Цитогенетика эмбрионального развития - часть 14

Цитогенетика эмбрионального развития человека

108

В диплотене (стадия двойных нитей) по мере разъединения гомо-

логов в бивалентах визуализируются хиазмы. Характер распределения 

хиазм по хромосомам и их частота (среднее число хиазм на бивалент 

и/или ядро) могут быть различны и зависят от многих факторов, в том 

числе от наличия хромосомных перестроек. Для цитологического ана-

лиза удобными считаются диакинез и метафаза I. Биваленты на этой 

стадии классифицируются по форме, которая определяется размером 

и морфологией хромосом, числу и положению хиазм [76]. Подсчеты 

числа уни-, би- и мультивалентов, а также частоты и локализации хи-

азм являются методами геномного анализа и употребляются при ру-

тинном анализе мейоза [247].

Работы  по  цитогенетическому  анализу  сперматоцитов  в  профазе  I 

мейоза у человека немногочисленны [619, 833]. Это вызвано как огр а-

ниченной доступностью материала, так и, отчасти, причинами методи-

ческого плана. Особенно трудно получить качественные препараты из 

эякулята. Варьирование условий гипотонической обработки, способов 

фиксации и методов окраски пока не позволяет решить эту проблему. 

Частично она может быть преодолена с помощью метода FISH с ДНК-

пробами,  специфичными  для  отдельных  хромосом  или  их  локусов. 

Этим методом удается провести идентификацию отдельных бивалентов 

и проанализировать особенности их поведения в мейозе (рис. 4.3, 4.4)

*

.

Таким образом, анализ хромосом в профазе I мужского мейоза прин-

ципиально возможен, хотя и сопряжен со значительными технически-

ми и методическими трудностями.

4.2.2.2. Анализ синаптонемных комплексов

Непосредственное  изучение  взаимосвязи  процессов  конъюгации, 

распределения хиазм и нерасхождения хромосом предоставляет метод 

анализа синаптонемных комплексов (СК). Последний является обяза-

тельным  структурным  компонентом  бивалентов  на  стадии  пахитены 

[579, 889].

Согласно  современным  представлениям,  первичная  функция  СК — 

обеспечение  конъюгации  гомологичных  хромосом  в  профазе  I,  а  вто-

ричная — функция матрицы для корректных межхромосомных обменов 

[469]. Организация мейотической хромосомы в профазе I до сих пор не 

* 

Рисунок на цв. вкл

.

109

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

изучена и неясно, каким образом СК выполняет свои функции. Тем не 

менее, СК признается своеобразным скелетом мейотической хромосомы,  

а  его  преобразования —  отражением  поведения  гомологов  в  профазе 

I мейоза.  Особенности  формирования  осевых  элементов  СК  на  стадии 

лептотены, начало их сближения и синапсиса на стадии зиготены, синап-

сис и его коррекция на стадии пахитены, а также десинапсис хромосом на 

стадии диплотены детально изучены [83, 280, 797].

Основной метод анализа СК заключается в распластывании мейоти-

ческих клеток на поверхности гипотонического раствора с последующим 

контрастированием структур СК и его анализом при помощи светового 

или  электронного  микроскопа.  Метод  распластывания  мейоцитов  на 

поверхности мениска капель сахарозы впервые предложен в 1973 году 

[335] и пригоден для приготовления препаратов СК из сперматоцитов и 

ооцитов человека.

Благодаря  совпадению  морфометрических  характеристик  боль-

шинства СК и соответствующих им метафазных хромосом возможно 

ранжирование СК в виде идеограмм [797].

Относительные  длины  и  соотношения  плеч  СК  хромосом  1,  9, 

16,  и  19  у  человека  отличаются  от  соответствующих  митотических 

хромосом, в основном, за счет 2–3-кратного укорочения СК в гетеро-

хроматиновых участках пахитенных хромосом [797]. Предполагается, 

что причина этих изменений обусловлена степенью спирализации [442] 

и различиями организации хромосом, содержащих крупные прицент-

ромерные гетеро хроматиновые блоки, в митозе и мейозе [651].

Относительные длины осевых элементов Х- и Y-хромосом, а также 

соотношение  их  плеч  не  пропорциональны  аналогичным  участкам 

митотических  хромосом.  X-  и  Y-хромосомы  конъюгируют  частично, 

формируя СК в дистальных отделах коротких плеч, в псевдоаутосомной 

области (PAR) [274], размеры которого составляют 2,6 миллионов пар 

нуклеотидов [741]. Морфология XY-бивалента закономерно изменяется 

на протяжении пахитены, что служит основой для более четкого подра-

зделения  ее  на  5  подстадий  [826].  Высокая  степень  компактизации 

и  транскрипционной  инертности  полового  бивалента  обусловлена 

механизмом, характерным для инактивации Х-хромосомы в соматических  

клетках [448, 762].

Цитогенетика эмбрионального развития человека

110

Трудоемкость  и  необходимость  электронной  микроскопии  для  де-

тального  анализа  СК  не  позволяют  внедрить  этот  метод  в  практику  

медико-генетического обследования мужчин с идиопатическим беспло-

дием. Вместе с тем, необходимость анализа СК для установления причин 

нарушения сперматогенеза убедительно доказана в работах отечествен-

ных и зарубежных исследователей [83, 205, 206, 561, 615, 796].

Установлено, что асинаптические и десинаптические аномалии СК 

ассоциированы с увеличением частоты гетероплоидных сперматозои-

дов [319, 356, 487, 781] и даже с полным блоком сперматогенеза [83, 

484, 619, 796]. В зависимости от фенотипического проявления эти мей-

отические мутации могут быть объединены в три группы [487]: 

1) «легкие» — наличие унивалентов, которые коррелируют с повы-

шенной частотой дисомий по разным хромосомам; 

2) «умеренные» — аномалии синапсиса, приводящие к увеличению 

числа диплоидных сперматозоидов; 

3) «тяжелые» — полный блок мейоза на стадии первичных спер-

матоцитов.

Очевидно, что обнаружение мейотических аномалий при анализе 

СК представляет интерес для поиска специфических факторов, влия-

ющих на ключевые события мейоза. Однако исследование СК чело-

века представляет значительные трудности в связи с незначительным 

количеством  биопсийного  материала  и  гетерогенностью  клеточного 

состава образца. Эти обстоятельства существенно снижают информа-

тивность анализа СК, так как ограничены исследованием единичных 

клеток на стадии пахитены.

4.2.2.3. Анализ хромосомного набора сперматозоидов

Наиболее  точной  оценкой  частоты  и  спектра  хромосомных  ано-

малий, возникающих в мейозе, является исследование хромосомного  

набора зрелых гамет. Как известно, хроматин в головке сперматозои-

дов упакован очень плотно, и визуализация отдельных хромосом воз-

можна лишь после оплодотворения. До сих пор не известны способы 

цитохимической  обработки  сперматозоидов,  которая  позволила  бы  

получить  в  условиях  in vitro  препараты  с  расправленными  хромосо-

мами, пригодными для цитогенетического анализа. Для преодоления 

этого препятствия используется несколько подходов.

111

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

4.2.2.3.1. Метод гетерологичного оплодотворения

Один  из  объективных  методов,  позволяющих  проводить  прямой 

анализ  хромосомного  набора  единичных  сперматозоидов  человека, 

основан на оплодотворении in vitro освобожденных от блестящей обо-

лочки яйцеклеток хомячка сперматозоидами человека и последующей 

визуализации хромосом мужского пронуклеуса [597, 770]. После об-

работки через 12–14 часов оплодотворенных яйцеклеток колхицином 

препараты фиксируют [536, 827] и дифференциально окрашивают.

С помощью этого метода удалось установить ряд принципиально 

важных сведений о частоте и спектре аномалий хромосом в мейозе у 

здоровых доноров, а также о влиянии различных факторов на сперма-

тогенез. В общей сложности от здоровых доноров в возрасте от 18 до 

65 лет проанализировано более 20 тысяч хромосомных комплементов 

зрелых сперматозоидов [451]. Трудоемкость, высокая себестоимость, 

необходимость  значительных  временных  затрат  существенно  лими-

тируют  возможности  широкого  применения  метода  гетерологичного 

оплодотворения. В настоящее время он утратил свою актуальность и 

используется в ограниченном числе центров.

Новый  импульс  исследованиям  в  этом  направлении  может  дать 

метод микроинъекции сперматозоидов человека в яйцеклетки — метод 

ICSI  (Intra  Cytoplasmic  Sperm  Injection)  (рис. 4.5).  Разработанный  

с  целью  лечения  мужского  бесплодия  этот  метод  с  успехом  приме-

няется  в  настоящее  время  и  для  исследования  хромосом  мужского 

пронуклеуса  после  оплодотворения,  осуществляемого  путем  инъек-

ции сперматозоида человека непосредственно в яйцеклетку лаборатор-

ной мыши [185, 193, 508]. Метод исключает селекцию спермиев по их 

оплодотворя ющей способности, что повышает вероятность детекции 

хромосомных аномалий (см. главу 5).

4.2.2.3.2. Метод FISH

Относительно  новым  прямым  методом  анализа  числовых  хромо-

сомных аномалий в зрелых сперматозоидах человека является метод 

гибридизации in situ. Преимущества метода заключаются в скорости 

анализа и масштабности исследования. Однако его возможности огра-

ничены регистрацией численных аберраций отдельных хромосом или 

их локусов, маркированных ДНК-зондами. Попытки изучения струк-

Цитогенетика эмбрионального развития человека

112

Рис. 4.5. Процедуры микроманипуляции для анализа хромосомного набора спермато-

зоидов с помощью внутрицитоплазматической инъекции сперматозоида человека в 

ооциты мыши (Intra Cytoplasmic Sperm Injection): а — надрезание блестящей оболоч-

ки ооцита мыши, б — иммобилизация сперматозоида, в — инъекция сперматозоида 

человека в ооцит мыши, г — метафазные хромосомы человека из мужского пронук-

леуса (слева) и метафазные хромосомы мыши из женского пронуклеуса (справа) (ок-

раска QFH/AcD)

а) 

б) 

в) 

г) 

113

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

турных аберраций были удачными лишь в одном исследовании [864]. 

Обычно  используется  мультиплексная  (двух-,  трехцветная)  FISH  c 

прицентромерными ДНК-зондами, которая позволяет отличить истин-

ную дисомию по какой-либо хромосоме от диплоидии [812].

Существенное значение для FISH-анализа сперматозоидов имеют 

как  способы  приготовления  препаратов  (деконденсация  хроматина  в 

головке  спермия),  так  и  условия  проведения  гибридизации.  Для  по-

вышения  эффективности  гибридизации  разработаны  различные  ва-

рианты деконденсации хроматина [407, 475, 617, 621, 791]. Одним из 

главных требований является сохранность морфологии сперматозои-

да, включая наличие хвоста после предгибридизационных обработок 

(рис. 4.6)

*

.  Разработаны  также  унифицированные  критерии  оценки 

гибридизационного сигнала [451, 674].

4.2.3. Молекулярно-генетические 

методы исследования мужского бесплодия

Геномные и сбалансированные хромосомные аберрации во многих 

случаях  сопровождаются  нарушениями  спермопродукции,  что  и 

является  причиной  мужского  бесплодия.  Многочисленные  исследо-

вания, проведенные в разных странах, показали, что аномалии кариотипа 

встречаются у 10–15

 

% мужчин с азооспермией, у 5–8

 

% — с олигозоо-

спермией [

526

]. Причиной азооспермии и олигозооспермии у мужчин 

с  нормальным  46,XY  кариотипом  могут  быть  геномные  и  хромо-

сомные мутации, обусловленные гонадным мозаицизмом (см. главу 6). 

Очевидно, что отсутствие сперматозоидов или их малочисленность не 

только в эякуляте, но и пунктатах и биоптатах семенника затрудняет 

проведение цитогенетических исследований зрелых мужских гамет и 

зачастую делает их принципиально невозможными. Как уже упоми-

налось  выше,  изменение  соотношения  незрелых  клеток  спермато-

генного  ряда  в  образцах  эякулята  или  пунктата/биоптата  семенника 

может лишь косвенно указывать на наличие хромосомных аномалий 

в  сперматогониях  и  сперматоцитах,  а  исследование  пахитенных 

хромосом и синаптонемных комплексов в профазе мейоза относится к 

разряду эксклюзивных методов анализа. С другой стороны, аномалии 

кариотипа, как и инфекционные болезни, являются причиной снижения 

фертильности  лишь  у  части  пациентов.  Поэтому,  учитывая  значи-

мость проблемы мужского бесплодия, особенно в случаях предполага-

* Рисунок на цв. вкл.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

114

емого использования единичных сперматозоидов для оплодотворения 

в программах вспомогательных репродуктивных технологий, предста-

вляется  целесообразным  рассмотреть  другие  методические  подходы, 

применение  которых  позволяет  установить  генетическую  природу 

нарушения ре продуктивной функции.

Так, известно, что 7–30

 

% случаев необструктивной азооспермии и 

тяжелой олигозооспермии обусловлены микроделециями эухромати-

нового района длинного плеча Y-хромосомы (Yq11) [228, 443, 470, 486, 

488, 730, 781, 891]. Впервые зависимость между нарушением сперма-

тогенеза  и  терминальной  делецией  длинного  плеча  Y-хромосомы 

была продемонстрирована еще в 1976 г. при цитогенетическом иссле-

довании 1160 мужчин с бесплодием [850]. Исследователи высказали 

предположение,  что  в  дистальном  участке  Yq11  располагается  ген 

(гены), необходимые для нормального сперматогенеза, так называемый 

«фактор  азооспермии» —  AZF.  В  начале  1990-х  годах,  благодаря 

построению  подробной  физической  карты  Y-хромосомы  на  основе 

ДНК-маркеров, стало возможным проведение рутинного микроделе-

ционного анализа района Yq11 с целью поиска последовательностей 

ДНК, влияющих на сперматогенез [839, 840]. Последующие работы 

с применением ПЦР-анализа ДНК позволили обнаружить в участке 

Yq11  три  локуса:  AZFа,  AZFb  и  AZFc,  делеции  которых  сопровож-

даются  нарушениями  сперматогенеза  различной  степени  тяжести 

[488].  В  каждом  локусе  был  идентифицирован  ген,  предположи-

тельно  являющийся  «фактором  азооспермии» —  DFFRY  (Drosophila 

Developmental gene Fast Facets) в AZFа, RBM (RNA-Binding Motif) в 

AZFb и DAZ (Deleted in Azoospermia) в AZFc [209, 230, 366, 417].

За  исключением  очень  редких  случаев  наследования  [291,  624, 

891], делеции в участке Yq11 возникают de novo в результате мутаций в 

клетках сперматогенного ряда, а возможно, и позже, на ранних стадиях 

развития эмбриона [388]. Носители делеции в большинстве своем бес-

плодны и, следовательно, могут передать аномалию потомству только 

с помощью методов вспомогательной репродукции. При этом потомок 

мужского пола с неизбежностью получит Y-хромосому, несущую деле-

цию, и будет иметь ту же или более тяжелую форму нарушения спер-

матогенеза [891].

Следует отметить, что локализация и частота микроделеций в ло-

кусах AZF (a, b, c) варьируют, однако наиболее часто при азооспер-

115

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

мии наблюдаются делеции в AZFc. Следовательно, чувствительность и 

специфичность микроделеционного анализа района Yq11 определяет-

ся используемыми ДНК-маркерами. Несмотря на опыт, накопленный 

во многих странах мира, существуют разногласия о расположении и 

спектре STS-маркеров вдоль Y-хромосомы. Между тем, на основании 

неоднократно подтвержденной специфичности некоторых из них, раз-

работано несколько тест-систем, эффективных для скрининга микро-

делеций в локусе AZF у пациентов с бесплодием.

Изучение корреляции между степенью нарушения сперматогенеза и 

микроделециями важно для понимания роли AZF. Однако пока попытки 

установления  специфичного  проявления  микроделеции  при  гистологи-

ческом  и  цитологическом  анализе  образцов  яичка  не  увенчались  успе-

хом. Результаты исследований противоречивы, однако некоторые законо-

мерности можно считать установленными. Так, делеции в AZFa обычно 

сопровождаются синдромом «только клетки Сертоли» типа I и в редких 

случаях —  тяжелым  гипосперматогенезом.  Делеции  в AZFc  вызывают 

нарушения  сперматогенеза  различной  степени  тяжести.  Делеции AZFb 

связывают с более тяжелыми аномалиями сперматогенеза, чем при деле-

ции AZFc. Показано, что в яичках примерно у 2/3 пациентов с делеция-

ми AZFc могут быть обнаружены зрелые сперматозоиды, а при делеции 

AZFb они, как правило, отсутствуют.

В среднем, при необструктивной азооспермии частота микроделеций 

составляет 15

 

%, а при тяжелой олигозооспермии — 6

 

% [443, 486, 488, 

730, 781, 891]. Интересно отметить, что делеции в AZF выявлены и у па-

циентов с нормозооспермией [317, 624, 716].

Естественно, что локус AZF — не единственный детерминант спер-

матогенеза. Блок сперматогенеза и стерильность могут быть следствием 

мутаций в гене CFTR (локус 7q21.1), в гене половой дифференцировки 

SRY (локус Yp11.1), в гене андрогенового рецептора (AR) (район Xq11-

q12) и других.

Так, известно, что мутации в гене CFTR, кодирующем трансмембран-

ный регуляторный белок, ответственный за транспорт электролитов, вы-

зывают симптомы муковисцидоза. Некоторые из известных более 900 му-

таций в этом гене приводят к непроходимости семявыводящих протоков 

и сопровождаются нарушениями сперматогенеза разной степени тяжести, 

часто без манифестации других признаков муковисцидоза [322, 365, 476].