Цитогенетика эмбрионального развития - часть 13

Цитогенетика эмбрионального развития человека

100

ления половой зрелости все стадии сперматогенеза доступны для ис-

следования на протяжении всей жизни.

Для анализа возникновения хромосомных и геномных мутаций в 

мейозе  млекопитающих,  в  том  числе  и  человека,  обычно  использу-

ют подходы, которые стратегически можно разделить на три группы 

[396]:

цитогенетический  анализ  хромосомного  комплемента  в  спер-

 

●

матоцитах и сперматозоидах;

цитогенетический анализ ооцитов на стадии метафазы II деления 

 

●

мейоза или активированных ооцитов, завершивших второе деле-

ние мейоза, то есть после отделения 2-го полярного тельца;

регистрация аномалий у эмбриона, плода или новорожденного.

 

●

 Как правило, исследования механизмов происхождения хромосом-

ной аномалии ограничиваются одним, большей частью последним, из 

вышеперечисленных подходов.

4.2. Методы исследования сперматогенеза

Нарушения  сперматогенеза  и  спермиогенеза  (см. главу 1)  сопро-

вождаются частичным или полным бесплодием и являются причиной 

2/3 бесплодных браков [257]. Эта проблема давно привлекает внимание 

специалистов в области репродуктивной медицины, однако до сих пор 

продолжается поиск причин, приводящих к мужскому бесплодию.

За последние годы стало очевидно, что многие формы нарушения 

фертильности обусловлены генетическими факторами. Так, хромосом-

ные  аберрации,  делеции Y-хромосомы  и  некоторые  моногенные  бо-

лезни являются причиной 20–30 % мужского бесплодия и нарушений 

сперматогенеза [257, 289, 366].

Точная  диагностика  причин  нарушения  мужской  фертильности  в 

настоящее время приобретает особое значение, поскольку вспомога-

тельные  репродуктивные  технологии  позволяют  преодолеть  многие 

формы мужского бесплодия, что, несомненно, увеличивает риск пере-

дачи потомству целого ряда наследственных болезней. С другой сто-

роны, очевидно, что установление причины бесплодия способствует 

выбору оптимальной тактики лечения мужского бесплодия, что повы-

шает эффективность работы центров репродукции.

В настоящей главе основное внимание сосредоточено на характе-

101

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

ристике цитогенетических подходов, которые применяются для анализа  

сперматогенеза и в сочетании с молекулярно-генетическими методами 

используются для диагностики его нарушений.

Доступность для прижизненного анализа тканей семенников у муж-

чин строго ограничена медицинскими показаниями, такими как стерили-

зация путем кастрации или биопсия яичка у пациентов с нарушениями 

половой дифференцировки или с бесплодием. В последние годы, благо-

даря бурному развитию методов вспомогательной репродукции при ле-

чении мужского бесплодия, оперативные вмешательства ограничиваются 

аспирационной пункцией тканей яичка или его придатка.

Препараты  из  биоптатов  семенников  пригодны  для  анализа 

хромосом на любых стадиях сперматогенеза — от сперматогониев до 

зрелых сперматозоидов. Материал, получаемый при пункции придатка 

(эпидидимиса),  менее  привлекателен  для  цитогенетических  исследо-

ваний профазы мейоза, поскольку концентрация клеток, находящихся 

на  начальных  стадиях  сперматогенеза,  как  правило,  крайне  низка 

и  практически  соответствует  таковой  в  эякуляте.  При  нормальном 

сперматогенезе  доля  сперматоцитов  на  стадиях  мейоза  (мейоцитов) 

в эякуляте составляет не более 3–4

 

% [805]. У пациентов с репроду-

ктивными проблемами количественный и качественный состав эякули-

рованных  сперматоцитов  может  меняться,  в  целом  отражая  общую 

картину сперматогенеза [95, 141, 179]. Очевидно, что анализ эякули-

рованных  мейоцитов,  исключающий  хирургическое  вмешательство, 

перспективен для анализа причин аномалий сперматогенеза и может 

найти широкое применение.

Таким  образом,  существуют  реальные  возможности  получения  

материала для цитогенетических исследований сперматогенеза у чело-

века в норме и при различных формах мужского бесплодия.

4.2.1. Цитологические методы 

4.2.1.1. спермограмма

Традиционно  оценка  особенностей  сперматогенеза  проводи тся 

при  помощи  спермограммы.  Согласно  рекомендациям  ВОЗ  [890], 

спермограмма  должна  учитывать  следующие  критерии:  концентра-

цию  сперматозоидов  в  1  мл  эякулята,  соотношение  живых/мертвых, 

подвижных/неподвижных,  морфологически  нормальных/аномальных 

сперматозоидов;  наличие  незрелых  половых  клеток.  Разработаны  

Цитогенетика эмбрионального развития человека

102

критерии  оценки  морфологии  сперматозоидов  [808,  890].  Спермо-

грамма позволяет косвенно судить о состоянии сперматогенеза на ос-

новании морфологических показателей заключительных этапов этого 

сложного и длительного процесса.

4.2.1.2. Количественный кариологический

 анализ незрелых половых клеток

Количественный кариологический анализ незрелых половых клеток 

(ККАНПК)  является  одним  из  наиболее  доступных  методов  анализа 

состояния сперматогенеза. Метод основан на определении числа клеток, 

находящихся на разных стадиях сперматогенеза, путем их подсчета на 

цитогенетических  препаратах  из  биоптатов  семенников  или  эякулята 

человека  [95].  В  отличие  от  традиционной  спермограммы,  ККАНПК 

позволяет  более  детально  проанализировать  состояние  сперматогенеза, 

так как предполагает идентификацию всех его стадий, как мейотических, 

так и пре- и постмейотических. Изменение соотношения клеток сперма-

тогенного  ряда  позволяет  определить  стадии  деления  или  дифферен-

цировки  клеток,  на  которых  сперматогенез  оказывается  заблокирован. 

Информативность метода ККАНПК доказана при исследовании эякулятов 

в группах пациентов с нарушениями сперматогенеза различной этиологии 

[141]. К недостаткам метода можно отнести затруднения при идентифи-

кации клеток по стадиям развития вследствие дегенерации большой части 

эякулированных клеток сперматогенного ряда.

В лаборатории пренатальной диагностики НИИ акушерства и гинеко-

логии  им.  Д.  О.  Отта  РАМН  ККАНПК  проводят  на  суховоздушных 

препаратах  из  нативного  эякулята  после  окрашивания  флуорохромом 

Hoechst  33258  [89].  Идентификацию  стадий  и  подсчет  клеток  осуще-

ствляют согласно схеме [141]. Определяют долю клеток каждой стадии 

от общего числа НПК. При подсчете выделяют сперматоциты на стадии 

предпахитенного  этапа  развития  (клетки  на  стадиях  прелептотены, 

лептотены и зиготены), пахитены, диплотены — диакинеза, метафазы 

I  и  II,  сперматоциты  2-го  порядка  и  сперматиды.  В  отдельную 

группу объединяют клетки, идентификация которых была невозможна  

(Х-клетки) (рис. 4.1).

Несмотря  на  выраженные  межиндивидуальные  различия  в  со-

отношении  НПК,  отмечаются  некоторые общие  тенденции  в  разных 

группах пациентов (табл. 4.1). Так, при астенозооспермии и астено-

103

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

Рис. 4.1. Клетки сперматогенного ряда: а — прелептотена, б — лептотена, в — зи-

готена, г — пахитена, д — диплотена, е — диакинез, ж — метафаза, з — спермато-

циты II порядка, и — сперматоциты II порядка и сперматиды, к — неразошедшиеся 

сперматиды, л, м — деградирующие клетки сперматогенного ряда (Х-клетки). Пре-

параты из образцов эякулята от пациентов с азооспермией. Окраска QFH/AcD

 

а) 

д) 

и)

 

б) 

е) 

к)

 

в) 

ж)  

л)

 

г) 

з)  

м)

Цитогенетика эмбрионального развития человека

104

Пациенты

Норма*

Стадии 

сперматогенеза

Астено-

зооспермия 

(N = 9)

Астенотера-

тозооспермия 

(N = 6)

Олигоасте-

нозооспер-

мия (N = 6)

Азооспер-

мия (N = 5)

До пахитены

4,03  ±  0,153 5,22 ± 0,454

1,07 ± 0,289 0,43 ± 0,167

0,66

Пахитена

0 ± 0

0,28 ± 0,016

0,49 ± 0,162 0,54 ± 0,0153

0,45

Диплотена — 

диакинез

2,58 ± 0,04

4,98 ± 0,607

3,12 ± 0,628 0,07 ± 0,029

1,11

Метафаза I и II

0 ± 0

0,34 ± 0,07

0,05 ± 0,004 0,67 ± 0,205

0,04

Сперматоциты 2 

и сперматиды

54,26 ± 4,646 32,66 ± 3,358 65,93 ± 4,962 28,34 ± 5,226

68,0

Неразошедшиеся 

сперматиды

24,78 ± 3,531 37,92 ± 2,583 27,43 ± 3,609 14,67 ± 5,169

22,9

Х-клетки

11,54 ± 1,709 14,23 ± 1,265 1,97 ± 0,752 17,11 ± 1,372

5,85

Эпителиальные 

клетки

2,66 ± 0,826

5,00 ± 0,752

0,27 ± 0,166 5,00 ± 0,831

–

Лейкоциты

1,78 ± 0,099

1,23 ± 0,074

0,17 ± 0,073 0,09 ± 0,035

–

% незрелых по-

ловых клеток

6,37 ± 1,112

10,7 ± 2,134 25,53 ± 3,861

–

2–4

Таблица 4.1. Cоотношение клеточных элементов эякулята (%) в группах пациентов 

с нарушениями сперматогенеза

тератозооспермии  выявляется  частичный  блок  сперматогенеза  на 

предпахитенных стадиях и отмечается снижение числа сперматоцитов 

2 и сперматид. При астенотератозооспермии доля незрелых половых 

клеток в несколько раз выше нормы.

При  олигоастенозооспермии  наблюдается  увеличение  количества 

сперматоцитов 2-го порядка, что свидетельствует о нарушениях созре-

вания гамет на более поздних стадиях сперматогенеза. При азооспермии 

незрелые клетки выявляются в следовых количествах, встречаются эпите-

лиальные клетки и лейкоциты, наличие которых указывает на воспали-

тельные и дегенеративные процессы в семенных канальцах.

Особый  интерес  представляют  данные  о  количественном  и  качест-

венном  составе  незрелых  половых  клеток  в  эякулятах  у  пациентов  с 

хромо сомными аномалиями. Так, в проведенном нами исследовании [185]  

в эякулятах у пациентов с аномальным кариотипом доля незрелых клеток 

варьировала от 11,3 до 100

 

%, что многократно превышало контрольные 

значения  (1,5

 

%).  Увеличение  незрелых  форм  половых  клеток  проис-

ходило на фоне массовой гибели клеток, особенно ярко выраженной при 

* См. [141] (приведены только средние значения).

105

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

численных и структурных аномалиях половых хромосом, включая микро-

делеции в локусе AZF. При этом у пациентов с полной и мозаичной формой 

синдрома  Клайфельтера  (XXY,  XX/XXY)  наблюдалось  относительное 

повышение доли сперматогониев, а у носителей кариотипов 47,XYY/46,XY 

и 46,X,der(Y) превалировали сперматоциты II и сперматиды, в том числе и 

с нарушениями кариокинеза. В случае носительства транслокации (9;13), 

кроме  деградирующих  клеток  доминировали  сперматоциты  на  стадии 

лептотены  —  зиготены.  Таким  образом,  численные  аномалии  половых 

хромосом  сопровождаются  увеличением  доли  сперматогониев,  а  струк-

турные аберрации аутосом — доли сперматоцитов допахитенных стадий 

мейоза. Подобные отклонения в соотношении НПК в образцах эякулята 

от пациентов с нормальным кариотипом 46,XY могут служить косвенным 

доказательством наличия гонадного мозаицизма.

Соотношение клеток НПК в эякуляте в определенной степени слу-

жит показателем продолжительности этих стадий [89, 805]. Доля спер-

матоцитов,  находящихся  в  профазе  I  мейоза,  длительность  которой 

у человека составляет 3–4 недели [357], обычно не превышает 10

 

% 

и  не  зависит  от  морфофункциональных  параметров  спермограммы.  

Исключение составляют носители аутосомных транслокаций и паци-

енты с астенотератозооспермией, в эякуляте которых доля спермато-

цитов 1-го порядка двоекратно превышает аналогичный показатель в 

других группах. Можно предположить, что к частичному блоку клеток 

на этих стадиях приводят аномалии конъюгации и синапсиса, а затем 

и нарушения сегрегации хромосом в первом или во втором делениях 

мейоза. Однако некоторые сперматоциты, прошедшие первое мейоти-

ческое деление, способны завершить мейоз и спермиогенез, о чем сви-

детельствует наличие сперматозоидов, иногда единичных, в образцах 

эякулята у всех исследованных нами пациентов.

Связь  нарушений  формирования  головки  спермия  (тератоспер-

мия)  и  его  подвижности  (астеноспермия)  с  аномалиями  кариотипа, 

возникающими  в  мейозе,  заслуживает  специального  исследования. 

Нами,  как  и  некоторыми  другими  авторами,  отмечена  корреляция 

между хромосомными аномалиями и морфологическими характерис-

тиками сперматозоида [50, 193, 737], однако в других работах такой 

зависимости не выявлено [304, 502]. К обсуждению этой проблемы мы 

вернемся в главе 5.

Следует подчеркнуть, что количественный и качественный состав 

Цитогенетика эмбрионального развития человека

106

незрелых  половых  клеток  в  эякуляте  варьирует  у  пациентов  с  раз-

личными  морфофункциональными  параметрами  спермограммы  и, 

следовательно,  является  индивидуальной  характеристикой  исследуе-

мого образца эякулята. Вместе с тем, для каждой группы пациентов 

характерен более или менее определенный тип изменений в соотноше-

нии клеток сперматогенного ряда, что может быть использовано при  

диаг ностике. Детальный анализ эякулированных клеток сперматоген-

ного  ряда  дает  наглядное  представление  о  реальном  существовании 

презиготической селекции мужских гамет и способствует пониманию 

механизмов ее реализации.

4.2.2. Цитогенетические методы

4.2.2.1. Анализ хромосом сперматоцитов

Анализ  хромосом  сперматоцитов  возможен  со  стадии  пахитены. 

Характерным для пахитены является четко выраженная хромомерная 

структура хромосом. Число хромомер (характерных узелковых утол-

щений пахитенных хромосом) уменьшается от 499 в ранней пахите-

не до 386 в средней и поздней пахитене [517]. Хромомерный рисунок 

большинства бивалентов соответствует G- и Q-рисунку митотических 

хромосом [585, 875] (рис. 4.2). Это соответствие позволило разрабо-

тать карту пахитенных хромосом человека [510]. С помощью методов 

дифференциальной окраски в сперматоцитах возможно четко иденти-

фицировать каждый бивалент (конъюгированную пару гомологичных 

хромосом), обнаружить структурный полиморфизм и незначительные 

структурные перестройки хромосом [852].

На  стадии  пахитены  могут  быть  выявлены  практически  все  типы 

перестроек  [189].  Гетерозиготное  состояние  хромосомных  аберраций 

сопровождается образованием характерных для каждого типа аномалий 

конфигураций,  тогда  как  гомозиготные  перестройки  выявляются  лишь  

в том случае, если они резко изменяют морфологию хромосомы.

Половой (XY) бивалент образует на стадии пахитены так называе-

мый половой пузырек. Однако его детальный анализ на световом уровне  

затруднителен вследствие конденсированного состояния. Реально ис-

следование полового бивалента возможно только на препаратах сина-

птонемного комплекса — структурного компонента хромосомных би-

валентов, формирующегося на стадии ранней пахитены.

107

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

Рис.4.2. Хромосомы  из  сперматоцитов на стадии пахитены: а —  эякулированный 

сперматоцит и кариограмма (окраска QFH/AcD); б — тестикулярный сперматоцит 

и кариограмма (окраска по Гимза)

а)

б)