содержание .. 742 743 744 745 ..

Том 3. Справочник по кожным болезням - часть 744

Титр Ig G

Титр Ig A

Титр Ig M

Заключение о наличии хламидийной
инфекции

Антибактериальное
лечение

>=400

>=200

<50

имеется

показано

В следующем наблюдении первичное исследование не дает оснований для выводов (Таблица 13), и только
повторение его через две недели позволяет вынести заключение. Отсутствие изменения титра антител (Таблица
15) за указанный период времени свидетельствует о персистенции хламидий, вызывающих образование IgA-
антител и об отсутствии показаний к назначению антибактериального лечения. В другом случае (Таблица 14)
увеличение в 2 раза титров IgG и IgA позволяет сделать вывод о присутствии хламидийной инфекции и наличии
показаний к назначению антбактериального лечения.

Таблица 13. Первичная инфекция (сомнительно). Реинфекция (сомнительно). Реактивация (сомнительно).
«Пограничные титры» в первой сыворотке

Титр Ig G

Титр Ig A

Титр Ig M

Заключение о наличии
хламидийной инфекции

Антибактериальное лечение

<100

50-100

<50

Возможна

Сомнительно

Не обязательно

Таблица 14. Первичная инфекция. Реинфекция. Реактивация. «Диагностические титры» во второй
сыворотке через 10-14 дней

Титр Ig G

Титр Ig A

Титр Ig M

Заключение о наличии
хламидийной инфекции

Антибактериальное лечение

>=200

<50

Имеется

Показано

Таблица 15. Хроническая персистенция антител без клинических проявлений. Диагностические титры во
второй сыворотке через 10-14 дней.

Титр Ig G

Титр Ig A

Титр Ig M

Заключение о наличии
хламидийной инфекции

Антибактериальное лечение

<100

50-100

<50

Присутствует персистирующие
хламидии, вызыющие
образование IgA-антител.
Клини-ническое значение
неизвестно.

Не показано

В случае обследования реконвалесцентов или при выявлении повышенных титров IgG, расценивающихся как
«серологическая находка» (Табл.16), динамическое наблюдение через две недели в случае отсутствия 4-х
кратного повышения титра IgG позволяет вынести заключение о неинфицированности и непоказанности
антибактериального лечения (Табл.17)

Таблица 16. Состояние после реконвалесценции – «остаточная серология» (сомнительно). Пограничные
титры в первой сыворотке.

Титр Ig G

Титр Ig A

Титр Ig M

Заключение о наличии
хламидийной инфекции

Антибактериальное лечение

>=10

<50

Сомнительно
необходимы проведение ПЦР,
культ. исследования

Сомнительно

Таблица 17. Состояние после реконвалесценции – «остаточная серология». Диагностические титры во
второй сыворотке через 10-14 дней.

Титр Ig G

Титр Ig A

Титр Ig M

Заключение о наличии
хламидийной инфекции

Антибактериальное лечение

>=100*

<50

Отсутствует

Не показано

*-в случае отсутствия 4-х кратного повышения титра между первой и второй сыворотками. Если это повышение
имеется, то отмечается текущая инфекция.

C января 1999 г. на российском рынке появились тест-наборы Chl. trachomatis IgG и IgA pELISA medac. Они
используют синтетический пептид из иммунодоминантной области МОМР. С помощью этого
высокоспецифичного антигена возможно выделение cпецифических антител к Chl.traсhomatis высокой
cтепенью чувствительности.

Преимущества теста:

-отсутствие ложноположительных результатов, обусловленных межвидовой перекрестной реакцией хламидий;

-отсутствие инфекционного антигенного материала;

-химически точная структура антигена;

-наличие стрипов позволяет экономично использовать тесты;

-пригоден для использования на автоматических открытых системах для ИФА.

ЗАО “Вектор-Бест” (Новосибирск) производит cледующие тест-системы для диагностики хламидиоза методом
ИФА:



ХламиБест-IgG-стрип

для выявления иммуноглобулинов классов G к Chl.trachomatis и Сhl.psittacci в

сыворотке крови ;



ХламиБест-Trachomatis IgG-стрип

. Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов

класса G к Chlamydia trachomatis в сыворотке (плазме) крови;



ХламиБест-IgM - стрип

. Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса М к

Chlamydia trachоmatis и Chlamydia psittaci;



ВектоХлами-антиген-стрип

. Тест-система для выявления антигена Сhlamydia trachomatis. Хромоген-

ОФД.



ВектоХлами-антиген-стрип

. Тест-сиcтема для выявления антигена Chlamydia trachomatis.

Выделение хламидий в культуре клеток МсСоу

Одним из лучших, но в то же время наиболее трудоемким является метод диагностики хламидий путем
выделения возбудителя в культуре клеток, обработанных различными антиметаболитами («золотой стандарт»).
Для этой цели обычно используют чувствительную культуру клеток, обработанную циклогексимидом.
Чувствительность культурального метода по сравнению с ПЦР составляет 70-80%, но в то же время он
превосходит молекулярно-биологические методы диагностики по специфичности. В литературе описаны случаи
выявления Сhlamydia trachomatis методом ПЦР при отрицательных результатах культурального теста и
наоборот.

Показаниями для диагностики хламидийной инфекции этим методом являются:



Беременность с отягощенным акушерским анамнезом.



Оценка эффективности проведенного антибактериального лечения.



Выявление чувствительности и резистентности к антибактериальным препаратам.



Выявление хламидий у ВИЧ-инфицированных или лиц со вторичными иммунодефицитными
состояниями (онкологические больные после проведенных курсов лучевой и химиотерапии,
трансплантации костного мозга; лица, получающие иммунодепрессанты; больные вирусным гепатитом
и туберкулезом).



Бесплодие неясного генеза.



Установление этиологии хронического инфекционного процесса урогенитального тракта.

Культуральный метод является референс-методом при оценке эффективности антибактериального лечения.
При исследовании биопроб методом ПЦР после курса химиотерапии в некоторых случаях можно получить
«ложноположительные с клинической точки зрения» результаты. Это связано с тем, что невозможно однозначно
оценить жизнеспособность микробной клетки на основании выявления фрагмента ее генома, используя только
данные молекулярно-биологических методов. В этом случае при исследовании клинического материала с
помощью культурального метода микробные клетки, потерявшие эти важные с клинической точки зрения
свойства, не дадут роста в клеточной культуре.

Для транспортировки и хранения клинического материала используют специальную питательную среду
(транспортная среда). Она разливается в пенициллиновые флаконы по 1 мл и хранится при температуре + 4

C в

течение 2-х месяцев. Состав транспортной среды: среда МЕМ с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого
скота и антибиотика гентамицина концентрации 50 мкг/мл , чаще используется среда 2SP.

Клинический материал после перенесения в транспортную среду хранится при температуре + 4

С и в

течение двух суток должен быть доставлен в лабораторию.

Процедура заражения клеток

1. Обработка однодневной клеточной культуры McCoy 1% раствором ДЕАЕ декстраном в течение 30

минут.

2. Заражение обработанных клеток материалом, полученным от больных.

3. Центрифугирование зараженных клеток при 2500 g в течение 60 минут.

4. Отмывка клеток питательной средой.

5. Добавление к клеткам ростовой среды, cодержащей циклогексимид.

6. Инкубирование клеток в течение двух суток при +36

7. Обнаружение хламидий в клетках методом прямой иммунофлюоресценции или ПЦР.

Реальный срок получения результатов этим методом – семь дней.

В настоящее время в литературе растет число сообщений о случаях резистентности хламидий к
антибактериальным препаратам (эритромицину, тетрациклину, доксициклину, фторхинолонам). Ценность
культурального метода состоит в том, что он является пока единственным методом, позволяющим выбрать
антибактериальный препарат для лечения хламидийной инфекции и оценить эффективность антибактериальной
терапии.

Схема метода выявления устойчивости хламидии трахоматис к антибактериальным препаратам

1. Хламидийным изолятом, выделенным от больного при посеве заражают чувствительные клетки.

2. К зараженным клеткам добавляют ростовую среду, содержащую антибиотик в различных дозах.

3. Зараженные клетки инкубируют 5 дней при температуре + 36

4. Чувствительность хламидий к антибиотику определяется по подавлению инфекции в зараженных

клетках, то есть по снижению числа клеток с внутриклеточными включениями. Процедура длительная,
занимает по времени две недели.

Диагностика Chlamydia trachomatis методом полимеразной цепной реакции

Дороговизна, длительность и трудоемкость микробиологического выделения хламидий в культуре
существенно затрудняет использование этой процедуры в рутинной лабораторной диагностике. В литературе
накоплен обширный клинико-лабораторный опыт по использованию метода ПЦР для выявления хламидии
трахоматис. Особое внимание при его использовании следует уделять, без сомнения, вопросам правильной
интерпретации получаемых результатов. Экстремально высокие показатели чувствительности и специфичности
ПЦР делают эту методику во многом революционной в лабораторной диагностике. Основными мишенями при
выявлении хламидии трахоматис являются нуклеотидная последовательность видоспецифической криптической
плазмиды, последовательность главного белка внутренней мембраны, рибосомальные гены.

Данная реакция представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза (амплификацию)
специфической области ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы,
дезоксинуклеотидтрифосфатов, соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок-праймеров,
определяющих границы амплифицируемого участка. Каждый цикл состоит из трех стадий с различными
температурными режимами. На первой стадии при 94

С происходит разделение цепей ДНК, затем при 56-58

C- присоединение (отжиг) праймеров к комплементарным последовательностям на ДНК-мишени, и при
температуре 72

C протекает синтез новых цепей ДНК путем достраивания цепей праймеров в направлении 5

. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 25-40

циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для
ее детекции с помощью электрофореза или альтернативными ему технологиями.

По сравнению с широко применяющимися иммунологическими тестами ПЦР-диагностика обладает рядом
преимуществ:



высокой и регулируемой специфичностью, обусловленной лишь нуклеотидной последовательностью,
применяемой в данной диагностической системе;



высокой чувствительностью, позволяющей диагностировать не только острые, но и латентные
инфекции (возможно выявление даже единичных бактерий или вирусов);



химическое сходство всех нуклеиновых кислот позволяет разрабатывать универсальные процедуры для
выявления различных инфекционных агентов;



возможностью идентификации возбудителя в течении 4,5-5 часов.

Доставка биоматериала в ПЦР-лабораторию производится в холодовом термоконтейнере или термосе со
льдом. Важной отличительной особенностью ПЦР-диагностики является относительно низкая стоимость
оборудования для проведения анализа, сочетающаяся с универсальностью метода, что позволяет выявлять весь
спектр клинически актуальных инфекционных агентов.

ПЦР-лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты). Cледует иметь не менее двух комнат:

-пре-ПЦР-помещение, где проводится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление
реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также
проводить в дополнительном отдельном помещении); в этих помещениях запрещается проводить все другие
виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты),
ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.

-пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации, в пост-ПЦР-помещении
допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной
лаборатории. Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует располагать как
можно дальше от пре-ПЦР-помещений. Следует исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР-
помещения в пре-ПЦР-помещение.

В комнате приготовления реакционной смеси и в комнате обработки клинических образцов должны быть
установлены ультрафиолетовые лампы, рабочие поверхности в лаборатории должны обрабатываться
дезинфицирующими растворами

Показания для диагностики Chl. trachomatis методом ПЦР

1. Острая фаза заболевания.

2. Хроническая фаза заболевания.

3. Установление этиологии хронического инфекционного процесса урогенитального тракта.

4. Беременность с отягощенным акушерским анамнезом.

5. Бесплодие неясного генеза.

6. Контроль эффективности проведенного антибактериального лечения. В случае выявления фрагмента ДНК
хламидии трахоматис после курса химиотерапии следует провести культуральную диагностику для исключения
«ложноположительного с клинической точки зрения результата». Если проведение культуральной диагностики
невозможно, то необходимо через 5-6 недель (полное обновление эпителиального покрова мочеполовых путей)
провести повторное исследование методом ПЦР.

7. Выявление хламидий у ВИЧ-инфицированных лиц, больных туберкулезом, вирусным гепатитом и со
вторичными иммунодефицитными состояними (онкологические больные после курсов химио- и лучевой
терапии, трансплантации костного мозга, получающие иммуносупрессивную терапию).

В 1991 году компания Хоффман-ла Рош ЛТД получила от компании Cetus права и патенты на использование
ПЦР. В этом же году была создан Roche Molecular Systems, занимающийся исключительно вопросами развития
и совершенствования ПЦР. В 1992 году были внедрены первые стандартизованные тест-системы для
клинической ПЦР-диагностики AMPLICOR Chlamydia trachomatis, а в 1993 году начато производство этих тест
систем. Многочисленные проведенные исследования показали высокую чувствительность и специфичность
данного набора. Это позволило получить данной тест-системе сертификат Food and Drug Administration (FDA) в
1993 году. В 1995 году появился новый набор AMPLICOR Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae для
одновременной их детекции в одной пробирке. В тесте использованы биотинилированные праймеры
(СР24/CР27) из криптической плазмиды Chl. trachomatis. Чувствительность теста составляет 10 копий/мл,
специфичность 99,6%. Тест-система включает: набор для сбора и транспортировки образцов, набор для
выделения ДНК из цервикальных, уретральных образцов и мочи, набор для амплификации и детекции. Все
наборы стандартизованы, полностью готовы к использованию, имеют внутренний контроль, систему защиты от
контаминаций.

Научно-производственной фирмой “Литех” при НИИ физико-химической медицины МЗ РФ выпускается
набор реагентов “Полимик” в виде трех отдельных наборов для определения соответственно Chlamydia
trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealiticum. Каждый набор «Полимик» комплектуется отдельным
набором для выделения ДНК из биопроб. Инструкция по применению набора реагентов рекомендована к
утверждению экспертной комиссией Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ (протокол No 3 от
18.03.96 г.) и утверждена Министерством здравоохранения РФ 17.05.96 г. (ТУ 9398-405-17253567-96).

В состав реакционной смеси набора «Полимик» входит внутренний контроль (рекомбинантная плазмида,
содержащая фрагмент-вставку размером 308 н.п.). Этот компонент позволяет контролировать процесс
прохождения реакции амплификации, а также тестировать наличие в пробах веществ, ингибирующих ПЦР.
Полоса, соответствующая внутреннему контролю, должна проявляться как в положительном и в отрицательном
контролях, так и во всех тестируемых пробах.

При выделении ДНК из биопробы («Набор для выделения ДНК») используется метод экстракции ДНК из
клеток хламидий с помощью гуанидина тиоцианата и связывания высвобождающихся нуклеиновых кислот с
частицами крупнопористого стекла. Это позволяет оптимизировать условия выделения и подготовки проб для
амплификации, а также уменьшить количество манипуляций с образцом. При этом все манипуляции проводятся
в одной пробирке. Выход хромосомной ДНК составляет 70-80% по результатам определения числа
колониеобразующих единиц клеток Acholeplasma laidlawii (штамм микоплазм, взятый в качестве стандарта) как

в случае чистой культуры, так и при добавлении этих клеток к клиническому материалу, не содержащему
определяемых инфекционных агентов.

После завершения ПЦР продукты амплификации фракционируют методом электрофореза в 1,5% агарозном
геле.

Анализ результатов диагностики

1. В положительном контрольном образце для хламидии выявляется полоса размером 501 н.п.

2. В отрицательном контрольном образце полоса, соответствующая фрагментам генома, хламидии должна
отсутствовать. Появление полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации компонентов
набора.

3. В анализируемой пробе отсутствие полосы строго на уровне соответствующего контроля свидетельствует об
отсутствии возбудителя в пробе, наличие полосы, соответствующей по электрофоретической подвижности
положительному контролю, свидетельствует о наличии хламидии в клинической пробе.

4. Во всех образцах выявляется полоса оранжево-красного цвета, соответствующая внутреннему контролю
размером 308 н.п. Полученные результаты можно документировать фотографированием гелей с использованием
оранжевого или интерференционного (594 нм) светофильтра. При использовании видеосистемы “Gel-doс”
возможно документирование результатов электрофореза в виде компьютерного файла, доступного любым
приложениям «Windows».

Набор «Полимик» следует хранить при температуре - 18-20

С в течение всего срока годности (6 месяцев).

Допускается хранение и транcпортировка набора при температуре не выше 0

градусов не более одних суток.

В настоящее время (по состоянию на третий квартал 2000 г.) Минздравом России помимо набора «Полимик»
разрешены следующие диагностические наборы для обнаружения хламидии трахоматис методом ПЦР в
качестве изделий медицинского назначения:



набор реагентов амплификационный для определения ДНК хламидий (Хламидия-Ампли-тест) ТУ 9398-
402-18137053-96 производства АО «ВНЦМДЛ», Москва;



набор реактивов для выявления нуклеотидных последовательностей хламидия трахоматис методом
ПЦР (Хлам Ам) ТУ 9398-403-29032954-96 производства ЗАО «Внедрение систем в медицину», Москва;



набор реагентов для выявления ДНК хламидии трахоматис методом ПЦР (Хлам-Ген) ТУ 9398-412-
46482062-97 производства НПФ «ДНК-технология», Москва.

В таблицах 18 и 19 приведены данные А.В. Савичевой и М.А. Башмаковой по выявлению хламидии
трахоматис в клинических пробах различными методами исследования. Использованы выборки из
исследований, в которых хотя бы одним из методов они были бы обнаружены. Видно преимущество ПЦР как
при исследовании первичных материалов, так и при детекции ДНК хламидий в клеточной культуре, зараженной
клиническим материалом. В таблице 20 приведены данные о недостатках и достоинствах этих методов.

Таблица 18. Сравнительная чувствительность прямых методов исследования (ПИФ, ПЦР, ИФА) при
выявлении Сhl.trachomatis в клинических образцах

Методы детекции

Выявление хламидий (в %) в одних и тех же пробах

ПИФ

68,9

ПЦР

94,8

ИФА

25,62

Таблица 19. Сравнительная чувствительность прямых методов исследования (ПИФ, ПЦР) при
выявлении Chl.trachomatis в клеточной культуре, зараженной клиническим материалом

Методы детекции

Выявление хламидий (в %) в одних и тех же пробах

ПИФ

ПЦР

96,2

-локальное образование секреторного иммуноглобулина А;

-цитотоксическая защита посредством Т-лимфоцитов;

-образование антител классов IgM, IgA, IgG к хламидийному липополисахаридному антигену.

Изменения показателей иммунитета системы при острых поражениях нижнего отдела урогенитального тракта
(уретрит, цервицит), как правило, неотчетливы. При хронизации и распространении процесса (спальпингит,
простатит, артриты) они приобретают стойкий характер.

У больных хламидийной инфекцией отмечается снижение уровеня нейтрофилов и повышение содержания
эозинофилов. При исследовании клеточного звена иммунитета непрямым иммунофлюоресцентным методом с
помощью моноклональных антител, определении концентрации IgG,A,M методом радиальной иммунодиффузии
могут выявляться следующие нарушения: в гуморальном звене - снижение IgG и IgA при снижении
относительного содержания клеток СД 72 (В-лимфоцитов). Дисбаланс клеточного звена иммунитета
выражается в достоверном снижении клеток СД4 (относительное содержание), тенденции к повышению СД8,
очевидно, за счет роста цитотоксических клеток и, как следствие, снижение иммунорегуляторного индекса.
Факторы неспецифического иммунитета характеризуются значительным повышением относительного
содержания популяции естественных киллеров, а также недостаточной функциональной активностью опсоно-
фагоцитарной системы.

Для клинициста такое иммунологическое обследование больного хламидийной инфекцией
необходимо для обоснованного назначения иммуномодулирующих препаратов, в частности,
оказывающих стимулирующее действие на нейтрофильно-фагоцитарное и Т-клеточное звено
иммунитета. Необходимо осуществлять индивидуальный подбор иммуномодуляторов на
основании изучения функциональной активности полиморфноядерных лейкоцитов системы
фагоцитоза методом люминолзависимой хемолюминесценции (ЛЗХЛ). Основанием для
назначения того или иного препарата является максимальное по сравнению с другими
повышение активности фагоцитов, детектируемое амплитудой вспышки ЛЗХЛ в момент
внесения данного препарата в исследуюмую пробу крови.

Основные принципы лечения больных хламидийной инфекцией

Имеющиеся сведения об этом инфекционном процессе позволяют высказать ряд положений, которые следует
учитывать при лечении хламидиоза. Chl.trachomatis высоко адаптированы к жизни внутри клеток, что
обуславливает трудности ее элиминации в процессе фагоцитоза. Клетка организма-хозяина используется
хламидиями как поставщик строительного материала и энергии для размножения и персистенции, а также для
диссеминации возбудителя, как это отмечено на примере возникновения хламидийного менингоэнцефалита
после массажа уретры или простаты. Проницаемость клеточных мембран для большинства антибиотиков
низкая, их концентрация внутри клетки не достигает того уровня, который создается в крови. Пока еще
неизвестно, на какую стадию развития хламидий действуют антибиотики. Латентность и тенденция к
внезапному проявлению свежих поражений характерны для хламидийной инфекции как до лечения, так и после
него за счет сохранения жизнеспособных элементов хламидий внутри эпителиальных клеток аналогично тому,
как они сохраняются в культуре клеток, подвергнутой действию антибиотика. После нескольких пассажей на
свежих клеточных культурах снова появляются внутриклеточные включения из сохранившихся
жизнеспособных телец. Персистирование хламидий в организме у части больных в течение ряда лет, несмотря
на проведенное лечение, свидетельствует о том, что у разных больных курсы лечения антибиотиками дают
разные результаты, в особенности при осложненных формах (А.М.Савичева, М.А. Башмакова, 1998).

Основные схемы лечения хламидийной инфекции

1.Этиотропная терапия (антибактериальные препараты).

2. Патогенетическая терапия.

3. Эубиотическая терапия.

4. Воздействие на неспецифическую резистентность организма.

содержание .. 742 743 744 745 ..