Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция

стрессовых  факторов  абиотической  природы.  Вероятно,  это  связано  с
тем, что СК в оптимальной для стимуляции роста проростков пшеницы
концентрации,  наряду  с  повышением  уровня  ИУК,  индуцирует
накопление  АБК  и  через  этот  механизм  может  предадаптировать
растения к возможным неблагоприятным условиям.

Таким образом, защитный эффект синтетических (бисол 2 и

байтан) и природного (СК) регуляторов роста на растения пшеницы при
воздействии  стрессовых  факторов  разной  природы  проявляется  в
поддержании их гормонального статуса на уровне, близком к контролю,
за  счет  предотвращения  под  влиянием  обработки  этими  препаратами
резкого  стресс-индуцированного  накопления  АБК,  а  также  падения
уровня  ИУК  и  цитокининов.  Следовательно,  действие  этих
антистрессовых  регуляторов  роста  по  повышению  устойчивости
пшеницы  к  грибному  патогенезу,  засолению,  дефициту  влаги  и,
вероятно,  другим  повреждающим  факторам  среды  включает  в  себя  их
влияние на эндогенную систему регуляции.

1,5

Время, ч

К
NaCl
СК
СК NaCl

110

130

1,5

Время, ч

К
NaCl
СК
СК NaCl

1,5

Время, ч

К
NaCl
СК
СК NaCl

ИУК

/АБК

, %

от

контроля

ИУК

, нг

/ корень

АБК

, нг

/корень

Рис. 20.

Влияние

пред-

посевной

обработки

семян

0,05 мМ  СК  на  изменение
уровня  АБК  (а),  ИУК  (б)  и
коэффициента  ИУК/АБК ((в),
процент  от  контроля)  в 4-сут.
проростках

пшеницы

при

воздействии 2 %-го NaCl.
Контролем

служили

не

обработанные СК и NaCl
проростки

ЛАВА

5. АГГЛЮТИНИН ЗАРОДЫША ПШЕНИЦЫ

И УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ
К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ УСЛОВИЯМ

Прежде

чем

приступить

рассмотрению

данных,

свидетельствующих об участии лектина, наряду со стрессовыми
АБК-индуцируемыми белками, в развитии защитных реакций растений
пшеницы

повреждающим

факторам

среды,

необходимо

первоначально остановиться на структуре этого белка, его биогенезе, а
также проанализировать данные о предполагаемых функциях АЗП и
других фитолектинов, в том числе о возможности вовлечения их в
гормон-индуцируемую регуляцию ростовых процессов.

Впервые белок из пшеницы, обладающий агглютинирующей

способностью, был выделен почти 40 лет назад из зародышей, поэтому
он получил название агглютинина зародыша пшеницы [Marchesi, 1972].
Структура  и  физико-химические  свойства  АЗП  достаточно  хорошо
изучены [Lord, 1985]. Он  обладает,  как  уже  упоминалось  в  главе 1,
специфическим  сродством  к N-ацетил-D-глюкозамину  и  его
олигомерам.  Молекулярная  масса  АЗП  в  нативном  состоянии
составляет 36 кД, и этот белок, являющийся «классическим» лектином,
состоит  из  двух  нековалентно  связанных  идентичных  субъединиц,
которые  диссоциируют  под  действием SDS, экстремальных  значений
pH (ниже 3.0  и  выше 10.5)  или  высокой  ионной  силы  среды  на
мономеры с молекулярной массой 18 кД. АЗП характеризуется высоким
содержанием  глицина  и  цистеина,  что,  вероятно,  обусловливает  его
высокую стабильность при широких диапазонах температур и рН [Allen
et al., 1973; Nagata, Burger, 1974; Rice, Etzler, 1975; Wright, 1987].

Мягкая пшеница является гексаплоидом, образованным слиянием

3-х диплоидных геномов А, В и D, а поскольку лектин пшеницы состоит
из 2-х гомологичных субъединиц, эти растения могут содержать
6 изолектинов, характеризующихся 93–95

%-й идентичностью по

нуклеотидной  и  аминокислотной  последовательностям [Peumans et al.,
1982; Peumans, 1984; Raikhel, Wilkins, 1987; Smith, Raikhel, 1989].
Значительные  количества  АЗП  обнаружены  в  зародыше  зрелых  семян
пшеницы,  при  этом  он  локализован  в  клетках  поверхностных  слоев
зародышевого  корешка,  первичных  корешков,  колеоптиля [Mishkind
et al., 1980; 1982; Peumans, 1984; Raikhel, Pratt, 1987]. Действительно,
массированный  синтез  и  накопление  АЗП  наблюдается  в  период
эмбриогенеза  в  ходе  формирования  семян  в  развивающемся  зародыше

[Peumans, 1984]. В  этот  же  период  онтогенеза  происходит
существенный  синтез  и  накопление  лектинов  в  других  злаках –
эгилопсах,  ячмене,  ржи,  рисе,  причем  сравнительное  изучение  этих
лектинов показало их высокую степень родства по иммунологическим,
биохимическим  свойствам  и  сахароспецифичности  АЗП,  поэтому  эти
лектины,  иммунологически  неотличимые  от  АЗП,  были  даже
объединены  в  одну  группу,  так  называемых  «злаковых  лектинов»,  а
АЗП  был  отнесен  к  их  типичному  представителю [Peumans, 1984;
Chrispeels, Raikhel, 1991]. Действительно,

АЗП-подобные,

иммунохимически сходные с ним лектины обнаружены более чем в
90 видах

злаковых

растений,

что

указывает

на

высокую

консервативность генов лектинов злаков в эволюции [Wright et al.,
1991].

Однако, несмотря на то, что хорошо охарактеризованный АЗП

был  получен  из  зародышей,  он  присущ  растениям  пшеницы  на  всех
этапах  онтогенеза.  Есть  сведения  о  синтезе  de novo  АЗП  в
меристематических  тканях  корня [Stinissen et al., 1985; Cammue et al.,
1989]  и  основаниях  стебля [Mishkind et al., 1982; Raikhel et al., 1984]
проростков  пшеницы,  местах  преимущественной  локализации  этого
белка  в  вегетирующих  растениях,  хотя  он  обнаруживается  и  в  других
органах  проростков  и  взрослых  растений  пшеницы,  при  этом  его
количественный  уровень  в  процессе  вегетации  претерпевает
существенные  флуктуации [Mishkind et al., 1980; 1982; Raikhel et al.,
1984; Cammue et al., 1988; 1989; Шакирова  и  др., 1993]. Подробный
анализ  распределения  лектина  в  различных  органах  и  тканях  в  ходе
онтогенеза  растений  ячменя  выявил  его  наличие  в  корнях,  листьях  и
развивающихся  колосьях,  причем  лектины  в  корнях  и  листьях  также
неотличимы  от  лектина  зародыша,  а  суммарное  содержание  лектина  в
корнях  и  листьях  может  превышать  его  содержание  в  зародыше
[Cammue et al., 1985].

Скрупулезные исследования по синтезу АЗП в ходе

формирования,  созревания  и  прорастания  зародышей  выявили наличие
пула запасных нетранслируемых лектиновых мРНК [Peumans, Stinissen,
1983].  Злаковые  лектины,  в  частности  АЗП,  синтезируются  в  качестве
пробелков [Stinissen et al., 1982; Mansfield et al., 1988; Smith, Raikhel,
1989]  и  требуются  обязательные  структурные  преобразования  при  их
созревании,  т.е.  они  претерпевают  сложный  посттрансляционный
процессинг,  основные  этапы  которого  были  прослежены  для  АЗП  и
лектина  ячменя [Mansfield et al., 1988; Wilkins et al., 1990; Bednarek
et al., 1990].

Так, показано, что предшественник пробелка ко-трансляционно

изменяется  путем  удаления  гидрофобного  сигнального  пептида  и
модифицируется связыванием с высокогликозилированным (маннозный
глюкан)  карбоксилтерминальным  пропептидом  (КТПП),  состоящим  из
15 аминокислот.  В  таком  виде  полипептид  с  молекулярной  массой
23 кД  проходит  через  комплекс  Гольджи  перед  аккумуляцией  в
вакуолях.  Именно  КТПП  отвечает  за  корректное  распределение
предшественника  в  клеточную  вакуоль,  тогда  как  глюкан  может
оказывать влияние лишь на скорость посттрансляционного процессинга.
По  ходу  транспорта  предшественника  или  по  достижении  вакуоли
гликозилированный КТПП удаляется с образованием зрелого пептида с
молекулярной  массой 18

кД, характерной для одной из двух

идентичных субъединиц лектина с М.м. 36 кД. Использование антител,
полученных  для  пробелка  АЗП,  которые  не  преципитируют  зрелый
лектин,  а  также  пульс-метки  показало,  что  по  мере  уменьшения  после
синтеза уровня пробелка 23 кД постепенно возрастает содержание 18 кД
зрелой  субъединицы  лектина [Mansfield et al., 1988; Bednarek et al.,
1990].

Таким образом, наличие пула запасных лектиновых мРНК и

пробелков  АЗП  может  свидетельствовать  о  жизненной  необходимости
злаковых лектинов, в частности АЗП, для растений на протяжении всего
онтогенеза  и  вероятности  выполнения  ими  неких  важных
физиологических  функций.  Нужно  отметить,  что  в  литературе  активно
дискутируются  лишь  их  предполагаемые  функции  [Сhrispeels, Raikhel,
1991; Peumans, van Damme, 1995; Rudiger, 1997].

Функции лектина пшеницы

В связи с тем, что интенсивный синтез и аккумуляция лектина

пшеницы  приурочены  к  фазе  формирования  и  созревания  семян  в
период  образования  и  накопления  запасных  белков,  а  гены  многих
запасных  белков,  также  как  и  АЗП,  относятся  к  rab  генам,  индукция
экспрессии которых находится под контролем АБК [Mansfield, Raikhel,
1990; Skriver, Mundy, 1990], было  сделано  предположение,  что  этот
белок характерен для семян при их созревании и покое и способствует
поддержанию последнего [Triplett, Quatrano, 1982; Quatrano et al., 1983;
Peumans, Stinissen, 1983]. Хотя  говорить  об  одновременном  синтезе
лектинов и запасных белков, вероятно, не корректно [Rudiger, 1997]. В
то  же  время,  подавляющее  количество  АЗП  аккумулируется  в
зародыше,  а  не  в  эндосперме – месте  преимущественной  локализации
запасных  белков.  Кроме  того,  показано,  что  значительный  синтез

лектина  de novo  происходит  в  основании  стебля  и  корешках  пшеницы
[Raikhel et al., 1984; 1986; Cammue et al., 1989], корнях и листьях ячменя
[Cammue et al., 1985]. Это  приводит  к  существенному  транзитному
накоплению  лектина  в  ходе  индивидуального  развития  растений,
количество  которого  в  вегетирующих  тканях  может  быть  вполне
соизмеримым таковому в зародышах, и даже превосходить его.

Однако интересно отметить, что лектин, характерный для

вегетирующих тканей сои, может гидрофобно взаимодействовать in vivo
с  запасными  белками,  обеспечивающими  временное  запасание  азота  и
продуктов  фотосинтеза  в  тканях  растений  и,  таким  образом,
способствовать упаковке и аккумуляции этих белков в вакуолях клеток
мезофилла  листьев  и  играть  важную  роль  в  переносе  и  запасании
фотоассимилятов [Spilatro et al., 1996].

К числу возможных физиологических функций АЗП можно,

отнести  участие  его  в  транспорте,  накоплении  и  иммобилизации
углеводов  [Королев, 1984; Peumans, 1984]. Так,  специфичный  к  АЗП
N-ацетил-D-глюкозамин  является  одним  из  широко  распространенных
сахаров,  задействованных  в  концевых  модификациях  полипептидов  не
только  в  ходе  посттрансляционного  процессинга [Schetz, Anderson,
1995],  но  и  зрелых  белков,  играющих  важную  роль,  например
транспортную,  в клетках  (в частности,  их  наличие  с  использованием
АЗП  выявлено  в ядерных  мембранах  растений  вблизи  ядерных  пор
[Heese-Peck et al., 1995; Heese-Peck, Raikhel, 1998]).

Имеются данные, демонстрирующие вовлечение АЗП в активации

ряда ферментов, участвующих в обменных процессах клеток [Ferens-
Sieczkowska et

al., 1989], в усилении продукции активных форм

кислорода [Oda et al., 1998], связывании с пероксидазой и транспорте ее
по тканям растений [Gordon et al., 1998], гликозилировании ферментов
[Clark et al., 1999], причем все эти реакции подавляются специфическим
для него лигандом – тем самым GlcNAc.

Важным свойством многих растительных лектинов является их

способность  к  митогенному  и/или  трансформационному  действию  на
клетки,  в  том  числе  и  в  эндогенных  системах  [Марков,  Хавкин, 1983;
Лахтин, 1986]. Действительно, основным местом локализации лектинов
в  вегетирующих  растениях,  например  бобовых  и  злаков,  являются
активно  растущие  меристематические  ткани,  что  дает  основание
предполагать  выполнение  лектинами  некой  роли  в  процессах  деления
клеток [Peumans, Stinissen, 1983; Марков,  Хавкин, 1983]. Вместе  с  тем
следует отметить, что имеются лишь отрывочные сведения, касающиеся
вовлечения  лектинов  вместе  с  фитогормонами  в  регуляцию  роста
растений.  Так,  участие  в  регуляции  индуцируемого  ауксинами  роста

растений показано для разных фитолектинов, в том числе и для АЗП
[Umekawa et al., 1990]. Кроме того, выявлена четкая зависимость между
конканавалином А и ИУК-индуцируемым ростом гипокотилей и
эпикотилей двудольных [Samajova et al., 1998].

Однако особого внимания в связи с этой проблемой заслуживают

данные

прочном

связывании

конканавалином А

гормонов

ауксинового  ряда [Edelman et al., 1978], а  лектина  лимской  фасоли
[Roberts, Goldstein, 1983] и  земляного  гороха [Zaluzec et al., 1991] – с
гормонами  цитокининовой  природы.  Причем  образование  комплекса
этих  лектинов  с  цитокининами  осуществляется  посредством
гидрофобного

центра

связывания,

не

затрагивающих

углеводсвязывающих доменов [Rudiger, 1997]. По-видимому, именно
эти работы послужили основой для дальнейшего детального
исследования

аминокислотных

последовательностей

различных

лектинов бобовых, их пространственной организации и идентификации
сайтов гидрофобного связывания с гормонами адениновой природы и
выявления констант их связывания [Puri, Surotia, 1994; Loris et al., 1998;
Hamelryck et al., 1999; Bouckaert et al., 1999].

Интересно в связи с этим отметить цикл работ по выявлению и

анализу  функционирования  растительных  инактивирующих  рибосомы
белков (ribosome-inactivating proteins), обладающих  лектиновым
доменом  типа  рицина,  характеризующимся  сродством  к  галактозе,
которые,  специфически  связываясь  с  консервативным  адениновым
остатком 28SрРНК 60S рибосомальной субъединицы в положении 4324,
энзиматически  удаляют  его  и  вызывают  ингибирование  элонгации
трансляции [Lord et al., 1991; Watanabe et al., 1992; Citores et al., 1996;
Holmberg, Nygard, 1996; Peumans et al., 1998]. В  высокой  аффинности
взаимодействия  с  аденином,  а  также  цитокининами,  производными
аденина, важную роль играет четвертичная структура бобовых лектинов
[Loris et al., 1998; Bouckaert et al., 1999].

Функционирование сайтов гидрофобного связывания лектинов

бобовых,  которые  обеспечивают  их  взаимодействие  с  цитокининами,
пока  не  известно,  однако  благодаря  им  эти  лектины,  вероятно,  могут
быть задействованы в запасании цитокининовых гормонов и регуляции
роста  растений [Hamelryck et

al., 1999] и, можно предполагать,

оказывать  влияние  на  гормональный  статус  растений  в  целом.  Как
известно,  лектины  бобовых  более  сложно  структурно  организованы  в
сравнении с АЗП, однако это не исключает вероятности существования
и  у  лектина  пшеницы,  как  и  других  растений,  самостоятельного  сайта,
ответственного  за  гидрофобное  взаимодействие  с  молекулами
неуглеводной  природы,  например  фитогормонами,  и  вследствие  этого

возможности активно включаться в систему сигнальной трансдукции в
растениях пшеницы.

В пользу этого предположения свидетельствуют данные о

2–4-кратном  повышении  содержания  АЗП  в  семенах  пшеницы  в  ходе
прорастания  и  корнях  проростков  под  влиянием  не  только  известного
индуктора  синтеза  и  накопления  этого  белка  АБК [Mansfield, Raikhel,
1990],  но  и  гормонов-стимуляторов  роста  растений  [Шакирова,
Безрукова, 1998; Безрукова,  Шакирова, 1999; Шакирова  и  др., 2000;
Shakirova et al., 2001]. Лишь  дальнейшие  исследования  о  взаимосвязи
АЗП и эндогенных регуляторов роста в контроле деления и растяжения
клеток  позволят  прояснить  участие  АЗП  в  сигнальной  регуляции
ростовых процессов в растениях пшеницы.

Однако наиболее привлекательной функцией, которую в

растениях может выполнять АЗП, конечно, благодаря специфичности к
мономеру  и  олигомерам  хитина,  является  защитная  от  хитин-
содержащих  патогенов,  которая  подкреплена  полученными  в  опытах
in vitro  данными  о  связывании  АЗП  с  различными  грибами  и
ингибировании их роста [Mirelman et al., 1975; Barkai-Golan et al., 1978;
Ebrahim-Nesbat et al., 1982; Barraqueta-Egea, Schauz, 1983; Лахтин,
Яковлева, 1987; Ciopraga et al., 1999].

Вместе с тем не для всех авторов защитная роль АЗП является

бесспорной. Например, связывание АЗП даже в больших концентрациях
с  гифами  F. poae  не  ингибирует  их  рост [Poschenrieder, Huber, 1982].
Больше того, АЗП способен даже активировать прорастание спор гриба
Aspergillus flavus Link. [Barraqueta-Egea, Schauz, 1983]. Также известно,
что  гифы  грибов,  кроме  активно  растущего  апекса,  экранированы
глюканами [Peberdy, 1989], которые  делают  невозможным  связывание
АЗП с грибными клетками. К контраргументам относительно защитной
функции АЗП, приведенным в работе Peumans и Stinissen [1983], можно
отнести слабую устойчивость современных сортов пшеницы к грибным
патогенам  в  сравнении  с  ее  дикими  предками,  несмотря  на  большее
содержание  в  них  АЗП,  а  также  незначительное  количество  АЗП  в
листьях,  хотя  пшеница,  так  же,  как  и  все  злаки,  подвержена  жесткой
атаке грибных патогенов, поражающих листовые поверхности. Правда,
впоследствии [Сammue et al., 1985] был выявлен существенный уровень
лектина  в  листьях  ячменя  взрослых  растений,  таким  образом,
использование

более

чувствительных

современных

методов

количественного анализа АЗП может позволить провести более
адекватную оценку содержания этого белка в различных органах
пшеницы на протяжении всего онтогенеза.

Приведенные выше данные свидетельствуют о противоречивости

имеющихся  знаний  по  экзогенному  влиянию  лектина  на  рост  грибных
микроорганизмов  и  практическом  отсутствии  работ,  указывающих  на
вовлечение  АЗП  в  реакции  устойчивости  пшеницы  к  болезням  in vivo.
Хотя  высокая  аффинность  к  углеводным  компонентам  клеточной
стенки  хитинсодержащих  грибов,  а  также  насекомых,  которые
практически  полностью  отсутствуют  в  растениях  пшеницы [Peumans,
Van Damme, 1995], способность  в  значительных  количествах
выделяться  в  корневой  чехлик/окружающую  среду  остаются
аргументами  в  пользу  вовлечения  АЗП  в  формирование  защитных
реакций растений пшеницы к фитопатогенам.

Анализ уровня АЗП в инфицированных растениях, а также

динамики его количественных изменений в ходе патогенеза позволит
приблизиться к ответу на вопрос об участии этого белка в защите
пшеницы от фитопатогенов.

Участие лектина в проявлении устойчивости пшеницы к грибным
патогенам

Одним

из

признаков

вовлечения

белков

реакцию

устойчивости/восприимчивости  растения  является  количественное
изменение  их  уровня  или  активности  [Вандерпланк, 1981]. Так,
например,  выявлена  связь  между  гемагглютинирующей  активностью
водорастворимых  лектинов  в  листьях  и  клубнях  картофеля,
обладающих,  как  и  АЗП,  специфичностью  к N-ацетил-D-глюкозамину,
и  устойчивостью  картофеля  к  фитофторозу  [Громова  и  др., 1990;
Любимова, 1991]. Показано,  что  семена  сортов  сои,  устойчивых  к
Phytophthora megasperma var. sojae,  характеризуются  вдвое  большим
содержанием лектина в сравнении с таковым у восприимчивых [Gibson
et al., 1982].

К белкам, функционально близким к лектинам, относят

растительные

ингибиторы

протеолитической

активности

микроорганизмов и насекомых. Кроме проведения прямой параллели по
их близким физиологическим, и в первую очередь, защитным функциям
[Hwang et

al., 1978], было выявлено наличие у ингибиторов

трипсиновой

активности

пшеницы,

также

картофеля,

лектиноподобных свойств [Мелентьев и др., 1986, Isla et al., 1991]. При
этом, между активностью ингибитора трипсина в семенах и
устойчивостью пшеницы к поражению твердой головней обнаружена
положительная коррелятивная связь [Ямалеев и др., 1980].

Однако оценка исходного количества АЗП в семенах разных

образцов  пшеницы:  T. urartu,  T. dicoccum,  T. spelta,  T. boeoticum,
T. monococcum,  T. timopheevii,  T. aestivum – не  выявила  какой-либо
достоверной корреляции между содержанием лектина в сухих семенах и
устойчивостью  растений  пшеницы  (в  полевых  условиях)  к  корневым
гнилям  и  септориозу  [Шакирова  и  др., 1992]. С  тем,  чтобы  понять,
вовлекается  ли  лектин  в  развитие  ответных  реакций  пшеницы  на
заражение  возбудителями  грибных  болезней,  важно  исследовать
изменение  содержания  АЗП  в  растениях  пшеницы  на  разных  стадиях
онтогенеза в ходе инфицирования.

Корневая  гниль.  Как  известно,  наиболее  чувствительны  к  поражению
H. sativum=B. sorociniana,  вызывающему  корневую  гниль,  молодые
проростки  пшеницы  [Лангольф,  Чулкина, 1985]. Действительно,
инокулирование  двухнедельных  проростков  суспензией  конидий
приводило  уже  через  неделю  к  заметному  проявлению  болезни,  о
которой  судили  по  интенсивности  темно-бурых  полосок  на  основании
стебля проростков T. turgidum, и балл поражения достигал двух единиц
и  более  [Шакирова  и  др., 1990]. Заражение  вызывало  значительное
возрастание  уровня  АЗП  в  основаниях  стебля  (сегмент  от  щитка  до
основания  листьев),  причем  уровень  белка  возрастал  по  мере  развития
болезни  и  увеличения  степени  поражения  патогеном,  что,  вероятно,
указывает на мобилизацию АЗП в защиту растений пшеницы к данному
патогену (рис. 21) [Шакирова и др., 1990; Шакирова, 1999].

100

150

200

250

300

350

400

450

Контр.

1 балл

2-3 балла

АЗП

, нг

/сег

ен

Рис. 21. Влияние корневой гнили на содержание АЗП в 3-недельных
растениях Tr. turgidum в зависимости от балла поражения

Основанием для такого представления могут служить также

данные опытов о способности лектина пшеницы in vitro связывать
инфекционные структуры H. sativum, нарушать проницаемость мембран
клеток гриба и приводить к их деструкции [Лахтин, Яковлева, 1987].

Корневая гниль вызывает и возрастание уровня АБК в листьях тех

же  растений  [Шакирова  и  др., 1990]. Сравнительный  анализ  динамики
содержания  АБК  и  АЗП  в  проростках  пшеницы  при  заражении
фитопатогенным  грибом  S. nodorum  также  выявил  существенные
изменения в уровне этих соединений [Хайруллин и др., 1992].

Септориоз. Инокуляция 7-дневных растений пшеницы суспензией спор
S. nodorum первоначально вызывает резкое транзитное накопление АБК
в  проростках,  и  к  концу  опыта  уровень  АБК  в  инфицированных
растениях  соответствует  контрольному  значению  (рис. 22).  Заражение
индуцирует  повышение  содержания  АЗП  в  проростках  лишь  спустя
6 суток,  а  к  моменту  визуального  проявления  болезни, 9-м  суткам,

100

120

Время после инокуляции, сут

АБК

нг

/п

ор

ост

АЗП

нг

/п

ор

ост

АБК, К

АБК,
S.nod.

АЗП, К

АЗП,
S.nod.

Рис. 22. Влияние септориоза на динамику содержания АЗП и АБК
в проростках пшеницы сорта Саратовская 29. Заражали суспензией спор
S. nodorum в концентрации 10 млн. спор/мл 7-дневные проростки

уровень этого белка возрастает почти в 3

раза. Эти результаты

демонстрируют  принципиальное  различие  в  скорости  вызванного
патогенезом накопления в растениях АБК и АЗП. Первичное обратимое
повышение  содержания  АБК,  по-видимому,  является  показателем
повреждающего  действия  грибного  заражения [Bousqet et al., 1991;
Хайруллин  и  др., 1993], тогда  как  накопление  лектина  происходит
постепенно,  по  мере  развития  болезни,  что  может  указывать  на
непосредственное  участие  этого  белка  в  формировании  защитных

реакций  растений  пшеницы  к  фитопатогену.  Поскольку  АБК
индуцирует  экспрессию  гена  АЗП,  можно  предположить,  что
предшествующее  накоплению  лектина  увеличение  уровня  АБК  может
служить сигналом для усиления его синтеза.

Наиболее вредоносным является поражение септориозом

колосьев и зерен, ведущее к потере урожая не только в год посева, но и
на  следующий  год,  так  как  у  зараженных  семян  снижается  энергия
прорастания  и  полевая  всхожесть  [Деревянкин, 1971; Bronniman, 1982;
Васецкая, Чигирев, 1986; Verret et al., 1987]. В связи с этим, интересно
проанализировать  динамику  содержания  АБК  и  лектина  в  ходе
формирования  и  созревания  семян  пшеницы,  инфицированной
S. nodorum.  Безусловно,  эти результаты должны отличаться от данных,
полученных на вегетирующих проростках.

Наряду с другими фитогормонами существенную роль в

формировании  репродуктивных  органов  играет  АБК,  и  не  только  в
связи  с  индукцией  синтеза  запасных  белков,  важное  значение  ее
связывают  с регуляцией  обезвоживания  семян  при  их  созревании,  как
уже  обсуждалось  в  гл. 4.  Кроме  того,  напомним,  что  в  процессе
формирования  семян  происходит  массированный  синтез  АЗП,
количество  которого  достигает  максимума  в  зрелых  зерновках
пшеницы.  Поэтому  в  период  формирования  и  созревания  зерновок
имеет  место  естественное  существенное  накопление  и  АБК,  и  АЗП,
тогда как заражение S. nodorum лишь ускоряет нормальное изменение в
их содержании [Шакирова и др., 1994].

Динамика уровня АБК в контрольных семенах описывается

кривой  с  двумя  максимумами:  первый – в  течение 3 дней  от  начала
опыта  с  пиком  на 9-й  день  после  цветения,  а  второй – на 21-й.  Затем
содержание  АБК  снижается.  Сравнение  результатов  по  динамике
содержания  АБК  в  развивающихся  семенах  с  их  массой  (рисунки 23
и 24) обнаруживает четкую связь между изменениями этих показателей.
Сырая  масса  зерна  достигает  максимума  к 21 дню  после  цветения,
соответствующему  второму  максимуму  в  уровне  АБК,  после  которого
наступает период созревания семян, сопровождающийся потерей влаги
и снижением массы семян.

Наличие двух максимумов в содержании АБК прослеживается и

при  анализе  развивающихся  зерновок  в  колосе,  инфицированном
S. nodorum,  правда,  заражение  вызывает  ускорение  накопления  АБК.
Пик первого максимума АБК в зерновках приходится на 8-й, а второго –
14-й дни после цветения. В последующем содержание АБК постепенно
снижается,  но  зрелые  зерновки  характеризуются  повышенным

Дни после цветения

АБ

нг

/з

ерн

ов

ка

Заражение

Рис. 23. Характер изменения уровня АБК в развивающихся зерновках
пшеницы

Саратовская 29

под

влиянием

грибного

заражения.

Инфицирование колосьев S. nodorum проводили на 6-й день после цветения

Зрелые

Время, сутки после

сса

зер

на

мг

К
Заражение

Рис. 24.  Влияние  септориоза  колоса  на  динамику  накопления  массы
сырого  вещества  зерновки  пшеницы  сорта  Саратовская 29  при
формировании  и  созревании.  Инфицирование  колосьев  S. nodorum
проводили на 6-й день после цветения

относительно контроля уровнем. В работе Bousqet et al. [1991] показано,
что  септориоз  индуцирует  увеличение  количества  АБК  в  пораженных
колосьях,  однако  детальная  динамика  содержания  этого  гормона  в
зерновках,  изолированных  от  колоса,  выявила  лишь  сдвиги  в
максимумах естественного накопления этого гормона.

Как и в случае контрольных растений, в инфицированных

колосьях динамика развития зерна (изменение сырой массы) в ходе их
формирования и созревания коррелирует с динамикой содержания АБК,
т.е.  септориоз  ускоряет  и  начало  созревания  семян  (рис. 24).  Известно,
что неблагоприятные факторы среды, в том числе и грибной патогенез,
ускоряют  созревание  семян [Roney, Hoad, 1989], и  это  неизбежно
сказывается  на  существенном  снижении  урожая [Bronniman, 1982;
Verret, Hoffman, 1986]. Септориоз  колоса  приводит  к  щуплости  семян,
снижению  размера  и  массы  почти  на 30 %, а  также  к  уменьшению
количества семян в колосе.

Резкое накопление АЗП в инфицированных зерновках

регистрировалось на второй день после заражения колосьев (рис. 25). В
следующие дни различие в содержании АЗП в опытном и контрольном
вариантах уменьшалось, так что в семенах здоровых и инфицированных
растений на поздних стадиях созревания содержание АЗП было
относительно близким.

200

400

600

800

1000

1200

1400

Дни после цветения

АЗП

нг

/зерновка

Заражение

Рис. 25.

Динамика уровня лектина в развивающихся семенах пшеницы

под влиянием инфекции. Инфицирование колосьев S. nodorum проводили
на 6-й день после цветения

Таким образом, в ходе формирования и созревания семян

наблюдается  неуклонное  возрастание  уровня  АЗП,  которое  достигает
максимума  к  моменту  полного  созревания  семян.  Однако
инфицирование  вызывает  ускорение  накопления  лектина  практически
на  неделю,  как  и  созревание  семян  (рис. 25).  В  связи  с  этим  можно
предположить,  что  динамика  содержания  АЗП  может  служить
показателем ускорения индуцированного септориозом самого процесса
созревания семян.

Вместе с тем трехкратное увеличение уровня лектина в первые

дни после заражения, очевидно, является результатом АБК–
индуцированного ускорения его синтеза и, по-видимому, связано с
участием его в процессе взаимоотношения хозяина и патогена.

Приведенные результаты убедительно свидетельствуют об

участии  АЗП  в  формировании  ответных  реакций  пшеницы  при
заражении  не  только  возбудителями  корневой  гнили,  но  и  септориоза,
что  может  говорить  о  вовлечении  лектина  в  развитие  устойчивости
пшеницы к различным грибным болезням и реальности выполнения им
защитной функции.

Индукция

накопления

АЗП

соединениями,

повышающими

устойчивость  растений  к  возбудителям  грибных  болезней.  Следует
специально  подчеркнуть,  что  непосредственное  участие  тех  или  иных
соединений в становлении защитных реакций растений к стрессу in vivo,
к сожалению, бывает довольно трудно доказать. Очень часто уже само
появление  новых  белков  или  значительное  увеличение  ранее
существующих в ответ на стресс позволяет исследователям относить их
к  разряду  причастных  к  защите  растений  от  неблагоприятного
воздействия.  В то  же  время  нельзя  исключить,  что  повышение
содержания или активности, или даже появление новых белков, может
быть  лишь  результатом  повреждающего  действия  стрессового  фактора
на растения. Однако высокая специфичность АЗП к олигомерам хитина,
по-видимому,

позволяет

отнести

количественные

изменения

(увеличение) в уровне этого белка к защитным реакциям растений
пшеницы

при

патогенезе,

способствующих

повышению

их

устойчивости к данному стрессовому воздействию.

Серьезным доводом в пользу участия лектина в защите пшеницы

при патогенезе могут служить результаты по индукции накопления АЗП
при обработке растений элиситорами [Cammue et al., 1990], а также под
влиянием обработки байтаном, бисолом 2 [Хайруллин и др., 1992] и
салициловой кислотой [Шакирова, Безрукова, 1997], которые, как было

показано в предыдущих главах, повышают устойчивость пшеницы к
грибным болезням.

Данные, приведенные на рис. 26, показывают, что фунгицид

байтан,  препарат  бисол 2,  обладающий  свойством  иммунизатора,  а
также  салициловая  кислота,  являющаяся  индуктором  системной
приобретенной  устойчивости,  вызывают  существенное  увеличение

120

160

200

240

Контроль

Байтан

Бисол2

ЗП

, нг

/сег

ен

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

Контроль

0.05 мМ СК

ЗП

, мкг

/г

сы

ро

мас

сы

корней

Рис. 26.  Индукция  накопления  АЗП  под  влиянием  препаратов,
повышающих  устойчивость  растений  к  инфицированию  патогенами.
Анализ  содержания  АЗП  в  основаниях  стебля 7-суточных  проростков
пшеницы,  предобработанных  бисолом 2  и  байтаном  (а).  Уровень  АЗП  в
корнях 4-суточных проростков пшеницы, выдержанных на растворе СК в
течение 8 ч (б)

содержания  АЗП  в  проростках.  Поскольку  все  эти  антистрессовые
регуляторы индуцируют накопление АБК в растениях пшеницы, можно
полагать,  что  вызванное  ими  увеличение  уровня  АЗП  является
АБК-контролируемым  и  таким  образом  лектин  вовлекается  в
механизмы  защитного  действия  этих  соединений,  способствующих
предадаптации  пшеницы  к  стрессовым  ситуациям,  в  частности  при
патогенезе.

Приведенные в этом разделе материалы о 2–4-кратной индукции

накопления АЗП в растениях под влиянием защитных препаратов, при
инфицировании возбудителями корневой гнили и септориоза, наряду с
данными об увеличении уровня АЗП при заражении пыльной головней
[Ямалеев и др., 1988], дают основание говорить о вовлечении лектина в
формирование комплексной реакции устойчивости пшеницы при
патогенезе.

Ограничивать роль АЗП участием в механизмах защиты растений

пшеницы  только  инфицированием  несправедливо.  Поскольку  лектин-
углеводное  взаимодействие  не  определяет  специфичности  сортов
растения  и  рас  патогена  [Любимова, 1991], более  вероятным,  на  наш
взгляд,  является  вовлечение  такого  взаимодействия  в  процессы,
развивающиеся  в  ответ  на  разные  по  природе  повреждающие  факторы
внешней  среды,  т.е.  неспецифические  механизмы  устойчивости
пшеницы. Например, известны данные о накоплении в клетках растений
некоторых PR-белков  при  воздействии  абиотических  стрессовых
факторов  среды  [Савич, 1989; Munеharu et al., 1994; Hurkman, Tanaka,
1996; Moons et al., 1997], что  может  служить  аргументом  в  пользу
задействования их в неспецифической защите растений.

Поскольку

разнообразные

неблагоприятные

воздействия

окружающей

среды

индуцируют

накопление

АБК

можно

предположить, что АЗП включается в АБК-контролируемый спектр
неспецифических защитных механизмов в ответ на стрессовые факторы
не только биотической, но и абиотической природы. Проверке этого
предположения посвящен следующий раздел главы.

Участие лектина в АБК-контролируемых защитных реакциях
пшеницы при воздействии абиотических стрессовых факторов

Индуцированные разнообразными по природе стрессовыми

воздействиями  сдвиги  в  гормональном  балансе  вносят  свой  вклад  в
изменение  структуры  и  функции  клеток  растительных  организмов  в
обычных  условиях  на  так  называемые  стрессовые  программы.

Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция - часть 6