Цитогенетика эмбрионального развития - часть 18

Цитогенетика эмбрионального развития человека

140

С  повышением  разрешающей  способности  ультразвуковых  ап-

паратов появились возможности получения АЖ в 9–14 недель бере-

менности.  Учитывая  небольшой  общий  объем  АЖ  и  малое  число 

жизнеспособных  КАЖ,  ранний  амниоцентез  для  кариотипирования 

плода используется редко [25]. С целью увеличения КАЖ предложен 

метод  амниофильтрации,  при  котором  из  образца  АЖ  в  I  триместре 

беременности извлекают только клетки, а саму АЖ возвращают в ам-

ниотическую полость [426]. Однако невысокая эффективность цитоге-

нетической  диагностики  ранних  амниоцитов  (70–95

 

%)  при  высоком 

риске  отдаленных  негативных  последствий  раннего  амниоцентеза,  в 

частности, маловодия, заставляют с осторожностью относиться к его 

внедрению в клиническую практику [477].

Как  уже  отмечалось,  состав  КАЖ  очень  полиморфный.  Точная 

идентификация  типов  клеток,  дающих  клональный  рост,  весьма  за-

труднена (рис. 4.18). Оптимальным для цитогенетических исследова-

ний является амниотический эпителий — активно пролиферирующий 

клон клеток, специфический для данной культуры [67].

Несмотря на широкое использование культур КАЖ, не существу-

ет единой методики для получения из них хромосомных препаратов. 

Стандартное культивирование КАЖ включает следующие этапы: пос-

тановку культуры, субкультивирование, гипотоническую обработку и 

фиксацию. Для анализа культивированных КАЖ используют два ос-

новных подхода [749]:

Flask-метод — культивирование  клеток  во  флаконах  и  фиксация 

суспензии монослойной культуры после трипсинизации. Анализ про-

водят в двух из трех культур (по 10 метафаз для каждого образца). Если 

во всех метафазах наблюдается одинаковый кариотип, диагноз счита-

ется  установленным.  В  случае  обнаружения  единичной  метафазы  с 

аберрантным кариотипом (числовым или структурным), анализирует-

ся резервная третья культура. Если одна и та же хромосомная абер-

рация  определяется  в  более  чем  одной  метафазе  из  одного  флакона, 

но не подтверждается в остальных флаконах, устанавливается диагноз 

«псевдомозаицизм». В случае обнаружения одной и той же хромосом-

ной  аномалии  в  более  чем  одном  флаконе,  устанавливается  диагноз 

«истинный мозаицизм».

Метод  in situ  —  культивирование  и  фиксация  клеток  на  покров-

141

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

ных  стеклах  в  чашках  Петри  или  в  специальных  флаконах-слайдах 

(рис. 4.19). Анализ проводят на метафазных пластинках из трех куль-

туральных чашек или флаконов (всего анализируют 10 колоний). При 

выявлении аномального клона анализируют все культуры. Хромосом-

ная аберрация, найденная лишь в одном культуральном флаконе/чаш-

ке, свидетельствует о «псевдомозаицизме», в более чем одном — об 

истинном мозаицизме.

Эти методы требуют культивирования с несколькими пассажами и за-

нимают в среднем 2–3 недели. К недостаткам можно отнести высокую 

стоимость культуральных питательных сред и оборудования, что немало-

важно  для  отечественных  лабора-

торий, а также высокую (до 2

 

%) ве-

роятность ошибочного заключения 

о кариотипе плода вслед ствие кон-

таминации образца клетками мате-

ринского происхождения [290].

В  последние  годы  разработан 

принципиально  новый  подход  к 

анализу  хромосом  из  культиви-

рованных клеток. Метод «pipett» 

основан  на  микроманипуляцион-

ной изоляции метафазных и про-

 

а)  

б)

Рис.4.18.  Первичные  культуры  клеток  амниотической  жидкости  (фазовый  конт-

раст): а — единичные прикрепившиеся клетки (первые сутки культивирования); б — 

колония клеток (пятые сутки культивирования)

Рис.4.19. Фрагмент колонии амниоцитов 

с  метафазными  пластинками  (метод 

фиксации in situ). Окраска по Гимза (10×)

Цитогенетика эмбрионального развития человека

142

метафазных клеток из несуспензионных культур благодаря их морфо-

логическим особенностям и ослаблению связи с субстратом [34, 313, 

739]. Дальнейшая гипотоническая обработка и фиксация проводятся с 

единичными клетками. Этот способ позволяет сократить период куль-

тивирования до нескольких дней и, что особенно существенно, сни-

зить риск диагностических ошибок, обусловленных как мозаицизмом, 

так и контаминацией образца. Получение прометафазных и метафаз-

ных пластинок таким способом возможно из любых первичных и пе-

ревиваемых культур [166]. К сожалению, дорогостоящее оборудование 

и трудоемкость препятствуют широкому внедрению этого прогрессив-

ного метода в клиническую практику.

Неудачи кариотипирования по КАЖ во многом обусловлены качест-

вом  реактивов  (питательные  среды,  сыворотки,  стимуляторы  роста 

клеток) и недостатком опыта работы по культивированию вялорасту-

щих клеток [67].

Следует также отметить, что в случае беременности плодом жен-

ского пола при наличии только культур КАЖ невозможно установить 

число ошибочных диагнозов, обусловленных контаминацией материн-

скими клетками. Обычно частота таких ошибок при культивировании 

КАЖ составляет 0,16

 

%, а при при культивировании клеток ворсин хо-

риона она может достигать 0,4

 

% [334, 896].

Учитывая  высокую  эффективность  кариотипирования  плода  на 

прямых препаратах из ворсин хориона или плаценты (99,4

 

%), мы счи-

таем неоправданным использование КАЖ в качестве единственно воз-

можного образца плодного материала для цитогенетического анализа. 

Отсутствие в России специальных питательных сред для культивиро-

вания  клеток  хориона  (плаценты)  является  серьезным  препятствием 

для кариотипирования плода по КАЖ в отечественных диагностичес-

ких центрах.

В настоящее время препараты некультивированных КАЖ исполь-

зуются для получения детальной информации о кариотипе плода мето-

дом FISH при верификации гетероплоидии, установленной по клеткам 

другого  происхождения  (хорион/плацента,  лимфоциты  пуповинной 

крови) (рис. 4.20).

Важное применение КАЖ находят в настоящее время для диагнос-

тики наиболее частых хромосомных болезней методом количествен-

143

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

ной  флуоресцентной  полимераз-

ной цепной реакции — Quantitative 

Fluorescent PCR (QF-PCR) (см. гла-

ву 9).

4.5.3. лимфоциты 

пуповинной крови плода

Попытки получения крови пло-

да  во  время  беременности  были 

впервые предприняты с целью диа-

гностики  гемоглобинопатий,  при 

этом кровь плода получали при по-

мощи множественных пункций плаценты [537]. Однако высокая (10

 

%) 

частота гибели плода, а также неизбежная контаминация материнской 

кровью не позволяли рекомендовать такой способ для пренатальной 

диагностики. После разработки методики получения крови при пун-

кции пуповины под ультразвуковым контролем [346] проблема иссле-

дования крови у плода была практически решена. При кордоцентезе 

извлекается обычно не более 3 мл крови, что составляет около 10

 

% от 

ее общего фетоплацентарного объема во II триместре беременности. 

Кордоцентез выполняют, начиная с 18–19-й недели как в диагности-

ческих целях [87, 707, 848], так и для внутриутробного лечения гемо-

литической болезни [112].

Одной  из  проблем  пренатальной  цитогенетической  диагностики 

лимфоцитов является контаминация образца амниотической жидкос-

тью или материнской кровью. В последнем случае возможны серьез-

ные  диагностические  ошибки.  Решение  этой  проблемы  относится  к 

технике проведения кордоцентеза. Разработанная в НИИ акушерства и 

гинекологии им. Д. О. Отта РАМН 2-игольная методика пункции вены 

пуповины на ее свободном участке [112] позволяет получать образцы 

крови плода без примесей. Контроль за чистотой образца проводится 

в соответствии с методиками, основанными на отличиях фетального 

гемоглобина от гемоглобина взрослых эритроцитов [65, 234].

Для хромосомного анализа крови плода используют стандартную 

методику стимулирования лимфоцитов фитогемагглютинином (ФГА). 

Использованные нами варианты культивирования лимфоцитов пупо-

Рис.4.20.  FISH  с  ДНК-зондом  D18Z1 

на  препаратах  некультивированных 

амнио цитов

Цитогенетика эмбрионального развития человека

144

винной крови [16, 192] позволили провести успешную цитогенетичес-

кую диагностику в 99,8

 

% случаев. Единичные неудачи при культиви-

ровании обычно обусловлены гемолизом эритроцитов, полученных от 

плодов с тяжелой формой гемолитической болезни.

Таким  образом,  лимфоциты,  имеющие  исключительно  плодное 

происхождение,  дают  наиболее  адекватное  представление  о  хромо-

сомном статусе плода. Поэтому кордоцентез может быть рекомендован 

для уточнения кариотипа плода при обнаружении хромосомного моза-

ицизма в плаценте, а также как основной способ получения материала 

при наличии пороков развития у плода не только во II, но как показы-

вает наш опыт, и в III триместре беременности (см. главу 9).

4.6. Принципы изучения генеза хромосомных 

аномалий в постимплантационном

 и постнатальном периодах онтогенеза

Регистрация генных, хромосомных и геномных мутаций в постна-

тальном периоде развития человека обычно ограничена исследовани-

ем образцов периферической крови.

Разработанный  еще  в  1960  году  [310]  метод  приготовления  пре-

паратов из ФГА-стимулированных лимфоцитов является основным в 

клинической  цитогенетике.  Как  правило,  для  кариотипирования  ис-

пользуют дифференциальные GTG и CBG окраски. В некоторых ла-

бораториях предпочитают Q- или R-окрашивание. Гораздо реже при-

меняются  специальные  методы  (анализ  прометафазных  хромосом, 

репликационные  варианты  дифференциальной  окраски,  выявление 

ЯОР и др.). Широкую популярность завоевал метод FISH, особенно 

M-FISH, который используется, в основном, для идентификации мар-

керных хромосом и структурных аберраций. Благодаря развитию этого 

метода возникло новое направление исследований — интерфазная ци-

тогенетика,  достижения  которой  могут  быть  использованы  в  клини-

ческой практике для установления формы гетероплоидии (мозаичной 

или полной) с использованием образцов других тканей (буккальный 

эпителий, фибробласты кожи, ткани гонад и т. д.). Другие молекуляр-

но-цитогенетические методы (PRINS, CGH, SKY и их разновидности) 

имеют более ограниченное применение и используются, в основном, 

при идентификации структурных аберраций [167].

145

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

Разработанная недавно технология, позволяющая получить библи-

отеку  ДНК  из  материала  трудно  идентифицируемого  хромосомного 

фрагмента путем его микродиссекции непосредственно на хромосом-

ном препарате, является одним из наиболее информативных и эконо-

мичных методов для установления природы хромосомной перестрой-

ки. Мечение такой ДНК с последующей гибридизацией на контроль-

ных хромосомных препаратах позволяет практически во всех случаях 

провести точную идентификацию аберрантной хромосомы и даже оце-

нить связана ли конкретная перестройка с потерей или приобретением 

дополнительного хромосомного материала [167].

Комплекс  методов  ДНК-анализа  (PCR,  блот-гибридизация,  SSCP, 

анализ  гетеродуплексов  и  др.)  применяют  не  только  для  детекции 

генных мутаций, но и для детального исследования аномального ка-

риотипа  и  установления  механизмов  возникновения  хромосомных 

аберраций.  В  частности,  на  основе  изучения  полиморфных  локусов 

ДНК подтверждены цитогенетические наблюдения о высокой часто-

те возникновения анеуплоидии в оогенезе, показана решающая роль 

аномальной мейотической рекомбинации в нерасхождении хромосом 

(см. главу 3).

Основные принципы и методические подходы, разработанные для 

анализа механизмов возникновения мутаций с использованием образ-

цов биоматериала от индивидов в постнатальном периоде, приемлемы 

и для исследований с использованием материала плодного происхож-

дения.  С  учетом  специфики  получения  плодного  материала  следует 

отметить, что в качестве материала для метода PCR, как нами было 

показано ранее [156, 513], могут быть использованы соскобы фикси-

рованных клеток хориона с препаратов, ранее использовавшихся для 

цитогенетической диагностики.

Кратко рассмотрим методические подходы, используемые для ус-

тановления происхождения гетероплоидии и структурных аберраций 

хромосом у постимплантационных зародышей. Следует подчеркнуть, 

что  изучение  механизмов  возникновения  хромосомных  аберраций, 

регистрируемых до или после рождения, носит ретроспективный ха-

рактер.  Методология  таких  исследований  основана  на  установлении 

характера  мутации  (геномная,  хромосомная),  ее  формы  (полная,  мо-

заичная)  и  определении  стадии  возникновения.  Если  для  идентифи-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

146

кации мутации используется доступный биологический материал, то 

выяснение происхождения хромосомной аномалии неизбежно влечет 

цитогенетическое и молекулярно-генетическое исследование образцов 

биоматериала от его родителей.

4.6.1. Происхождение гетероплоидии

Выяснение генеза добавочных хромосом при трисомии и триплои-

дии, а также конкретизация стадии мейоза или митоза, на которой про-

изошло нерасхождение гомологов, основано на сравнительном анализе 

структурного  гетерохроматина  и  ДНК-полиморфизмов.  Если  первые 

исследования по установлению родительской принадлежности экстра-

хромосом были проведены исключительно цитогенетическими мето-

дами, то использование ДНК-маркеров соответствующей хромосомы 

открыло новые возможности для анализа механизмов мейотического 

нерасхождения, связанных с аномальной рекомбинацией [318].

Молекулярному анализу к настоящему времени подвергнуто более 

1000 случаев различных трисомий. Наиболее полно (более 750 инфор-

мативных случаев) изучена трисомия 21 [638, 676]. Доминирует мате-

ринское происхождение, составляя 90–95

 

%, однако не во всех случаях 

удалось установить стадию мейоза, когда произошло нерасхождение. 

Это было обусловлено отсутствием прицентромерного полиморфизма, 

специфичного для хромосомы 21.

Полученные  результаты  подтверждают  возможность  использов 

ания ПЦР-анализа коротких тандемных повторов (КТП) для изучения 

нерасхождения хромосом. Однако вопреки ожиданиям, его эффектив-

ность  оказалась  не  очень  высокой.  Очевидно,  что  увеличение  числа 

тест-систем  на  основе  КТП,  локализованных  в  различных  районах 

изучаемых хромосом, позволит решить проблему установления роди-

тельской принадлежности дополнительных хромосом набора, а также 

позволит  учесть  частоту  рекомбинации.  При  интерпретации  резуль-

татов ПЦР-анализа необходимо учитывать удаленность тестируемых 

КТП от центромерного района (табл. 4.3). Комбинированный ПЦР и 

цитогенетический анализ, при котором регистрируется полиморфизм 

по коротким плечам акроцентриков (рис. 4.21), в которых рекомбина-

ция  происходит  относительно  редко,  представляется  наиболее  перс-

пективным для установления механизма возникновения наиболее рас-

147

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

Таблица 4.3. Принципиальный подход к установлению стадии нерасхождения хромо-

сом с использованием ДНК-полиморфизма [514]

пространенных трисомий 21 и 13. Как уже упоминалось (см. выше), 

в настоящее время разработаны удобные молекулярные тест-системы 

для пренатальной диагностики частых анеуплоидий методом QF-PCR. 

С  этой  целью  используются  наборы  высокополиморфных  ДНК-мар-

керов на хромосомы 13, 18, 21 и Х (в среднем по 3–4 маркера на хро-

мосому).  В  качестве  маркеров  служат  трех-  и  четырехнуклеотидные 

тандемные повторы с высоким уровнем вариабельности. С помощью 

автоматического секвенатора ABI-300 удается не только выявить нали-

чие лишней хромосомы, но также определить ее родительское проис-

хождение и выяснить стадию мейоза, на которой произошло нерасхож-

дение (см. главу 9).

Рис.4.21. Использование структурного полиморфизма коротких плеч хромосом груп-

пы G для установления происхождения добавочных хромосом в клетках цитотро-

фобласта хориона при анэмбрионии (кариотип плода 48,XY, + 21 (mat), + 22 (pat))

Деление

Статус полиморфизма

Центромерный

Проксимальный

Дистальный

Первое деление мейоза

 

– Отсутствие 

кроссинговера

– Кроссинговер

Гетерозиготный

Гетерозиготный

Гетерозиготный

Гетерозиготный

Гетерозиготный

Гетерозиготный

Второе деление мейоза

Гомозиготный

Гомозиготный

Гетерозиготный

Дробление зиготы

Гомозиготный

Гомозиготный

Гомозиготный