Цитогенетика эмбрионального развития - часть 16

Цитогенетика эмбрионального развития человека

124

метафазе  первого  деления  дробления.  Объединение  двух  родительских 

наборов  хромосом  в  одно  клеточное  ядро  происходит  после  формиро-

вания  метафазной  пластинки  из  хромосом  материнского  и  отцовского 

пронуклеусов. Различная степень спирализации хромосом отцовского и 

материнского  пронуклеусов  (то  есть  гетероцикличность  родительских 

хромосом) позволяет не только установить плоидность оплодотворенной 

яйцеклетки, но и судить о происхождении гетероплоидии. К сожалению, 

подобные исследования были проведены только в эксперименте [378].

Прямых доказательств нерасхождения материнских хромосом во вто-

ром делении мейоза, основанных на анализе хромосом первого деления 

дробления  зиготы  у  человека,  не  получено.  Вместе  с  тем,  при  опреде-

лении родительского происхождения анеуплоидии у плодов человека и 

новорожденных  с  использованием  цитогенетических  и  ДНК-маркеров 

установлено, что около 20

 

% случаев анеуплоидии обусловлено нерасхож-

дением хромосом именно во втором делении созревания ооцита [449].

4.3.2.1. Метафаза II

Большинство данных, касающихся анализа хромосом в оогенезе у че-

ловека, получено на препаратах ооцитов, не оплодотворившихся в куль-

туре  in vitro  и  блокированных  на  стадии  MII  [535].  Анализ  литературных 

данных позволяет сделать вывод о высокой частоте хромосомных аберраций 

в МII ооцитах человека, которая варьирует от 4

 

% [386] до 58

 

% [897]. Значи-

тельная вариабельность полученных результатов может быть связана как с 

методами приготовления хромосомных препаратов, существенно влияющих 

на качество метафазных пластинок, так и с трудностями идентификации и 

подсчета конденсированных хромосом (рис. 4.10, 4.11). Нельзя не отметить и 

отсутствие унифицированного подхода к отбору ооцитов и метафазных плас-

тинок для анализа. Методы, применяемые для кариотипирования ооцитов 

на стадии МII, в принципе те же, что используются и для цитогенетического 

анализа дробящихся яйцеклеток и, по сути, представляют собой различные 

модификации классического варианта метода А. Тарковского [827].

4.3.2.2. второе полярное тельце

Образование  второго  полярного  тельца  (ВПТ)  стимулируется  оп-

лодотворением  или  агентами,  активирующими  партеногенетическое 

развитие. Хромосомы ВПТ претерпевают изменения, характерные для 

125

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

Рис.4.10. Хромосомы неоплодотворив-

шегося  ооцита  на  стадии  метафазы 

II.  Окраска  QFH/AcD:  а  —  кариотип 

23,Х; б — диплоидный ооцит (46,ХХ); 

в —  фрагмент  метафазной  пластин-

ки с преждевременно разошедшимися 

хроматидами (указаны стрелками)

 

а)  

б)

 

в) 

Рис.4.11.  Ооцит  на  стадии  мета-

фазы  II  (фрагмент  метафазной 

пластинки) и первое полярное тель-

це (слева). FISH с ДНК-зондом DXZ1, 

специфичным  к  прицентромерному 

району Х-хромосомы

Цитогенетика эмбрионального развития человека

126

стадий  анафазы  и  телофазы,  и  остаются  блокированными  на  стадии 

интерфазы. Поскольку ВПТ никогда не вступает в митоз, для анализа 

его хромосом используют молекулярные методы (FISH и ПЦР). С помо-

щью этих методов показано, что частота анеуплоидных ВПТ составляет 

около 25

 

% [725]. К настоящему времени опубликовано большое число 

работ с использованием этих методов для доимплантационной диагнос-

тики хромосомных и, в основном, моногенных болезней [756].

Более полное представление о частоте и спектре хромосомных 

аберраций,  возникающих  при  втором  делении  мейоза,  а  также  о 

влиянии  различных  факторов  на  хромосомный  аппарат  в  этот  пе-

риод созревания ооцита, может дать прямой хромосомный анализ 

ВПТ. Реальность такого подхода была продемонстрирована в ори-

гинальных  экспериментах  на  мышах  при  трансплантации  ВПТ  в 

цитоплазму зиготы [641]. В дальнейшем этот метод был с успехом 

применен для анализа хромосом ВПТ и у человека [874]. Высокока-

чественные хромосомные препараты получают путем слияния ВПТ 

с нормальной или энуклеированной зиготой мыши под действием 

электрического  импульса.  Полученные  таким  способом  хромосо-

мы  идентифицируют  с  помощью  стандартной  дифференциальной 

окраски  [415].  В  дальнейших  исследованиях  эти  авторы  успешно 

совместили  инъекцию  ВПТ  человека  в  цитоплазму  ооцита  мыши 

и электрошок. Метод оказался эффективным для получения мета-

фазных  хромосом  изолированного  ВПТ.  Он  нашел  практическое 

применение для прижизненного анализа материнского набора хро-

мосом в дробящемся зародыше человека как с помощью традицион-

ных,  так  и  молекулярно-цитогенетических  методов  хромосомного 

анализа  [872].  Подробно  с  техникой  приготовления  хромосомных 

препаратов  из  первого  и  второго  полярных  телец  можно  ознако-

миться в прекрасно иллюстрированной монографии Ю. Верлинско-

го и А. Кулиева [871].

Визуализация  хромосом  во  втором  делении  мейоза  может  быть 

достигнута с помощью окадаевой кислоты, которая индуцирует преж-

девременную  конденсацию  интерфазных  хромосом — Premature 

Condensation Of Chromosome (РСС) обоих пронуклеусов в оплодотво-

ренной яйцеклетке и ВПТ [57, 377, 378]. Именно этот подход позволил 

установить ряд важных сведений о поведении мейотических хромосом 

127

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

в оогенезе мышей-носительниц транслокации. В частности, были по-

лучены прямые доказательства существования механизма «предделе-

ния» и обнаружена предрасположенность отдельных хромосом к преж-

девременному разделению сестринских хроматид. Попытки примене-

ния окадаевой кислоты для проведения аналогичных исследований у 

человека оказались неудачными [378].

4.3.3. Перспективные методы

 анализа мейотических хромосом

Сравнительно  недавно  разработаны  методы,  позволяющие  про-

водить прямой анализ сегрегации хромосом в мейозе. Созревающие 

или блокированные на стадии MII ооциты обрабатывают антителами 

к  тубулину  (белку  митотического  веретена).  Иммунофлуоресценция 

антитубулина  при  сочетании  с  окрашиванием  хромосом  позволяет 

проследить их поведение [206, 393], а также проводить прижизненные 

наблюдения за преобразованиями веретена [626]. С помощью этих ме-

тодов возможен анализ ориентации хромосом на стадиях прометафазы 

и метафазы первого деления мейоза и регистрация отставания гомо-

лога или ошибок расхождения гомологичных хромосом (рис. 4.12)

*

. У 

млекопитающих, ооциты которых способны к развитию со стадии дик-

тиотены до метафазы II в условиях in vitro, принципиально возможен 

анализ клеточного цикла, а также специфических для каждой стадии 

изменений экспрессии генов [371].

Аналогичных  методов  для  исследования  сперматогенеза  до  сих 

пор не предложено. В качестве перспективных можно назвать имму-

нофлуоресцентный метод для анализа процессов конъюгации и реком-

бинации (рис. 4.13)

*

, а также методы культивирования сперматоцитов 

на подложке из сертолиподобных клеток [580] и в яйцеклетке [216]. 

Последние два подхода могут дать принципиально новые сведения об 

особенностях  клеточных  циклов  элементов  сперматогенного  ряда  и 

другие  данные,  важные  для  понимания  многих  аспектов  созревания 

мужских гамет.

Таким  образом,  исследования  гаметогенеза  позволяют  проводить 

прямой анализ хромосом как в женском, так и в мужском мейозе. Раз-

работаны и применяются на практике методы прижизненного анализа 

* Рисунок на цв. вкл.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

128

хромосомного  набора  зрелых  гамет.  Однако  большинство  подходов 

основано на фиксации исследуемого материала, поэтому исчерпыва-

ющая информация о частоте и спектре хромосомных аберраций, а так-

же о механизмах их возникновения, дает лишь ориентировочное пред-

ставление о судьбе зиготы с хромосомными нарушениями.

4.4. Методы исследования

 хромосом в раннем эмбриогенезе 

Сведения о хромосомном анализе эмбрионов человека в первых деле-

ниях дробления крайне ограниченны. У человека, как и у других млеко-

питающих, в метафазе первого деления дробления родительские наборы 

хромосом обнаруживают гетероцикличность. При этом хромосомы муж-

ского  пронуклеуса  менее  спирализованы  и,  соответственно,  удлинены, 

тогда как женского — заметно укорочены [57]. Это позволяет достаточно 

точно  определить  родительскую  принадлежность  хромосомных  анома-

лий. Начиная с 2-клеточной стадии, анализ мейотического нерасхождения 

родительских хромосом едва ли возможен. Во-первых, различия в кон-

денсации родительских хромосом нивелируются уже при втором делении 

дробления, что не позволяет установить происхождение анеуплоидии. Во-

вторых, нерасхождение или утрата хромосом могут быть обусловлены их 

аномальной сегрегацией при митотическом делении. По понятным при-

чинам частота и типы хромосомных аберраций на этих стадиях эмбрио-

генеза человека практически не изучены. Исключение составляют только 

ошибки оплодо творения, связанные с возникновением триплоидных или 

гаплоидных зародышей (см. ниже).

Рассматривая цитогенетические аспекты раннего эмбриогенеза чело-

века  важно  учитывать  следующие  обстоятельства.  Классический  цито-

генетический подход основан на анализе достаточного количества мета-

фазных пластинок. Работы по стандартному кариотипированию ранних 

зародышей человека немногочисленны и выполнены, в основном, на за-

родышах, имевших три пронуклеуса, то есть являющихся триплоидными 

и, соответственно, не пригодными для трансплантации [856]. При этом, 

как отмечают некоторые авторы [409, 703], не более 8

 

% метафазных плас-

тинок  нормально  дробящихся  зародышей  удовлетворяют  требованиям 

цитогенетического анализа. В связи с низким качеством или отсутствием 

метафазных пластинок практически невозможен и традиционный анализ 

129

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

зародышей, остановившихся в развитии на стадии нескольких клеток или 

подвергшихся фрагментации. Поэтому подавляющее большинство иссле-

дований проведено с использованием мультиплексной FISH на интерфаз-

ных ядрах бластомеров 8–10-клеточных эмбрионов [331] (рис. 4.14)

*

. Од-

нако мультиплекс ная FISH основана на маркировании некоторых локусов 

отдельных хромосом и поэтому не дает полной информации о числе и 

структуре всех хромосом набора. Другие молекулярно-цитогенетические 

методы (PRINS, CGH, SKY), а также различные варианты ПЦР, недоста-

точно информативны для корректной оценки кариотипа эмбриона по еди-

ничным бластомерам [654].

4.5. Методы исследования хромосом

 в постимплантационном периоде 

Помимо  аутопсийного  материала  от  медицинских  и  спонтанных 

абортусов,  доступными  для  изучения  хромосомных  аномалий  у  эм-

брионов  человека  постимплантационных  стадий,  являются  образцы 

тканей,  полученные  при  помощи  инвазивных  методов  (см. главу 9). 

Последние практически безопасны для матери и плода и широко при-

меняются  в  I  и  II  триместрах  беременности  с  целью  пренатальной 

(дородовой)  диагностики  наследственных  и  врожденных  болезней. 

Объектами цитогенетических исследований являются образцы плод-

ных оболочек (хориона и плаценты), клетки амниотической жидкости 

и лимфоциты пуповинной крови плода. Все эти ткани и клетки имеют 

разное эмбриональное происхождение (см. главу 1).

Уместно  напомнить,  что  хорион,  возникающий  из  трофобласта, 

внезародышевой  эктодермы  и  внезародышевой  мезодермы,  является 

внешней оболочкой зародыша (рис. 1.6). Обособление от внутренней 

клеточной массы (ВКМ) и дифференцировка трофобласта происходят 

на стадии ~ 32 клеток. К моменту имплантации (5–7-й день) трофо-

бласт состоит из двух типов клеток — цитотрофобласта, окружающего 

зародыш и образующего первичные ворсины в области имплантацион-

ного поля, и синцитиотрофобласта, который формирует их наружный 

слой и представляет собой симпласт. На 13–14-й день формируются 

вторичные ворсины, при этом цитотрофобластические выросты запол-

няются  мезенхимой,  происходящей  из  внезародышевой  мезодермы. 

* Рисунок на цв. вкл.

Цитогенетика эмбрионального развития человека

130

Третичные ворсины, образующиеся к 5–7-й неделе, характеризуются 

наличием кровеносных сосудов. По мере развития ворсины хориона 

приобретают ветвящуюся структуру (рис. 1.14).

Таким образом, сформированный ворсинчатый хорион представляет 

собой активно растущую и дифференцирующуюся ткань, образованную 

клетками  различного  происхождения  (рис. 1.6).  Митотической  актив-

ностью обладают клетки цитотрофобласта (клетки Лангханса), которые 

концентрируются на вершинах и у основания ворсин в местах их ветв-

ления. Возникновение новых разветвлений (рамификация) происходит с 

различной интенсивностью на протяжении всей жизни плаценты. Про-

цесс старения хориона сопровождается исчезновением клеток цитотро-

фобласта, которые служат источником образования синцития [186].

Амнион является внутренней оболочкой зародыша и является про-

изводным первичной эктодермы. Дифференцировка амниона происхо-

дит на 7,5–8-й день развития (см. главу 1, рис. 1.8, 1.16). Амниотичес-

кая полость быстро увеличивается и после сращения серозной (амни-

отической) оболочки с хорионом формирует единую оболочку (амни-

охорион). Околоплодные воды, которыми заполняется амниотическая 

полость, выполняют роль буфера, предохраняющего эмбрион, а затем 

и  плод,  от  внешних  воздействий.  В  амниотической  жидкости  (АЖ) 

содержатся  эпителиальные  клетки  внутренней  стенки  амниона  (так 

называемые амниоциты), дыхательных, пищеварительных, мочеполо-

вых путей и эпидермиса плода [694]. Качественный и количественный 

состав  клеток  АЖ  имеет  индивидуальную  вариабельность.  Большая 

часть их нежизнеспособна, особенно после 20-й недели беременности. 

Концентрация  жизнеспособных  клеток  АЖ  максимальна  на  16–20-й 

неделе беременности [67].

Таким образом, хорион, дающий начало плаценте, и амнион обо-

собляются от ВКМ на ранних этапах эмбриогенеза. Цитотрофобласт 

хориона, будучи производным трофэктодермы, имеет внезародышевое 

происхождение, тогда как амнион, формирующийся из первичной экто-

дермы, является производным зародышевой структуры. Эмбриональ-

ное происхождение имеют и все другие типы эпителиальных клеток, 

взвешенных в АЖ. Эти особенности происхождения провизорных ор-

ганов эмбриона имеют принципиально важное значение для интерпре-

тации результатов, полученных при исследовании образцов плодных 

оболочек с целью пренатальной диагностики хромосомных болезней.

131

Глава 4. 

современные подходы к анализу мутаций

4.5.1. Клетки хориона (плаценты)

Первые попытки получения образцов хориона в первом триместре 

беременности  с  применением  эндоскопической  техники  были  пред-

приняты в 1960–1970-е годы и проведены перед медицинским абортом 

[554, 642]. Первые массовые исследования хориона в целях диагнос-

тики пола плода по половому хроматину были осуществлены в Китае 

[423]. Однако значительное число послеоперационных осложнений и 

проблемы с получением хромосомных препаратов свидетельствовали 

против  применения  хорионбиопсии  в  диагностических  целях  [428, 

454].  Повторный  интерес  к  хорионбиопсии  был  связан  с  совершен-

ствованием инструментальных методов и ультразвуковых приборов, а 

также с появлением новых подходов в пренатальной диагностике на-

следственных болезней [164, 540].

Трансцервикальная хорионбиопсия с помощью щипцов не нашла 

широкого применения и, насколько нам известно, у нас в стране вы-

полняется только в одном центре [25]. Распространенным в середине 

1980-х годов был метод трансцервикальной аспирации ворсин хорио-

на при помощи гибкого катетера [427]. Последней модификацией био-

псии  хориона  явилась  трансабдоминальная  аспирационная  биопсия 

[269]. Неоспоримые преимущества этого метода (минимальный пере-

чень противопоказаний для манипуляции и низкая частота послеопе-

рационных осложнений, высокая эффективность получения материала 

и возможность использования в любой срок беременности) определи-

ли его ведущее место в пренатальной диагностике.

Независимо от способа получения образец хориона должен быть 

тщательно проанализирован при помощи лупы или инвертированного 

микроскопа с целью отбора типичной для хориона или плаценты тка-

ни и оценки количества биоптата. Морфологический контроль имеет 

особенно большое значение, если для дальнейшего анализа предпола-

гается использование молекулярно-генетических методов или культи-

вирования. Строгие критерии отбора ворсин значительно сокращают 

вероятность контаминации и не столь существенны для приготовления 

препаратов спонтанных митозов.

Для хромосомного анализа по клеткам хориона или плаценты ис-

пользуют два основных подхода — длительное культивирование в мо-

нослойной культуре и так называемый «прямой», исключающий под-

держание клеток в условиях in vitro.