или мозаичная 2n/4n и, 

возможно, 1n/4n и 3n/4n) остается неизвестной. Не вызывает, однако, 

сомнения, что истинно тетраплоидные зародыши, если и возникают, 

Рис.  5.1.  Мозаичная  бластоциста,  возник-

шая  из  3-пронуклеарной  зиготы.  FISH  с 

прицентромерным зондом D18Z1

161

Глава 5. 

Частота и спектр геномных и хромосомных мутаций

то подвергаются элиминации уже во время имплантации, о чем сви-

детельствуют многочисленные данные по кариотипированию зароды-

шей в I триместре беременности [151, 155, 344, 871].

Характерным для зародышей человека на стадии бластоцисты явля-

ется появление большого числа (30–40

 

%) диплоидно-тетраплоидных 

мозаиков [342]. Высказано предположение, что мозаицизм 2n/4n отра-

жает процесс полиплоидизации в клетках трофобласта, предшествую-

щий его активной инвазии клеток эндометрия в период имплантации 

зародыша в стенку матки [68].

Появление  гаплоидных  бластомеров  может  быть  вызвано  редук-

ционным делением диплоидного ядра [455]. Единичные гаплоидные 

зародыши зарегистрированы только в период дробления (8–10 бласто-

меров) и не встречаются на стадии бластоцисты [342], что свидетель-

ствует об их элиминации еще в доимплантационном периоде.

5.2.1.2. Анеуплоидия

Зародыши с дефицитом (моносомия) или избытком (трисомия) от-

дельных хромосом возникают, главным образом, вследствие оплодо-

творения  яйцеклетки  с  хромосомным  дисбалансом.  Этот  вывод  ос-

нован на сопоставлении общей частоты анеуплоидии и анеуплоидии 

по различным аутосомам в ооцитах и у дробящихся зародышей [654]. 

Вместе с тем, сведения о частоте анеуплоидных зародышей противоре-

чивы. Так, по некоторым данным [521], на ранних стадиях дробления 

частота анеуплоидии составляет 20

 

%, однако, может достигать 40

 

%, а 

с учетом мозаичных вариантов — даже 80

 

% [653].

Предполагают, что такие «качества» эмбриона как скорость дробле-

ния, степень фрагментации, наличие многоядерных бластомеров, дис-

социации их размеров могут отражать его хромосомный статус. Так, 

до  89

 

%  зародышей  с  высокой  степенью  фрагментации  оказываются 

мозаичными,  и  около  71

 

%  эмбрионов,  остановившихся  в  развитии 

на стадии нескольких бластомеров, обнаруживают хромосомные ано-

малии  [654].  При  этом  и  у  морфологически  нормальных  зародышей 

частота  анеуплоидных  бластомеров  достаточно  высока  и  составляет 

около 20

 

% [449].

Значительная часть (до 11

 

%) анеуплоидов представлена моносоми-

ей хромосом, в основном, моносомией Х [521]. Согласно результатам 

другой  обстоятельной  работы  [342],  частота  анеуплоидии  на  стадии 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

162

бластоцисты составляет только 3,3

 

%, где она представлена различны-

ми аутосомными трисомиями. Исключительную редкость моносомии 

аутосом на стадии бластоцисты отмечали и другие авторы, использо-

вавшие для анализа метод FISH [359].

Необходимо,  однако,  отметить,  что  сравнительно  недавно  появи-

лась серия публикаций, в которых была проведена идентификация ане-

уплоидии в материале спонтанных абортусов I триместра беременнос-

ти, культура клеток которых характеризовалась плохим ростом [100, 

114, 139]. Использованные в этих исследованиях метод FISH c набором 

меченых центромерспецифических ДНК-проб и метод сравнительной 

геномной гибридизации (comparative genome hibridization CGH — гиб-

ридизации ДНК абортуса на препаратах метафазных хромосом с нор-

мальным кариотипом) позволяли судить о кариотипе зародыша даже в 

культурах клеток с очень низкой пролиферативной активностью [167]. 

Было установлено, что у 19

 

% абортусов с признаками анэмбрионии 

(наличие оболочек при отсутствии собственно тканей эмбриона) име-

ла место моносомия хромосом 7, 15, 21 и 22.

Таким образом, есть основания считать, что моносомия большин ства 

аутосом несовместима с формированием бластоцисты, и такие эмбрионы 

погибают до имплантации. Вместе с тем, моносомия, по крайней мере, 

некоторых аутосом совместима с имплантацией и развитием провизор-

ных органов, однако развитие тканей самого эмбриона прекращается уже 

во время имплантации или вскоре после нее (см. раздел 5.2.2). 

В отличие от аутосомных моносомий, общая частота трисомии 

аутосом на стадии бластоцисты (5–7

 

%) оказалась примерно такой же, 

как и среди эмбрионов, кариотипированных по клеткам биоптатов хо-

риона (10–13-я недели беременности) [155, 341, 344, 727]. Любопытно, 

что на стадии бластоцисты зарегистрированы только 4 типа трисомии 

(4, 6, 9 и 22), что, по всей вероятности, связано с недостаточностью вы-

борки [342]. По-видимому, большинство типов аутосомных трисомий 

у человека совместимо с развитием до стадии бластоцисты и такие за-

родыши сохраняют способность к имплантации (см. главу 8).

5.2.1.3. Мозаичная гетероплоидия

Мозаичная  гетероплоидия  является  еще  одной  особенностью  до-

имплантационных  зародышей  человека.  При  этом  число  гетеропло-

идных бластомеров может варьировать от нескольких клеток до поло-

163

Глава 5. 

Частота и спектр геномных и хромосомных мутаций

вины всего эмбриона [388]. Экстраполируя результаты исследования 

анеу плоидии по хромосомам X, Y, 13, 18, 21, общая частота которой у 

морфологически нормальных эмбрионов на стадии 8 клеток с тремя и 

более аномальными бластомерами составляет 38–46

 

% на весь набор, 

можно ожидать, что частота мозаичных эмбрионов составит до 80

 

% 

[388]. Если это предположение подтвердится при дальнейших иссле-

дованиях, то хромосомный мозаицизм до 10–12-клеточной стадии, по 

всей видимости, отражает особенности нормального развития зароды-

ша человека. В таком случае, мозаики, регистрируемые на более позд-

них  стадиях  эмбрионального  развития  и  в  постнатальном  периоде, 

представляют интерес для поиска генов, мутации в которых приводят 

к утрате контроля за правильной сегрегацией митотических хромосом 

при делении бластомеров.

Таким образом, многие вопросы возникновения спонтанных хро-

мосомных  аберраций  и  их  влияния  на  раннее  развитие  человека  до 

настоящего времени остаются нерешенными и требуют дальнейшего 

изучения. Вместе с тем, анализ уже имеющихся данных указывает на 

необычно высокую частоту гетероплоидии у дробящихся зародышей 

человека, которая может достигать 40–60

 

%; триплоидия является наи-

более  частым  вариантом  полиплоидии;  высокая  частота  диплоидно-

тетраплоидного  мозаицизма  на  стадии  ранней  бластоцисты,  по  всей 

вероятности, отражает естественный процесс полиплоидизации клеток 

трофобласта; характерной чертой для доимплантационных зародышей 

человека  является  высокая  частота  диплоидно/анеуплоидного  вари-

анта мозаицизма, биологический смысл которого не ясен; зародыши 

человека с моносомией любой из аутосом подвергаются элиминации в 

доимплантационном периоде, зародыши с моносомией Х и трисомией 

аутосом завершают дробление, формируют бластоцисту и сохраняют 

способность к имплантации.

5.2.2. Постимплантационные стадии развития

Для  анализа  хромосомных  аберраций  на  постимплантационных 

стадиях эмбриогенеза человека используется материал спонтанных и 

медицинских абортусов, а также биоптаты хориона, полученные с це-

лью пренатальной диагностики при прогрессирующей беременности. 

Естественно, что сведения о частоте и спектре хромосомных аберра-

ций, выявленных на таких образцах, сильно различаются.