Цитогенетика эмбрионального развития - часть 15

Цитогенетика эмбрионального развития человека

116

Прогрессирующая непроходимость, а также врожденное билатеральное 

отсутствие vas deferens (CBAVD) приводят к аспермии [421]. В целом, 

частота гетерозиготных носителей отдельных мутаций гена CFTR среди 

пациентов с CBAVD составляет 47

 

%, а в компаунде с другими мутация-

ми — 19

 

% [339]. Однако с учетом одностороннего отсутствия vas deferens 

(СUAVD), при котором фертильность сохраняется, частота мутаций мо-

жет быть выше. Более того, 14,3

 

% мужчин с необструктивной азооспер-

мией и 17,5

 

% с олигоспермией оказались гетерозиготными носителями 

какой-либо из 13 тестируемых мутаций гена CFTR [317].

Предполагают, что не менее значительный вклад (> 40

 

%) в идиопати-

ческое мужское бесплодие вносят мутации в гене андрогенового рецеп-

тора (AR) [215]. Известно, что делеции и точковые мутации в гене AR 

приводят к тестикулярной феминизации (женщины с кариотипом 46,XY) 

или  синдрому  Райфенштейна  [613],  а  увеличение  числа  тринуклеотид-

ных повторов CAG

n

 в экзоне 1 — к болезни Кеннеди, которая относится 

к числу «болезней экспансии» [44]. Частота мутаций гена AR при нару-

шениях сперматогенеза пока не выяснена, однако роль точковых мутаций 

в гормонсвязывающем домене в развитии олигоастенотератозооспермии 

давно доказана [722].

Следует напомнить, что ген SRY является главным геном-регулятором 

развития по мужскому типу [204]. Мутации в этом гене сопровождаются 

широким диапазоном клинических и фенотипических проявлений — от 

полной реверсии пола [411, 441] до недоразвития мужских гонад [131]. 

Частота мутаций в гене SRY при реверсии пола (женщины с кариотипом 

46,XY) составляет 15–20

 

% [277], при других отклонениях половой диф-

ференцировки и нарушениях сперматогенеза она точно не установлена. 

Однако, несмотря на заведомо низкую вероятность выявления мутаций, 

молекулярный анализ гена SRY представляется целесообразным при ком-

плексном обследовании.

Разработанный нами алгоритм обследования мужского бесплодия, ко-

торый включает кариотипирование, ККАНПК, а также микроделецион-

ный анализ локусов AZF, доказал свою эффективность при поиске причин 

нарушения сперматогенеза и определения тактики преодоления беспло-

дия [113, 194].

Не вызывает сомнения, что сперматогенез как сложноорганизованная 

и строго упорядоченная цепь событий, регулируется множеством факто-

117

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

ров. Список генов, имеющих непосредственное отношение к формиро-

ванию гонады и ее функциям, постоянно пополняется. Однако и в насто-

ящее время многие из причин мужского бесплодия могут быть установ-

лены  при  комплексном  цитогенетическом  и  молекулярно-генетическом 

исследовании.

4.3. Методы исследования оогенеза

Цитогенетический анализ в процессе оогенеза возможен как в пе-

риод формирования женских гонад, так и после рождения (табл. 4.2). 

У  зародышей  доступны  анализу  митотически  делящиеся  оогонии  и 

ооциты  I  в  профазе  мейоза  (стадии  лептотены,  зиготены,  пахитены, 

диплотены).  После  рождения  объектами  исследования  обычно  явля-

ются ооциты, получаемые в рамках программы ЭКО. Иными словами, 

изучение ранних стадий мейоза ограничено материалом от медицин-

ских или спонтанных абортусов, а мейотических метафазных хромо-

сом  человека — яйцеклетками,  не  оплодотворившимися  в  условиях 

in vitro.

4.3.1. Анализ хромосом в первом делении мейоза

4.3.1.1. Профаза I

Как  уже  отмечалось  (см. главу 1),  ооциты  человека  вступают  в 

мейоз на ранних стадиях эмбрионального развития. Несмотря на труд-

нодоступность  материала,  неоднократно  предпринимались  попытки 

изучить поведение хромосом в профазе I с помощью традиционных 

цитогенетических методов или путем анализа тотальных СК [246, 556, 

586, 592, 686, 803, 821]. Молекулярно-цитогенетические и иммуноци-

тохимические методы предоставили новые возможности для анализа 

процессов конъюгации и рекомбинации в оогенезе, однако работы та-

кого рода единичны [225, 296, 297].

К настоящему времени на материале медицинских абортусов 6–24 

недель развития установлена хронология профазы I. Так, ооциты на ста-

дии лептотены — зиготены появляются на 9-й неделе и сохраняются в 

яичниках плодов до 24-й недели беременности, первые ооциты на ста-

диях пахитены — диплотены зарегистрированы одновременно с дикти-

отеной в 13–14 недель [357]. Известно также, что у новорожденных все 

ооциты в яичнике находятся на стадии диктиотены. Аналогичные данные 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

118

были получены и при исследовании спонтанных выкидышей 6–40 недель 

развития без видимых пороков органов и систем [94]. Таким образом, в 

яичниках эмбрионов и плодов с 6-й по 40-ю недели ооциты находятся на 

разных стадиях профазы мейоза, что обусловлено асинхронностью вступ-

ления в мейоз. При этом гетерогенность ооцитов закономерно изменяется 

по мере нормального внутриутробного развития.

Динамика  изменения  соотношения  ооцитов  на  стадиях  профазы  I 

у плодов с различной, в том числе и хромосомной патологией, практи-

чески не изучена. С целью выяснения особенностей процесса мейоза в 

1. Оогонии и ооциты в профазе первого деления мейоза

       • эмбрионы 9–26-й недель развития

2. При использовании методов ЭКО*:

Незрелые ооциты

стадия зародышевого пузырька (профаза первого деления мейоза, поздняя 

• 

диплотена

разрушение зародышевого пузырька (диакинез)

• 

метафаза первого деления мейоза (MI)

• 

Зрелые ооциты

• метафаза второго деления мейоза (MII)  +  первое полярное тельце (ППТ)
• изолированное ППТ (биопсия, выполненная для генетической диагностики)

Ооциты, используемые для оплодотворения in vitro

• неоплодотворившиеся ооциты в MII
• оплодотворившиеся ооциты

нормальные зиготы (с женским и мужским пронуклеусами)  +  

• 

второе полярное тельце (ВПТ)

изолированное ВПТ (биопсия, выполненная для генетической 

• 

диагностики)

аномальное оплодотворение (полиплоидная зигота)

• 

незавершенное оплодотворение: хромосомы в MII  +  

• 

преждевременно конденсированные хромосомы отцовского 

пронуклеуса, хроматиновые массы и т. д.

• ооциты, активированные к партеногенетическому развитию 

Дробящиеся эмбрионы

• нормальное развитие
• аномальное развитие (остановка дробления, фрагментация)

Биопсия эмбриона

• изолированные бластомеры от эмбриона на стадии дробления
• биопсия трофэктодермы на стадии бластоцисты

Таблица 4.2. Материал, доступный для цитогенетического анализа оогенеза у человека

* См. [379].

119

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

развивающихся яичниках у плодов с врожденными пороками развития и 

хромосомными  болезнями  нами  были  предприняты  специальные  иссле-

дования [86]. Хронология профазы I была изучена на хромосомных препа-

ратах,  полученных  из  аутопсийного  материала  яичников  от  58  плодов 

женского пола сроком развития 19–26 недель беременности. В 12 случаях 

материал  был  получен  от  спонтанных  абортусов,  в  31  случае —  после 

прерывания  беременности  по  социальным  показаниям  и  в  15 —  в  связи 

с  наличием  хромосомных  болезней  (n  =  7)  или  врожденными  пороками 

развития (n  =  8). По результатам патоморфологического исследования, все 

индуцированные абортусы, полученные в результате прерывания беремен-

ности по социальным показаниям, соответствовали сроку беременности и 

не имели пороков развития. Поэтому мы сочли возможным использовать их  

в качестве условно нормальной, контрольной группы. Все плоды из группы 

спонтанных абортусов имели признаки внутриутробной задержки развития, 

сопровождавшиеся плацентарной недостаточностью. Врожденные пороки 

развития  были  представлены  пороками  нервной  и  сердечно-сосудистой 

систем, а хромосомные — трисомией 21 (n  =  4) и трисомией 18 (n  =  1).

Сравнительный анализ распределения ооцитов по стадиям профазы 

показал, что в случаях остановки или замедления темпов внутриутробного 

развития  при  отсутствии  аномалий  морфогенеза  отмечается  задержка 

мейоза  на  стадии  лептотены.  Формирование  множественных  пороков 

развития,  включая  нервную  и  сердечно-сосудистую  системы  сопро-

вождается  ускорением  темпа  мейоза,  которое  выражается  в  снижении 

численности ооцитов начальных стадий профазы и резком увеличении 

числа  ооцитов  на  стадиях  пахитены  —  диплотены.  Влияние  трисомии 

21  и  18  на  динамику  профазы  проявляется  двояким  образом.  Часть 

ооцитов в ускоренном темпе преодолевает начальные стадии профазы, 

достигая  стадии  диплотены,  тогда  как  остальные  проходят  стадии 

прелептотены — лептотены в замедленном темпе или претерпевают 

остановку  на  стадии  зиготены.  При  этом  в  большинстве  ооцитов  у 

плодов с трисомией триада хромосом 21 представлена унивалентами, 

что, по-видимому, является одним из признаков их неспособности к 

завершению профазы мейоза.

К сожалению, следует признать, что сведения об изменении хроно-

логии  начальных  стадий  оогенеза  недостаточны  для  понимания 

механизмов действия тех или иных факторов на профазу первого мейоти-

ческого  деления.  Однако  полученные  нами  результаты  иллюстрируют 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

120

Рис. 4.7. Мейоциты из яичника от медицинс-

кого абортуса (кариотип 47,ХХ, + 21) сроком 

развития 21/22 недели. FISH с цельнохромо-

сомным ДНК-зондом к хромосоме 21. Вари-

анты конъюгации хромосом 21: а — полный 

асинапсис  хромосом  триады,  б  —  бива-

лент  +  унивалент, в — тривалент

 

а)  

б)

 

в) 

Рис.4.8. Препарат из яичника медицинского абортуса с кариотипом 69,ХХХ сроком 

развития  18  недель.  FISH  с  ДНК-зондом  DXZ1,  специфичным  к  прицентромерному 

району Х-хромосомы (DXZ1)

121

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

многоо бразие причин, приводящих к изменению динамики мейотических 

преобразований в эмбриональный и плодный периоды развития человека.

Особый  интерес  представляют  результаты  анализа  профазных 

хромосом  у  плодов  с  несбалансированным  кариотипом  (рис. 4.7).  Так, 

при  трисомии  21  и  18  наблюдается  как  полный  асинапсис  хромосом 

триады, так и конъюгация гомологов, которая осуществляется двояким 

образом — бивалент  +  унивалент или тривалент [225, 297]. СК в трива-

ленте  формируется  либо  по  всей  длине  триады  хромосом  21,  либо 

частично, с образованием «шпилек» [882].

Как известно, в ходе эмбрионального развития наблюдается массовая 

гибель  ооцитов  (см. главу 1).  Предполагается,  что  одной  из  причин 

такой  гибели  является  аномальная  конъюгация  хромосом  [640,  802]. 

Повышенная частота атретичных ооцитов у анеуплоидных плодов [225] и 

полное отсутствие мейоцитов у плода 69,ХХХ (рис. 4.8) [88] согласуются 

с этой гипотезой. Однако механизмы, регулирующие вступление ооцитов 

в апоптоз, до сих пор не выяснены [647]. Таким образом, профаза мейоза 

у эмбрионов женского пола с нормальным и гетероплоидным кариотипом 

является  уникальной  естественной  моделью  для  изучения  конъюгации 

хромосом, антенатальной селекции ооцитов и анализа контролирующих 

механизмов запрограммированной клеточной гибели — апоптоза.

4.3.1.2. Метафаза I

Начиная со стадии диакинеза, цитогенетические исследования воз-

можны исключительно на яйцеклетках, полученных после гормональ-

ной стимуляции в рамках программ ЭКО. В отличие от естественного 

цикла, при котором овулирует, как правило, только один ооцит, после 

гормональной стимуляции путем аспирации больших фолликулов воз-

можно получение 10–20 яйцеклеток различной степени зрелости [406]. 

Большая часть таких яйцеклеток находится на стадиях метафазы I или 

метафазы  II.  Незрелые  яйцеклетки  более  ранних  стадий  в  условиях 

программы ЭКО встречаются сравнительно редко [873]. Однако они 

могут  быть  получены  путем  аспирации  фолликулов  при  различных 

операциях, связанных с резекцией яичника.

Дальнейшие преобразования профазного ядра (зародышевого пузырь-

ка) при созревании ооцитов человека изучены крайне слабо. Известно, что 

вплоть до полового созревания, ооцит находится на стадии диктиотены. 

На этой стадии ядро представляет собой крупный пузырек (так называе-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

122

мый «зародышевый пузырек»), в котором визуализируются многочислен-

ные хроматиновые блоки — хромоцентры. В начале периода созревания 

в нем формируется кариосфера — комплексная ядерная структура, состо-

ящая из клубка хромосом, расположенных вокруг ядрышка. Установлено, 

что кариосфера образуется в периоде, предшествующем овуляции, когда 

ооцит уже утрачивает связь с клетками гранулезы [183].

Первым морфологическим признаком созревания является разру-

шение зародышевого пузырька, конденсация диплотенных хромосом 

и визуализация бивалентов.

Основные работы по изучению хромосом после разрушения зароды-

шевого пузырька проведены исключительно на модельных объектах. Как 

показано в экспериментах на мышах и крысах, хромосомы к концу про-

фазы  имеют  разную  степень  спирализации  и  гетерохроматизации  [54]. 

Биологический  смысл  этого  явления  остается  загадочным.  Нередко  в 

диакинезе — метафазе I у мыши регистрируют униваленты, которые мо-

гут указывать на предрасположенность к преждевременному расхожде-

нию хромосом в первом делении созревания. Гипогаплоидия, три-, тетра- 

или мультиваленты могут указывать на наличие транслокации [379].

Расхождение  хромосом  из  бивалента  происходит  таким  образом, 

что  в  результате  1-го  мейотического  деления  одна  из  гомологичных 

хромосом остается в ооците, а вторая уходит в 1-е полярное тельце. 

После первого (редукционного) деления мейоза в ооците и в полярном 

тельце остается по 23 хромосомы (диады). При 2-м делении мейоза 

расходятся сестринские хроматиды каждой из оставшейся гомологич-

ной хромосомы (диады). В результате второго (эквационного) деления, 

которое наступает только после оплодотворения, ооцит и 2-е полярное 

тельце получают по 23 сестринские хроматиды (рис. 1.3).

4.3.1.3. Первое полярное тельце 

Поведение хромосом, попавших в первое полярное тельце (ППТ), так-

же заслуживает внимания. У мышей этот хромосомный набор, как прави-

ло, не формирует ядра и доступен для цитогенетического анализа в течение 

нескольких часов. ППТ блокировано на стадии метафазы и дегенерирует 

во время или сразу после второго деления созревания [54]. Хронология 

преобразований ППТ у человека детально не описана. Как правило, ППТ 

дегенерирует вскоре после аспирации ооцита [715]. В некоторых случаях 

123

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

дегенерация ППТ начинается через 48 часов от начала культивирования, 

что делает возможным его цитогенетический анализ в течение несколь-

ких часов после оплодотворения in vitro [379]. Хромосомы ППТ состоят 

из двух хроматид и обычно имеют неясные контуры («пушистые»), что 

затрудняет их идентификацию при традиционных методах дифференци-

ального окрашивания. Однако в ряде случаев они доступны для подсчета 

[379]. Последнее обстоятельство имеет принципиально важное значение 

для диагностики анеуплоидии, так как подавляющее число трисомий у 

человека обусловлено нерасхождением материнских хромосом в первом 

делении мейоза [514].

Следует  отметить,  что  цитогенетическая  диагностика  с  анализом 

ППТ  у  человека  почти  не  используется.  По-видимому,  это  связано 

с  трудностями  методического  плана,  а  также  с  дегенерацией  ППТ  у 

большинства получаемых ооцитов. Применение метода мультиплекс-

ной FISH с использованием хромосом-специфических ДНК-зондов к 

хромосомам 13, 16, 18, 21 и 22 позволяет решить эту проблему для ана-

лиза наиболее частых типов трисомий (рис. 4.9). Вместе с тем, струк-

турные аберрации, возникшие de novo, выявить не удается [871].

Определенный  оптимизм  вселяют  новые  подходы,  направленные 

на  получение  препаратов  изолированных  полярных  телец,  качество 

хромосом на которых позволяет успешно проводить цитогенетический 

анализ. Так, усовершенствование методи-

ки  приготовления  препаратов  позволило 

достичь  94,1

 

%  эффективности  анализа 

хромосомного  набора  ППТ  у  человека 

[311].  Методом  спектрального  кариоти-

пирования  (SKY)  был  проведен  анализ 

ППТ,  который  показал  перспективность 

использования  этого  метода  для  иденти-

фикации всех хромосом набора [596].

4.3.2. Анализ хромосом во втором 

делении мейоза

Ошибки  сегрегации  хромосом  в  жен-

ском  мейозе  можно  оценить  непосредс-

твенно  в  оплодотворенной  яйцеклетке  на 

Рис.4.9. Первое полярное тельце 

неоплодотворившегося ооцита. 

FISH с ДНК-зондом D18Z1, спе-

цифичным к прицентромерному 

району хромосомы 18