Цитогенетика эмбрионального развития - часть 17

Цитогенетика эмбрионального развития человека

132

4.5.1.1. Культивирование клеток хориона

Способность клеток ворсинчатого хориона к пролиферации в ус-

ловиях  культуры  сделала  их  привлекательными  для  пренатальной 

диагностики  хромосомных  болезней.  Однако  вопрос  происхожде-

ния клеток, образующих клоны, долгое время оставался открытым. 

В  настоящее  время  установлено,  что  клетки,  делящиеся  in vitro  в 

условиях перевиваемых культур, представляют собой фибробласты 

мезенхимной стромы ворсины [667].

Существует большое число модификаций культивирования кле-

ток ворсин хориона (КВХ). Подробнее ознакомиться с ними можно 

в соответствующей литературе [67, 391, 765, 875]. Отметим лишь, 

что растущие первичные культуры имеют гетерогенный клеточный 

состав с преимущественным ростом фибробластоподобных клеток. 

Образование  колоний  или  рыхлого  монослоя  происходит  обыч-

но  только  к  10–12-му  дню  культивирования.  Основные  принципы 

анализа культур КВХ и интерпретации результатов аналогичны для 

культур КАЖ [749].

4.5.1.2. «Прямые» препараты

Метод анализа «прямых» препаратов базируется на исследова-

нии спонтанно делящихся клеток цитотрофобласта без их предва-

рительного  культивирования.  Впервые  препараты  из  ворсинчатой 

ткани  хориона,  содержащие  метафазные  пластинки  удовлетвори-

тельного  качества,  без  использования  культуры  клеток  были  по-

лучены группой миланских исследователей [391]. В последующие 

годы  были  предложены  различные  модификации  метода,  которые 

затрагивают все этапы обработки ворсин. По существу все вариан-

ты метода можно подразделить на два.

1.  Собственно  «прямой»,  основанный  на  кратковременной  (2–3 

часа) преинкубации нативных ворсин перед гипотонической обработ-

кой и фиксацией [790, 835, 867].

2.  «Полупрямой»,  предполагающий  увеличение  времени  инкуба-

ции нативных ворсин в культуральной среде с питательными добавка-

ми до 24, 48 или 72 часов [726, 790].

Несмотря на кажущуюся простоту, этими способами многим иссле-

дователям не удается достичь стабильных результатов и потому они, 

133

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

как правило, используются в сочетании с долгосрочным культивиро-

ванием [391, 790]. Типичными недостатками прямого метода являются 

малое число метафазных пластинок, артефактная утрата хромосом при 

мацерации ткани в уксусной кислоте и малая пригодность хромосом 

для стандартной дифференциальной окраски красителем Гимза. Под-

счет числа митозов на прямых и «полупрямых» препаратах показал, 

что при инкубации ворсин в течение 2–3 суток митотическая актив-

ность клеток цитотрофобласта выше, чем при 2- или 24-часовой ин-

кубации [790]. Предполагается, что в момент биопсии клетки испыты-

вают «шок», при котором нарушаются параметры клеточного цикла, и 

клетки не вступают в митоз [542].

В нашей лаборатории разработаны собственные модификации пря-

мого метода — метод «стряхивания — отпечатывания» [9] и ускорен-

ный прямой метод [184, 195]. Ускоренный прямой метод предполагает 

применение больших доз колхицина с одновременной обработкой в ги-

потоническом растворе. Ранее было показано, что проникновение кол-

хицина через хорион-аллантоидную плаценту затруднено вслед ствие 

защитных  функций  синцитиотрофобласта  [56].  Возможно,  увеличе-

ние  дозы  колхицина  и  применение  гипотонической  обработки  сразу 

после получения образца способствуют преодолению плацентарного 

барьера  и  препятствуют  развитию  клеточного  шока.  Существенным 

является  и  размягчение  образца  непосредственно  на  препарате,  что 

минимизирует  потери  материала.  Применение  мягкой  фиксации  и 

последующая  гидратация  фиксированного  материала  благоприятно 

сказываются на морфологии хромосом и позволяют применять любые 

методы дифференциальной окраски, включая метод FISH (рис. 4.15). 

Следует подчеркнуть, что эта модификация пригодна для приготовле-

ния препаратов хромосом из тканей с высокой естественной митоти-

ческой активностью, включая любые эмбриональные ткани и органы. 

Интерфазные ядра, обработанные таким способом, вполне пригодны 

для  FISH-анализа  со  специфическими  ДНК-зондами,  что  важно  при 

верификации  цитогенетического  пренатального  диагноза.  Детально 

методики приготовления препаратов и вариантов дифференциальной 

окраски описаны нами ранее [16, 192].

При оценке результативности цитогенетического анализа следует 

руководствоваться критериями МЗ РФ [92] и требованиями, приняты-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

134

ми в международной цитогенетической практике [408, 547]. Согласно 

этим документам заключение о кариотипе основывается на анализе не 

менее  11–15  метафазных  пластинок.  На  2–3  пластинках  проводится 

идентификация всех хромосом набора, а остальные используются для 

подсчета хромосом.

Использование в нашей работе ускоренного прямого метода на 

более чем 8000 образцах хориона и плаценты позволило провести 

диагностику хромосомных болезней в 99,8 и 99,6

 

% случаев соответ-

ственно  (см. главу 9,  табл. 9.7).  Применение  полуавтоматических 

систем для анализа изображений существенно повысило скорость, 

надежность и эффективность анализа. Необходимо признать, одна-

ко, что число митозов на прямых препаратах из хориона и, особен-

но, из плаценты существенно ниже, чем на препаратах из культур 

клеток.

4.5.1.3. Митотическая активность клеток цитотрофобласта

Невысокий  митотический  индекс  цитотрофобласта  может  быть 

связан с особенностями клеточного цикла этих клеток. При изучении 

хориона  человека  6–16  недель  беременности  с  Н

3

-тимидином  было 

обнаружено, что временные параметры клеточного цикла цитотрофо-

бласта общей продолжительностью 15 часов обнаруживают сходство 

с хорионкарциномой [33]. Так, митотический цикл клеток Лангханса 

на ранних этапах развития характеризуется длительной постмитоти-

ческой фазой G1 (7 часов). Синтез ДНК составляет 5,5 часа, после ко-

торого следует короткая предмитотическая фаза G2 (2 часа) и очень 

короткий по времени митоз. Согласно другим данным, полученным в 

исследованиях с помощью БДУ [903], продолжительность цикла кле-

ток цитотрофобласта составляет 36 часов: фаза G2 занимает не более 

4 часов, S-фаза — 10–16 часов, период G1 варьирует в широких преде-

лах, а митотическая фаза оценивается как непродолжительная. Таким 

образом, данные относительно продолжительности клеточного цикла 

клеток цитотрофобласта и отдельных его фаз крайне противоречивы. 

Между тем, временные параметры митотического цикла клеток мезен-

химной стромы в условиях in vitro по продолжительности отдельных 

фаз и цикла в целом соответствуют клеточному циклу фибробластов и 

амниотического эпителия [290, 543].

׳

135

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

Рис.4.15. Методические подходы к анализу хромосом клеток цитотрофобласта на 

«прямых» препаратах из ворсинчатого хориона или плаценты: а — GTG (47,XX, + 7); 

б  —  QFH/AcD  (47,XX, + 21);  в  —  FPG  (47,XXX);  г  —  RBA  (46,XX);  д  —  CBG  (46,XY); 

е — QFH/MG (46,XY,9ph); ж — Ag-NOR + QFH/AcD; з — Ag-NOR + G; и — СХО (эндоми-

тоз); к — FISH c ДНК-зондом D18Z1 (47,XX, + i(18p)); л — FISH c цельнохромосомным 

ДНК-зондом к хромосоме 4 (46,XY, t(4;15)); м — FISH c ДНК-зондом DXZ1 (45,X)

 

а)  

д) 

и)

 

б)  

е) 

к)

 

в)  

ж) 

л)

 

г)  

з) 

м)

Цитогенетика эмбрионального развития человека

136

Предпринимались  неоднократные  попытки  выявить  корреляцию 

между морфологическими особенностями ворсин хориона и величи-

ной  митотического  индекса  клеток  цитотрофобласта.  В  частности, 

сообщалось  о  прямой  корреляции  между  степенью  васкуляризации 

ворсин и митотической активностью [24]. Вместе с тем, большинство 

исследователей сходятся во мнении, что степень васкуляризации, на-

личие терминальных ворсин и другие особенности строения хориона, 

не коррелируют с величиной митотического индекса на «прямых» пре-

паратах из ворсин хориона [509, 737].

Предполагается,  что  процессы  пролиферации  и  дифференциации 

цитотрофобласта могут зависеть от концентрации кислорода [111]. По 

крайней  мере,  культивирование  ворсин  хориона  in vitro  в  атмосфере 

с высоким (5

 

%) содержанием СО

2

 и низким (2

 

%) кислорода сопро-

вождается увеличением митотической активности, тогда как 20%-ное 

содержание кислорода приводит к остановке клеточных делений [754]. 

Подъем  митотической  активности  в  условиях  гипоксии,  возможно, 

обусловлен активизацией экспрессии в клетках цитотрофобласта цик-

лина В, регулирующего вступление клеток в митоз [754]. Любопытно, 

что митотическая активность клеток Лангханса зависит от времени су-

ток — в вечерне-ночное время их митотическая активность в 2–3 раза 

выше по сравнению с утренне-дневным [33].

Известно, что пролиферация клеток цитотрофобласта варьирует в 

зависимости от срока беременности, что, очевидно, связано с особен-

ностями функций хориона и плаценты. С начала второго триместра до 

конца беременности митотическая активность клеток цитотрофо бласта 

постепенно снижается [832], что сопровождается постепенным исто-

щением цитотрофобластического слоя [275]. Однако число митозов на 

«прямых» цитогенетических препаратах во II и даже в III триместрах 

беременности по мнению ряда авторов может оказаться вполне доста-

точным для кариотипирования плода [328, 565].

Уместно напомнить, что «прямые» препараты в зарубежных цент-

рах пренатальной диагностики используются лишь в первом триместре 

беременности. Внедрение плацентобиопсии в клиническую практику 

потребовало определения верхних границ срока беременности, когда 

пренатальная диагностика с использованием «прямых» препаратов из 

плаценты нецелесообразна. Для выбора диагностических сроков, оп-

137

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

тимальных для кариотипирования плода во II триместре беременности, 

мы предприняли специальное исследование митотической активности 

клеток  цитотрофобласта  на  прямых  диагностических  препаратах  от 

134 плодов разных сроков развития [99].

Подсчет митотического индекса (МИ) проводили по общепринятой 

формуле МИ  =  N

m

/N, где N

m

 — число митозов, а N — общее количе-

ство клеток в исследуемой совокупности. Данная величина характери-

зует удельное значение фракций клеток, находящихся в митозе [108]. 

Из каждого образца анализировали по 1–3 препарата, полученные ре-

зультаты суммировали.

Следует отметить, что несмотря на заметные индивидуальные раз-

личия, МИ в I триместре (максимум в срок 11–12 недель беременнос-

ти) в среднем в 2 раза превышает таковой во II триместре и на поря-

док — в III триместре беременности (рис. 4.16) (F  =  48,09; Р < 0,01). 

Эти  результаты  подтвердили  эмпирические  наблюдения  о  том,  что 

результативность пренатальной диагностики хромосомных болезней с 

использованием «прямых» препаратов на ранних сроках беременности 

выше, чем во втором триместре.

Как известно, в конце I триместра беременности завершается фор-

мирование плаценты, и она начинает выполнять все присущие ей мно-

гообразные функции (см. главу 1). В этот период происходит активная 

дифференцировка клеток цитотрофобласта и их слияние с образовани-

ем характерного синцития (синцитиотрофобласт) (рис. 1.14). Отмеча-

ется активный синтез белков, специфичных для хориального эпителия, 

в частности, хорионического гонадотропина (ХГЧ) и трофобластичес-

кого β-гонадотропина (ТБГ) [353].

В  литературе  имеются  многочисленные  сведения  о  взаимосвязи 

между  секрецией  ХГЧ,  дифференцировкой  и  пролиферацией  трофо-

бласта.  Исследованию  особенностей  синтеза  ХГЧ  и  его  субъединиц 

клетками  хориона  посвящена  обширная  литература  [338,  438,  886]. 

Известно,  что  ХГЧ  играет  решающую  роль  в  процессах  пролифера-

ции  цитотрофобласта  и  его  дифференцировки  в  синцитиотрофобласт. 

В свою  очередь,  для  нормальной  продукции  ХГЧ  необходим  пул  кле-

ток  цитотрофобласта.  Активной  пролиферации  цитотрофобласта  в 

первом  триместре  соответствует  значительное  увеличение  уровня  

β

-ХГЧ в сыворотке крови матери [731]. Наши данные о наличии тенден-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

138

Y=a+bX

Y=0,04835 + 0,01734X

r=0,43278

X

Y

0

-1

0,04

0,08

0,12

0,16

0,2

0,24

0,28

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Рис.4.17. Взаимосвязь митотической активности цитотрофобласта плаценты и уровня 

ХГЧ в сыворотке крови матери (графики линейной регрессии): а — по оси абсцисс — зна-

чения митотического индекса (МИ, %), по оси ординат — уровень ХГЧ (МоМ); б — по оси 

абсцисс — уровень ХГЧ (МоМ), по оси ординат — значения МИ (%).

а)

б)

Рис.4.16. Динамика митотической активности клеток цитотрофобласта хориона и 

плаценты у плодов человека на разных стадиях внутриутробного развития 

I триместр (N  =  33) II триместр (N  =  84) III триместр (N  =  17)

9/10

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

10/11 12/13 13/14 14/15 16/17 17/18 18/19 19/20 37/38

Мит

отический индек

с (%)

Y=a+bX

Y=2,3528 + 10,803X

r=0,43278

X

Y

0,04

0

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0,08

0,12

0,16

0,2

0,24

0,28

139

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

ции к увеличению митотического индекса клеток цитотрофобласта при 

высоких показателях уровня ХГЧ в сыворотке крови матери во втором 

триместре беременности (рис. 4.17) подтверждают такую корреляцию.

Таким  образом,  цитотрофобласт  является  камбиальным  слоем 

синцитиотрофобласта и совместно с ним обеспечивает гормональную 

функцию плаценты. Клетки цитотрофобласта претерпевают интенсив-

ные митотические деления в первом триместре беременности; пик их 

митотической активности совпадает с высоким уровнем синтеза и сек-

реции ХГЧ. Обнаруженная зависимость между повышенным уровнем 

ХГЧ и увеличением митотического индекса цитотрофобласта свиде-

тельствует в пользу сопряженности этих процессов. МИ в цитотрофо-

бласте косвенно отражает функциональное состояние плаценты. По-

этому при выборе тактики  цитогенетической  пренатальной  диагнос-

тики во II триместре беременности следует учитывать уровень ХГЧ 

в сыворотке крови матери. С другой стороны, высокий МИ в клетках 

цитотрофобласта в поздние сроки беременности можно рассматривать 

как  предвестник  плацентарной  недостаточности  и  гипоксии  плода, 

что позволяет своевременно рекомендовать проведение профилактики 

этих наиболее частых акушерских осложнений (см. главу 9).

4.5.2. Клетки амниотической жидкости

В середине 1960-х годов было установлено, что часть клеток ам-

ниотической жидкости (КАЖ) способна к пролиферации и образова-

нию колоний in vitro [814]. Несколько позднее АЖ, а также КАЖ стали 

использовать для биохимической диагностики некоторых заболеваний 

обмена  веществ  [659],  а  также  для  биохимической  и  молекулярной 

диагностики моногенных заболеваний [14].

Амниоцентез  в  целях  пренатального  кариотипирования  обычно 

выполняют в период с 15-й по 17-ю неделю беременности. При амнио-

центезе  извлекается  20–50  мл  АЖ,  что  составляет  около  10–15

 

%  ее 

общего объема [736]. Количество жизнеспособных КАЖ в таком объ-

еме вполне достаточно для успешного культивирования. Незначитель-

ное число послеоперационных осложнений способствовало широкому 

внедрению амниоцентеза в практику. В настоящее время в зарубежных 

странах  трансабдоминальный  амниоцентез  является  ведущим  среди 

других инвазивных методов получения образцов плодного материала.