Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция

Значительную роль в регуляции изменения генной экспрессии в клетках
растений  при  стрессе  отводят  АБК,  уровень  которой  в  этих  условиях
обычно  значительно  возрастает [Busk, Pages; Leung, Geraudat, 1998;
Cohen et al., 1999], что,  вероятно,  способствует,  с  одной  стороны,
снижению активности метаболических процессов в клетках, в частности
тотального синтеза белка [Блехман, 1987; Hurkman, Tanaka, 1987; 1996;
Sugino et

al., 1999] и индукции новообразования более десятка

стрессовых белков – с другой [Hughes, Dunn, 1996; Bewley, 1997: Leung,
Giraudat, 1998; Busk, Pages, 1998; Deleu et al., 1999; Cohen et al., 1999].

Напомним, что, наряду с синтезом стрессовых белков в

неблагоприятных  условиях,  а  также  при  обработке  экзогенной  АБК,
происходит усиление синтеза ряда присущих норме белков [Ramagopal,
1987; Singh et al., 1987; Robertson et al., 1994; Amitai-Zeigerson et al.,
1995; Hurkman, Tanaka, 1996; Chai et al., 1998]. Можно  предположить,
что  к  таким  белкам, «сопровождающим»  стрессовые  белки  в  ответных
реакциях растений пшеницы на повреждающие воздействия относится и
АЗП.  В  пользу  этого  свидетельствуют  данные  об  АБК-зависимом
существенном  накоплении  АЗП  в  корешках  проростков  пшеницы  при
воздействии  осмотического  шока  и  засухи [Cammue et al.,1989], в
проростках  в  ответ  на  засоление  среды  [Шакирова  и  др., 1993;
Шакирова,  Безрукова, 1998], в  культуре  клеток  при  тепловом  шоке
[Shakirova et al., 1996], а  также  в  развивающихся  при  дефиците  влаги
зерновках  пшеницы [Singh et al., 2000], что  позволяет  рассматривать
лектин  пшеницы  в  качестве  участника  в  АБК-контролируемых
неспецифических защитных реакциях.

Сравнительный анализ АБК и АЗП при гипертермии. Повышенная
температура – один из наиболее распространенных неблагоприятных
факторов

среды,

оказывающих

повреждающее

действие

на

растительный организм. Многочисленные данные показывают, что
температурный стресс вызывает синтез БТШ, играющих протекторную
роль в клетках растений [Блехман, 1987; Neumann et al.,1989; Кулаева и
др., 1991; Robertson et al., 1994; Singla et al., 1997; Basha et al., 1999],
хотя далеко не все из них идентифицированы.

В отличие от вышеупомянутых белков АЗП является

конститутивным  белком,  хотя,  как  обсуждалось  выше,  его
количественный  уровень  подвергается  значительным  флуктуациям  в
растениях  пшеницы  не  только  в  ходе  онтогенеза,  но  и  при  патогенезе.
Для  исследования  участия  лектина  в  ответных  реакциях  на  тепловой
шок были использованы каллусные клетки пшеницы.

100

Результаты,

приведенные

на

рис. 27,

показывают,

что

инкубированные при 40

С каллусы испытывали сильный тепловой шок,

что  выражается  в  многократном  транзитном  накоплении  АБК  с
максимумом в 9 ч. Спустя 9-часовой лаг-период гипертермия вызывала
сильное повышение уровня АЗП в клетках, который к 18 ч экспозиции
почти на порядок превышал контрольное значение. Характер изменений
в  содержании  этих  соединений  может  указывать  на  возможность
участия  АБК  в  усилении  синтеза  лектина  в  клетках.  Действительно,
культивирование  каллусных  клеток  в  течение 18 суток  на  среде,
содержащей 10 мг/л АБК, приводило к повышению концентрации АЗП
в  клетках  до 22,2 мкг/г,  тогда  как  в  контроле  она  составляла 3,6 мкг/г
[Шакирова и др., 1995].

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Время, ч

АБ

нг

/г

сы

ой

ссы

АЗП

мкг

/г

рой

ссы

АБК, к

АБК, t

АЗП, к

АЗП, t

Рис. 27. Влияние гипертермии (40

C) на динамику уровня АБК и лектина

в каллусных клетках, полученных из незрелых зародышей пшеницы сорта
Безенчукская 139

По-видимому, выявление столь значительного накопления

лектина  при  гипертермии,  указывающее  на  вовлечение  его  в  ответные
реакции  клеток  пшеницы  на  данный  стресс,  было  возможно  именно
благодаря  использованию  каллусной  культуре  клеток.  Следует
отметить, что значительная индукция синтеза лектиноподобного белка в
условиях  теплового  шока  показана  также  на  суспензионной  культуре
клеток  Dolichos biflorus [Spadoro-Tank, Etzler, 1988], позволившая
авторам  предположить  его  участие  в  защитных  механизмах  клеток  к
этому стресс-фактору.

101

Сравнительный  анализ  АБК  и  АЗП  при  засолении.  Засоление  также
относится  к  числу  распространенных  неблагоприятных  условий
окружающей  среды,  приводящих  к  снижению  интенсивности
интегральных физиологических процессов в растениях [Удовенко, 1979;
Строгонов, 1973; Блехман, 1987; Sugino et al., 1999; Nhiri et al., 2000].
Безусловно,  растительные  организмы  вырабатывают  в  ответ  на  это
воздействие  разнообразные  защитные  механизмы,  среди  которых
важное  место  отводят  сдвигу  в  белковом  спектре:  на  фоне  снижения
тотального  синтеза  белка  наблюдается  новообразование  ряда  пептидов
[Ramagopal, 1987; Tabaci-Aghdaci et al., 2000], а также усиление синтеза
некоторых  белков,  характерных  для  нормы [Singh et al., 1985; 1987;
Ramagopal, 1987; Amitai-Zeigerson et al., 1995; Hurkman, Tanaka, 1987;
1996; Hernandes et al., 2000].

Воздействие 2 %-го NaCl вызывает уже через 2 часа двукратное

накопление  АЗП  в  корнях  проростков  пшеницы  и  к 7 ч  наблюдается
пятикратное  возрастание  содержания  этого  белка  (рис. 28).  Причем
максимуму  накопления  лектина  в  корнях  также  предшествует
обратимое  увеличение  уровня  АБК.  Приведенные  данные  четко
демонстрируют  факт  довольно  значительного изменения в содержании

Время, ч

АБ

нг

/орган

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

АЗП

нг

/орган

АБК, К

АБК, NaCl

АЗП, К

АЗП, NaCl

Рис. 28. Динамика содержания АБК и АЗП в корнях 4-суточных
проростков пшеницы сорта Московская 35 под влиянием засоления среды

102

лектина при солевом стрессе, что свидетельствует о вовлечении его в
формирование быстрых АБК-регулируемых ответных реакций
проростков пшеницы на это воздействие.

Действительно, засоление среды вызывает быстрое накопление

АБК [Montero et al., 1994], которое  может  привести  к  существенному
сдвигу  в  белковом  спектре  клеток  растений,  в  частности  балансе
стрессовых  и  отдельных  обычных  белков,  участвующих  в
формировании  защитных  реакций  растений  в  ответ  на  данный
стрессовый фактор [Singh et al., 1987; Ramagopal, 1987; Amitai-Zeigerson
et al., 1995; Ishikawa et al., 1995; Chai et al., 1998]. Таким образом, лектин
пшеницы  можно  отнести  к  «реактивным»  белкам,  уровень  которого
существенно и довольно быстро может накапливаться в растениях при
засолении.

В начале этой главы мы обсуждали особенности синтеза АЗП, к

которым  можно  отнести  наличие  пула  запасных  лектиновых  мРНК  и
пробелков АЗП в клетках пшеницы. Не исключено, что столь быстрое и
значительное  вызванное  засолением  повышение  уровня  лектина
пшеницы, по крайней мере в первые часы от начала воздействия NaCl,
может  происходить  за  счет  образования  этого  белка  на  ранее
синтезированных  матрицах,  а  возможно,  и  за  счет  мобилизации  его
сборки из предшественников субъединиц. Для выяснения этого вопроса
был использован ингибиторный анализ.

Уровни  регуляции  накопления  лектина  в  проростках  пшеницы  при
засолении. В качестве ингибитора транскрипции многие исследователи
часто  используют  кордицепин,  который  эффективно  подавляет  не
только синтез РНК, но и полиаденилирование мРНК [Glazer, 1976]. Для
оценки  ингибиторной  активности  кордицепина  (КЦ)  на  синтез  РНК  в
клетках  пшеницы  in vivo  был  использован  метод  фракционирования
РНК

в 6

%-м

полиакриламидном

геле

последующей

авторадиографией, который показал, что 50

мг/л КЦ подавляет

включение

C-уридина в РНК более чем на 70 %.

Исследование совместного влияния засоления и КЦ на динамику

содержания  АЗП  проводили  на  интактных  проростках  пшеницы  сорта
Саратовская 29 (рис. 29а). Эти данные демонстрируют заметное отличие
в  характере  индуцированного  засолением  накопления  лектина  по
времени  и  уровню  от  данных,  приведенных  на  рис. 28,  вероятно,
связанное  с  различием  использованных  в  опытах  двух  разных
модельных систем (корни проростков, которые, судя по данным Raikhel
et al.  [1984],  являются  одним  из  главных  мест  синтеза  и  локализации

103

лектина в вегетирующих растениях, и целые проростки) двух разных
сортов мягкой яровой пшеницы.

100

120

140

160

Время, ч

АЗ

, %

от

конт

рол

NaCl

Циклогексимид
+ NaCl

100

150

200

250

8,5

Время, ч

АЗ

, %

от

конт

рол

NaCl

Кордицепин
+ NaCl

Контроль

Рис. 29. Влияние кордицепина (а) и циклогексимида (б) на
индуцированное 2 %-м NaCl накопление АЗП в интактных проростках
пшеницы сорта Саратовская 29

104

Значительное увеличение в уровне АЗП в интактных проростках в

сравнении  с  контролем  вызывает 2 %-й NaCl, причем  присутствие  в
среде  КЦ  не  препятствует  индукции  этого  процесса  в  течении  первых
8,5 ч, после чего уровень АЗП резко снижается [Безрукова, 1997]. Ранее
с использованием  КЦ  наличие  запасных  форм  лектиновых  мРНК  было
показано  в  прорастающих  зародышах  пшеницы [Peumans, Stinissen,
1983],  тогда  как  результаты  этих  опытов  указывают  на  существование
пула  резервных  лектиновых  мРНК  также  и  в  проростках  пшеницы,
которые  могут  служить  матрицами  для  синтеза  новых  молекул  АЗП  в
чрезвычайных  ситуациях,  например  при  воздействии  стрессовых
факторов среды.

Важно отметить, что индуцированное экзогенной АБК

(в обычных  условиях)  накопление  АЗП  в  корнях  проростков  также
некоторое  время  может  быть  независимым  от  транскрипции,  что
выявлено  с  использованием  КЦ  [Шакирова  и  др., 2000б],  и,  вероятно,
это  может  указывать на участие эндогенной АБК, содержание которой
при  засолении  существенно  возрастает,  в  регуляции  повышения
содержания лектина не только за счет индукции экспрессии гена АЗП и
усиления  синтеза  лектиновых  мРНК,  но  и  за  счет  ранее
синтезированных мРНК АЗП.

В начале этой главы были приведены данные, свидетельствующие

о  том,  что  в  ходе  своего  синтеза  АЗП  претерпевает  сложный
посттрансляционный  процессинг,  этапы  которого  были  прослежены  с
использованием  полученных  к  предшественникам  АЗП  антител,  не
преципитирующих зрелый белок [Mansfield et al., 1988], поэтому можно
думать,  что  антитела  к  зрелому  АЗП преимущественно узнают именно
его,  тогда  как  гликозилированные  предшественники  не  узнаются  ими
как  АЗП.  Это  послужило  основанием  для  проведения  опытов  по
выяснению  возможности  в  условиях  засоления  регуляции  накопления
лектина  в  проростках  пшеницы  также  и  за  счет  ускорения  созревания
его предшественников, т.е., на посттрансляционном уровне.

С использованием циклогексимида, который в концентрации

10 мг/л  за  один час  подавляет  синтез  тотального  белка  почти  на 90 %,
было  выявлено,  что  в  течение  первых 4 часов  индуцированное
засолением  накопление  АЗП  наблюдается  в  условиях  выключенной
трансляции и не зависит от новообразования лектина (рис. 26б). Таким
образом, вызванное засолением увеличение содержания лектина может
происходить за счет ранее синтезированных предшественников.

Следовательно,

количественные

изменения

лектина

вегетирующих растениях пшеницы при стрессовых воздействиях могут
контролироваться

не

только

на

транскрипционном,

но

105

посттранскрипционном и посттрансляционном уровнях. Такая ситуация
вполне  возможна,  поскольку  лектин  пшеницы  является  присущим  для
растений  на  протяжении  всего  онтогенеза  и,  скорее  всего,
определенный  резерв  лектиновых  мРНК  и  предшественников  АЗП
всегда  присутствует  в  клетках,  что  еще  раз  указывает  на  жизненную
важность  этого  белка  для  растений  пшеницы.  Наличие  разных  путей
регуляции количественного уровня АЗП, включая индукцию экспрессии
его  гена,  а  также  накопление  этого  белка  в  корнях  проростков  в
присутствии  ингибиторов  транскрипции  и  трансляции  выявлены  для
АБК [Шакирова и др., 2000б]. Поэтому можно предполагать, что стресс-
индуцируемое  накопление  АБК  является  лимитирующим  в реализации
разных уровней регуляции повышения лектина в растениях пшеницы в
стрессовых условиях.

Однако, к сожалению, мы не располагаем пока прямым

доказательством  участия  эндогенной  АБК  в  регуляции  вызванного
засолением  накопления  АЗП,  так  же,  вероятно,  как  и  другими
неблагоприятными факторами. Для этой цели может служить ингибитор
синтеза  АБК  флуридон,  использование  которого  позволило  четко
продемонстрировать  необходимость  этого  гормона  в  накоплении
лектина  в  корешках  проростков  пшеницы  при  воздействии  засухи  и
осмотического шока [Cammue et al.,1989].

Суммируя приведенные в этой главе материалы, можно

заключить,

что

стресс-индуцированному

накоплению

АЗП

предшествует  увеличение  уровня  АБК,  которая  участвует  в  регуляции
синтеза  и  содержания  лектина  в  вегетирующих  растениях  пшеницы  в
стрессовых  ситуациях.  Важно  подчеркнуть,  что  обнаруженные
закономерности проявляются в ответ на такие разные воздействия, как
грибной

патогенез,

обработка

препаратами,

повышающими

устойчивость к грибным болезням, засуха и осмотический шок,
засоление, гипертермия и дефицит влаги, что позволяет отнести их к
неспецифическим защитным реакциям пшеницы.

Вместе с тем если защитная функция АЗП в растениях пшеницы в

ходе  грибного  патогенеза  в  связи  с  его  сродством  к  мономеру  и
олигомерам хитина вполне понятна, то участие его в ответных реакциях
на воздействие абиотических стрессовых факторов объяснить сложнее.
Поскольку  ген  АЗП,  как  и  гены  ряда  стрессовых  белков  с  четко
выраженными  защитными  свойствами,  в  частности,  относящимися  к
группе LEA, является rab геном, индукция которого регулируется АБК,
можно  предположить,  что  лектин  включается  в  АБК-контролируемую
антистрессовую программу, и в этом случае АЗП можно рассматривать

106

как бы в качестве сопровождающего стрессовые белки и своеобразного
маркера развития защитных реакций.

В то же время этот белок, резкое накопление которого происходит

при  разных  неблагоприятных  ситуациях,  может  иметь  большое
значение  для  ослабленных  в  этих  условиях  растений  пшеницы,
поскольку  он  является  экскретируемым  белком,  и,  выделяясь  в
корневой  чехлик  и  наружную  среду,  может  предохранять  ризосферу,
например,  от  возможной  почвенной  инфекции.  Кроме  того,  в  связи  со
способностью  выделяться  в  окружающую  среду  нельзя  исключить  его
участия в усилении при стрессе регенерации меристематической ткани
корней,  митотическая  активность  которой  чутко  реагирует  на
изменения внешних условий существования.

Об этом могут свидетельствовать данные об активации под

влиянием  экзогенного  АЗП  деления  клеток  меристематической  зоны
корней,  объема  клеток,  как  и  в  целом  размера  и  массы  проростков
пшеницы  [Безрукова  и  др., 2000]. Более  того,  этими  же  авторами
получены данные о предотвращении под влиянием предобработки АЗП
вызванного  засолением  среды  падения  митотического  индекса
меристематических  клеток  корней  проростков.  Безусловно,  все  это
указывает на интригующую роль лектина в жизни растений пшеницы и
ставит вопрос о ее дальнейшем изучении.

Ряд результатов, представленных в данной главе, получен при финансовой

поддержке РФФИ, гранты № 01-04-48483 и № 00-15-997899.

107

ЛАВА

6. ФИТОГОРМОНЫ СТЕРОИДНОЙ ПРИРОДЫ,

ПОВЫШАЮЩИЕ УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ

Давно существовало мнение, что ауксины, цитокинины,

гиббереллины, АБК и этилен не исчерпывают весь набор фитогормонов
в природе. По аналогии с гормонами животных, можно было ожидать,
что  будут  найдены  новые  группы  фитогормонов  пептидной  и
стероидной  природы  [Кулаева, 1982]. Сейчас  уже  получено  немало
экспериментальных  доводов  в  пользу  существования  в  растениях
пептидов, претендующих на роль фитогормонов [Муромцев, Данилина,
1996; Gehring, 1999], и  прежде  всего  это,  вероятно,  относится  к
системину [Jacinto et al., 1999; Schaller, 1999; Ryan, 2000].

Высвобождаясь

из

мест

поранения

листьев

томата,

18-аминокислотный  олигопептид  системин,  может  транспортироваться
по  растению  и  вовлекаться  в  системную  сигнальную  трансдукцию  в
ответ  на  это  повреждение.  По  аналогии  с  пептидными  гормонами
животных  системин  синтезируется  из  предшественника  просистемина
при  участии  протеаз.  Механизмы  регуляторного  действия  системина
интенсивно  изучаются;  так,  он  включается  в  системную  регуляцию
синтеза  более 20 защитных  генов  в  растениях  томата [Ryan, 2000] в
ответ  на  повреждение  разнообразными  вредителями,  патогенами,
поранением  или  абиотическими  стрессовыми  факторами,  причем  при
индукции  экспрессии,  например  гена  LapA  системин  действует
синергически  с  АБК,  тогда  как  в  сигнальную  индукцию  других  генов
включается  метилжасмонат,  этилен  и  другие  регуляторы  роста [Chao
et al., 1999].

Однако, если в отношении функциональной значимости для

растений предполагаемых гормонов пептидной природы в принципе
еще много вопросов, то в отношении стероидов их можно считать
вполне решенными.

Впервые информация о ростстимулирующей активности

липидной  фракции,  выделенной  из  пыльцы  рапса  (Brassica napus),
которая  проявлялась  в  стимуляции  роста  в  длину  второго  междоузлия
фасоли  (типично  гиббереллиновый  эффект)  одновременно  с  его
искривлением,  разбуханием  и  растрескиванием  (особый  ответ),
появилась в работе Mitchell et al. [1970]. Позднее из липидной фракции
пыльцы  рапса  было  выделено  кристаллическое  вещество  стероидной
природы,  получившее  название  брассинолид  (БР),  установлены  его
структурная формула и молекулярное строение [Grove et al., 1979].

108

В настоящее время в растениях идентифицировано более 40

близких к БР стероидов, различающихся по структуре и уровням
биологической

активности,

из

которых

более 30 хорошо

охарактеризованы,  включая  два  конъюгата [Sakurai, Fujioka, 1993;
Creelman, Mullet, 1997; Khripach et al., 2000]. Все  эти  соединения
объединены в одну группу природных полиоксистероидов, получившую
название  брассиностероиды  (БС),  представляют  собой  производные
5-

α-холестана и характеризуются структурным сходством со

стероидными гормонами животных эстрогена, тестостерона, экдизона
[Mandava, 1988; Sakurai, Fujioka, 1993; Хрипач и др., 1995; Sasse, 1997;
Altmann, 1999; Bishop, Yokota, 2001].

БС являются характерными соединениями для всего царства

растений [Sakurai, Fujioka, 1993; Adam, Petzold, 1994; Yokota et al., 1994;
Sasse, 1997]. За  исключением  корней,  в  которых  БС  пока  не
детектируются  биохимически,  они  обнаруживаются  почти  из  всех
органах растений, но относительно высокий уровень БС регистрируется
(от 5 до 190 нг/г  сырой  массы)  в  генеративных  органах [Creelman,
Mullet, 1997; Altmann, 1999]. О способности  БС  к  дистанционному
транспорту  по  растению  свидетельствуют  данные  о  транслокации
экзогенных  меченных  БС  из  корня  в  побег  в  рисе,  огурце  и  пшенице,
скорее  всего,  с  ксилемным  соком [Sasse, 1997; Bishop, Yokota, 2001].
Пока  мало  известно  о  тканеспецифичности  БС  и  их  субклеточной
локализации [Altmann, 1999].

На сегодняшний день имеются многочисленные данные,

свидетельствующие о разнообразии проявлений физиологических
эффектов брассиностероидов на различные растительные организмы,
которые

включают

сведения

об

их

ярко

выраженном

ростстимулирующем,  а  также  защитном  действии  по  отношению  к
широкому  спектру  неблагоприятных  воздействий,  что  позволяет
рассматривать  их  в  качестве  очень  эффективных  и  многообещающих
эндогенных регуляторов роста и развития растений. Подробный анализ
таких  работ  приведен  в  обзорах  Хрипача  и  др.[1995],  Кораблевой  и
Платоновой [1995], Прусаковой  и  Чижовой [1996], Altmann [1999], а
также Khripach et al. [2000]. Всестороннему обсуждению этих данных и
посвящена настоящая глава работы.

Механизмы действия брассиностероидов

Ростстимулирующая активность брассиностероидов. Освоение
химического синтеза БС и их аналогов в количествах, необходимых для

109

биологических исследований, способствовало появлению работ,
посвященных изучению механизмов их действия и возможных функций
в

растении.

Ярко

выраженный

ростстимулирующий

эффект

брассиностероидов  был  выявлен  уже  с  момента  их  открытия,  поэтому
естественным  было  исследование  их  действия  в  тест-системах  для
«классических» фитогормонов. Хотя в ряде специфичных для ауксинов,
гиббереллинов, цитокининов и этилена биотестах они проявляли очень
высокую активность [Yopp et al., 1981; Mandava et al., 1981; Arteca et al.,
1983; Takematsu et al., 1982; Katsumi, 1985; Wada et al., 1985], в других –
не  оказывали  действия  или  даже  имели  противоположный  эффект
[Mandava et al., 1981; Yopp et al., 1981; Sala, Sala, 1985; Eun et al., 1989].
Причем,  во  всех  исследованных  биотестах  БС  были  активны  в
чрезвычайно  низких  концентрациях (10

-6

–10

-12

М) [Sakurai, Fujioka,

1993], что отличает их не только от регуляторов субстратного действия,
но и от других групп фитогормонов.

Необходимо отметить, что при анализе ростстимулирующего

действия  БС  на  растительные  организмы  встречается  много
противоречивых  данных  [Прусакова,  Чижова, 1996], что,  скорее  всего,
связано  с  различием  чувствительности  растительных  объектов,
действующих концентраций разных БС, сроками обработки и, наконец,
структурой  самих  БС [Khripach et al., 2000]. Например,  при  изучении
действия  разных  по  структуре  БС  на  прирост  биомассы  и  активность
метаболизма  клеток  хлореллы  был  выстроен  ряд  БС  по  их
биологической  активности:  брассинолид > 24-эпибрассинолид >
гомобрассинолид > кастастерон > 24-эпикастастерон > гомокастастерон
[Baigus, Czerpak, 1998]. Действительно,  при  анализе  многочисленных
данных  по  активности  БС  в  биотестах  максимальной  активностью
характеризуется  брассинолид,  однако  в  полевых  опытах –
24-эпибрассинолид и 28-гомобрассинолид, и именно эти БС считаются
наиболее  эффективными  для  практического  использования [Khripach
et al., 2000].

Для

выявления

ростстимулирующего

действия

брассиностероидов  используют  специфические  для  них  биотесты.
Первый  из  них,  связанный  со  стимуляцией  роста  второго  междоузлия
фасоли, был рассмотрен выше [Mitchell et al., 1970], причем ауксины и
цитокинины в этом тесте не проявляли своего действия, а гиббереллины
вызывали  только  удлинение  междоузлий  и  действовали  в  гораздо
больших  концентрациях.  Более  чувствительным  к  воздействию
брассинолида  по  сравнению  с  этим  тестом  является  биотест  по  оценке
скорости  роста  эпикотилей  маша,  который  позволяет  выявить  его
стимулирующий  эффект  в  концентрации 10

-10

М и ниже [Gregory,

110

Mandava, 1982]. Кроме  того,  для  выявления  активности  БС  часто
используют  чрезвычайно  чувствительный  тест  по  изменению  угла
отклонения  листовой  пластинки  риса  от  влагалища  листа [Wada et al.,
1981].  Таким  образом,  БС  обладают  высокой  физиологической
активностью в ряде специфических для них биотестов.

Экзогенная обработка БС изолированных органов, их отрезков

или  целых  растений  вызывает  сильную  активацию  роста  как  за  счет
усиления  деления  клеток,  так  и  их  растяжения [Mandava, 1988].
Стимулирующий эффект БС на деление клеток наиболее четко показан
при  использовании  модельных  систем.  Например, 24-эпибрассинолид
(ЭБ)  существенно  ускоряет  деление  изолированных  протопластов
китайской  капусты [Sasse, 1997]. В  зависимости  от  соотношения
ауксина  и  цитокинина  в  среде  культивирования  изолированных
протопластов  мезофилла  листа  петунии  выявлены  интересные
закономерности  ускорения  пролиферации  при  обработке 10–100 нМ
брассинолидом [Oh, Clouse, 1998]. Разные  БС  в  области  концентраций
от 10

-12

–10

-8

стимулируют деление клеток хлореллы [Bajguz, Czerpak,

1999].

Влияние БС на активацию элонгации клеток как в модельных

системах  (на  этом  основаны  биотесты  по  выявлению  их  активности),
так  и  целых  растениях  показано  достаточно  хорошо [Mitchell et al.,
1970; Sasse, 1985; Mandava, 1988; Dahse et al., 1990; Zurek et al., 1994;
Zurek, Clouse, 1994; Clouse et al., 1996; Azpiroz et al., 1998; Lee et al.,
2000].  В  ряде  тест-систем  выявлен  синергический  эффект  ИУК  и  БС,
аддитивный  эффект  на  элонгацию  клеток  гиббереллина  и  БР [Katsumi,
1985].  Таким  образом,  БС,  взаимодействуя  с  другими  фитогормонами,
вовлекаются  в  регуляцию  ростовых  процессов,  и,  по  всей  видимости,
существенное  значение  в  проявлении  регуляторной  функции  имеет
влияние  БС  на  эндогенный  гормональный  статус  растений [Eun et al.,
1989; Zurek et al., 1994; Ковалев, 1998; Шакирова, 1999; Khripach et al.,
2000].  Обсуждению  этого  вопроса  будет  посвящен  самостоятельный
раздел главы.

Как известно, одной из первых регистрируемых реакций

растительной  клетки  на  обработку  экзогенными  фитогормонами-
активаторами ростовых процессов является гиперполяризация мембран
и  активация  протонной  помпы.  БС-индуцируемое  растяжение  клеток
также  сопровождается  выбросом  протонов  и  гиперполяризацией
клеточных  мембран [Cao, Chen, 1995], и  это,  вероятно,  связано  с
активацией  мембранной  АТФ-азы [Katsumi, 1985], поскольку  БР
способен  активировать  АТФ-азу  в  системе  in vitro [Sasse, 1997]. Не
исключено,  что  влияние  БС  на  протонную  помпу  опосредовано  через

111

модификацию липидного окружения АТФ-азного комплекса [Dahse
et al., 1990], так как липидный состав мембранной фракции, выделенной
из обработанных БР семядолей огурца, характеризуется повышенным
процентом ненасыщенных жирных кислот [Katsumi, 1985].

Интенсивность ростовых процессов находится в четкой

зависимости  от  активности  белково-нуклеинового  обмена  клеток.
Действительно, ингибиторы синтеза РНК и белка снимают стимуляцию
индуцированного  БС  роста  отрезков  эпикотилей  маша [Mandava et al.,
1987]. Известны данные об активации ДНК- и РНК-полимераз, а также
синтеза  ДНК,  РНК  в  растениях  фасоли  под  влиянием  обработки  БС,
причем  возрастание  активности  РНК-полимеразы I  способствует
увеличению  объема  белоксинтезирующего  аппарата  и  усилению
синтеза  белка [Kalinich et

al., 1985]. Обработка брассинолидом

гипокотилей и эпикотилей сои, а также проростков арабидопсиса
вызывает активацию транскрипции более 50 генов и усиление синтеза
полипептидов [Clouse et

al., 1992; Clouse, 1997]. Инкубирование

отрезков листьев пшеницы на гомобрассинолиде (10

-6

М, 10

-8

М)

приводит не только к активации тотального синтеза белка, но и
увеличению спектра синтезируемых белков [Кулаева и др., 1989;
Бурханова и др., 1991].

К числу вызываемых БС физиологических ответов растений

относятся

стимуляция

фотосинтетической

активности

клеток,

повышение уровня растворимых белков и углеводов [Braun, Wild, 1984;
Ковалев, 1998; Vardhini, Rao, 1999; Прусакова  и  др., 2000], модуляция
активности  ферментативной  системы  растений.  Так,  показано
возрастание  активности  растворимой  инвертазы  в  изолированных
семядолях риса [Beinhauer et al., 1990] и клеточно-стеночной инвертазы
в  суспензионной  культуре  клеток  томата [Goetz et

al., 2000],

карбоксилазы  в  листьях  пшеницы [Braun, Wild, 1984] и  семядолях
растущих  в  темноте  проростков  арабидопсиса [Nagata et al., 2000],
нитратредуктазы  и  глютаминсинтетазы [Sairam, 1994], АТФ-азы  и
других ферментов при воздействии БС на разнообразные растительные
объекты  [Прусакова,  Чижова, 1996; Sasse, 1997; Altmann, 1999;
Прусакова и др., 2000].

Имеются убедительные доводы в пользу участия БС в

дифференциации сосудов ксилемы: в наномолярных концентрациях БС
увеличивают формирование элементов трахеид обработанных ауксином
и  цитокинином  отрезков  топинамбура  до  десяти  раз,  причем
экстрагирование  БС  из  камбиальной  части  сосны  подтверждает  роль
эндогенных  БС  в  ксилемной  дифференцировке [Clouse, 1997].
Интересным  подходом  в  выяснении  роли  эндогенных  БС  в  развитии  и

112

дифференцировке  растений  является  использование  в  опытах
ингибитора  синтеза  БС,  брассиназола [Asami et al., 2000; Nagata et al.,
2000; Bishop, Yokota, 2001]. Растущие  в  темноте  проростки
арабидопсиса

после

обработки

брассиназолом

приобретали

морфологические  особенности  растений,  растущих  на  свету,  а  именно:
короткий  гипокотиль,  широкие  семядоли  и  истинные  листья,  хотя
необработанные  растения  не  развивали  листовых  примордий;  более
того,  в  семядолях  опытных  растений  наблюдалось  формирование
мембран  тилакоидов – первого  этапа  дифференцировки  пластид,  а
также повышение уровня рибулозо-1,5-бисфосфат карбоксилазы [Nagata
et al.,  2000].  Эти  результаты  указывают  на  новую  предполагаемую
функцию  эндогенных  БС  в  регуляции  роста,  развития  и
дифференцировки растений.

Таким образом, БС – эндогенные регуляторы роста – включаются

в регуляцию разнообразных процессов жизнедеятельности растений,
т.е. характеризуются множественными проявлениями физиологического
действия и отвечают всем критериям фитогормонов.

Вместе с тем, несмотря на присутствие БС в тканях растений,

значительное

усиление

ростовых

ответов

специфических

физиологических  изменений  при  крайне  низких  концентрациях  БС,  их
способности  передвигаться  по  растению  и  участвовать  в  регуляции
роста,  развития  и  дифференцировки  растений,  фитогормональный
статус БС еще совсем недавно не был общепринятым [Kende, Zeevaart,
1997; Creelman, Mullet, 1997]. (Хотя  к  чести  отечественных
фитогормонологов  БС  уже  давно  причислены  к  самостоятельному
классу  фитогормонов  [Муромцев  и  др., 1987]). Однако  к  настоящему
времени

благодаря

использованию

БС-дефицитных

БС-нечувствительных  мутантов,  позволивших  проводить  исследования
молекулярных  механизмов  физиологического  действия  БС,  получены
убедительные  доказательства  необходимости  этой  новой  группы
фитогормонов  в  регуляции  роста,  развития  и  дифференцировки
растений  и  что  брассиностероиды  принадлежат  к  уникальной  группе
эндогенных регуляторов роста фитогормональной природы [Sasse, 1997;
Clouse, 1997; Altmann, 1999; Goetz et

al., 2000], более того,

высказывается мнение о лидирующей роли БС среди фитогормонов
[Khripach et al., 2000].

Молекулярно-генетический  анализ  действия  брассиностероидов.
К настоящему  времени  в  распоряжении  исследователей  имеется
большая  коллекция  БС-мутантов  арабидопсиса,  гороха  и  томата,
которые  подразделяются  на  два  класса:  БС-дефектные,  содержащие

113

гены,  кодирующие  факторы,  вовлекающиеся  в  разные  этапы  по  пути
биосинтеза  БС,  и  БС-нечувствительные,  характеризующиеся  потерей
активности  факторов,  участвующих  в  первичном  восприятии
БС-сигнала,  компонентов  сигнальной  трансдукции,  или  эффекторов,
ответственных  за  экспрессию  компонентов,  участвующих  в  ответе  на
БС,  использование  которых  позволяет  выявить  драматические
отклонения  от  нормального  развития  растений,  и  лишь  экзогенное
внесение  БС  может  вернуть  их  в  норму [Altmann, 1999; Kripach et al.,
2000; Bishop, Yokota, 2001].

Использование этих мутантов позволяет выявить спектр

индуцируемых  БС  генов,  вовлекающихся  в  механизмы  действия  БС,
оценить  необходимость  их  реализации  в  проявлении  физиологических
эффектов  этих  гормонов [Clouse et al., 1996; Nomura et al., 1997;
Creelman, Mullet, 1997; Clouse, 1997; Azpiroz et al., 1998; Altmann, 1999;
Asami et al., 2000; Bishop, Yokota, 2001].

К числу первых клонированных и охарактеризованных генов

специфически регулируемых БС в зоне растяжения эпикотилей сои
относится ген BRU1, обладающий высокой гомологичностью с геном,
кодирующим

ксилоглюкан

эндотрансглюкозилазу

(КЭТ),

локализованную  в  клеточной  стенке  настурции [Zurek, Clouse, 1994].
Эти  исследования  являются  очень  перспективными  в  плане  изучения
молекулярных  механизмов  регуляторного  действия  БС  на  ростовые
процессы  и  взаимодействия  их  при  этом  с  ауксинами,  цитокининами,
гиббереллинами  (ГК),  а  также  АБК,  роль  которых  в  элонгации
растительных клеток хорошо известна. Так, было показано, что зеатин,
ИУК, ГК, несмотря на то, что они вызывали удлинение эпикотилей сои
(правда,  значительно  меньшее,  чем  при  обработке  БР),  снижали  в
отличие от БР уровень экспрессии BRU1, что свидетельствует о том, что
возрастание  экспрессии  этого  гена – результат  обработки  эпикотилей
БР, а не растяжения [Zurek, Clouse, 1994].

Изучение взаимодействия ауксина и БР в регуляции элонгации

стеблей  проводили  с  использованием  в  качестве  маркера  гена  малой
ауксин-зависимой РНК (SAUR15A) и ауксин-нечувствительного мутанта
томата [Zurek et al., 1994]. Инкубирование  гипокотилей  нормальных
растений  томата  на  ауксине  вызывало  их  удлинение,  при  этом  уже  в
течение  часа  наблюдалась  индукция  экспрессии  SAUR15A  гена,  тогда
как в мутантных растениях транскрипты этого гена не обнаруживались
и отсутствовала элонгация в ответ на ИУК. БР стимулировал элонгацию
гипокотилей  обоих  генотипов  томата  в  равной  степени,  однако
индукция  экспрессии  этого  гена  наблюдалась  лишь  спустя  несколько
часов [Zurek et al., 1994].

114

Так, в удлиняющихся эпикотилях гороха гомологичный

томатному ген SAUR6B экспрессировался под влиянием БР спустя 18 ч,
при этом увеличения уровня свободной ИУК в тканях эпикотилей не
происходило [Zurek et

al., 1994]. Результаты этой работы четко

демонстрируют факт независимой от ауксина регуляции БР экспрессии
семейства генов SAUR.

Вместе с тем ростовой ответ обработанных БС растительных

клеток связан с регуляцией углеводного обмена. Так, добавление БС к
автотрофной суспензионной культуре клеток томата приводит к
специфическому

повышению

активности

клеточностеночной

инвертазы, которое коррелирует с индукцией мРНК внешнеклеточной
инвертазы Lin6, тогда как активность внутриклеточных инвертаз не
изменяется [Goetz et

al., 2000]. Опыты с проростками томатов

свидетельствуют о том, что локализованный БС-зависимый ростовой
ответ в элонгирующей зоне гипокотиля сопровождается специфической
индукцией Lin6 мРНК, что демонстрирует роль БС в регуляции
апопластного транспорта углеводов [Goetz et al., 2000].

Клонирование генов, кодирующих участвующие в модификации

компонентов  клеточной  стенки  ферменты,  КЭТаз  и  экспанзинов [Fry,
1995; Bishop, Yokota, 2001], позволяют  проводить  прямую  оценку
влияния  гормонов-активаторов  роста  на  их  синтез  и  активность.
Ксилоглюканы  входят  в  состав  гемицеллюлозного  компонента
первичной  клеточной  стенки,  поэтому  КЭТазы  вполне  могут
способствовать  ее  разрыхлению  и  участвовать  таким  образом  в  росте
растяжением, хотя попытка выявить прямой эффект этих ферментов на
разрыхление  клеточных  стенок  в  выделенном  препарате  успеха  не
принесла,  зато  экспанзины  оказались  активными  в  модификации
клеточных стенок в этом тесте [Clouse, 1997].

Следовательно, значение КЭТаз в разрыхлении клеточной стенки

не определено, но, поскольку эти ферменты широко распространены и
относятся

дифференциально

регулируемому

мультигенному

семейству,  можно  полагать,  что  они  играют  важную  роль  в  самых
критических процессах, связанных с клеточными стенками растений. К
ним,  вероятно,  можно  отнести  регуляцию  включения  новых
ксилоглюканов для укрепления стенки в ходе растяжения [Clouse, 1997].
Эти  данные  указывают  на  полноправное  вовлечение  БС  в  сложную
картину гормональной регуляции экспрессии генов, продукты которых
задействованы в ростовом ответе растительных клеток. Однако было бы
важно  определить  влияние  ростстимулирующих  фитогормонов  БС,
ИУК и ГК на уровень активности участвующих в изменении состояния
клеточных стенок ферментов экспанзинов.

Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция - часть 7