Том 3. Справочник по кожным болезням - часть 607

сыворотки   кролика,   разведенной  1:2  изотоническим   раствором   натрия   хлорида,   желатина   и   раствора

человеческого   альбумина.   Альбумин   готовят   на   изотоническом   растворе   натрия   хлорида,   стерилизуют

фильтрацией через бактериальный фильтр (пригоден только сухой альбумин, лиофильно высушенный); каждый

раз   при   употреблении   новой   серии   следует   испытать,   параллельно   со   старой,   новую   серию.   Весь   запас

ингредиентов хранится в обычном рефрижераторе.

На 10 сывороток требуется 1,2 мл 0,2 % раствора желатина, 2,8 мл 5 % раствора альбумина и 1,6 мл взвеси

трепонем. Вымывание трепонем обычно производят разведенной кроличьей сывороткой, но можно с самого

начала использовать указанную среду сохранения. Особенно следует обращать внимание на возможность у

кроликов спонтанного спирохетоза, при котором могут наблюдаться положительные результаты реакции или

спонтанная агглютинация трепонем.

При хранении ингредиентов рН среды может меняться. В случае окисления среды к ней следует добавить 1

% стерильный раствор натрия гидрокарбоната до рН 7,2.

Реакция протекает только при условии избытка комплемента, поэтому применяют различные количества

комплемента, что в значительной степени зависит от примененной среды. При пользовании одной и той же

средой установлено, что чем больше взято комплемента, тем больше находят иммобилизованных трепонем, а

чем   меньше   комплемента,   тем   больше   подвижных   трепонем.   При   употреблении   желатиновой   среды

оптимальное количество комплемента равно  0,15  мл на каждую пробирку. Комплемент применяется свежий,

полученный от морской свинки. Консервированный комплемент непригоден.

Техника   постановки   реакции.  Пронумерованные   пробирки   с   сыворотками   расставляют   в   штативе.   В

журнале нечетными номерами отмечают все смесители, в которые добавлялся активный комплемент (опыт), и

четными номерами  -  куда добавлялся инактивированный комплемент (контроль). Комплемент добавляют не

для каждой сыворотки отдельно, а готовят «коктейль», т. е. предварительно соединяют комплемент с антигеном

в нужных соотношениях для всех сывороток. Взвесь трепонем в питательной среде из расчета по  0,3  мл на

каждую   сыворотку   делят   на  2  части   и   добавляют   в   один   флакон   активный   комплемент,   а   в   другой  -

инактивированный.

В стерильный смеситель для лейкоцитов набирают сыворотку до метки  1.  Конец смесителя стерильной

ваткой вытирают от сыворотки, оставшейся на стенках. Это необходимо, так как при попадании положительной

сыворотки в антиген в последующих сыворотках могут быть получены неверные результаты. Во избежание

загрязнения при больших постановках разливают антиген параллельно в два флакона. После этого набирают

взвесь   трепонем   с   активным   комплементом   до   метки  2.  В   другой   смеситель   набирают   взвесь   трепонем   с

инактивированным   комплементом.   Оба   конца   каждого   смесителя   закрывают   резиновым   кольцом,   как   для

транспортировки   крови,   взятой  для  клинического   исследования,   и   встряхивают   для   смешивания.   (При

отсутствии  таких колец  их можно сделать,  разрезав  полую  резиновую  трубку диаметром  до  1  см вдоль  и

соединив   концы).   Кольца   до   опыта   и   каждый   раз   после   его   проведения   следует   кипятить.   Во   избежание

возможного влияния некоторых сортов резины места ее соприкосновения со смесителем следует смазывать

стерильным вазелиновым маслом. Можно не закрывать концы смесителя резиновыми кольцами, а заливать их

парафином   с   температурой   плавления   выше   50°С   (парафин   с   более   низкой   температурой   плавления

непригоден, так как при помещении смесителей в термостат парафин может стечь и герметичность системы

будет нарушена), однако это менее удобно. Благодаря тому, что оба конца смесителя закрыты, прекращается

доступ воздуха, взвесь трепонем находится в относительно анаэробных условиях.

Для контроля набирают в те же смесители все взвеси с активным и инактивированным комплементом, а

также   одну   взвесь   без   комплемента.   Ставят   также   реакцию   иммобилизации   с   сыворотками,   заведомо

отрицательными и заведомо положительными, оставшимися от прошлой постановки.

Заполненные и закрытые смесители помещают в специальный штатив или коробку с вырезами. На каждый

смеситель надевают нумерованные кольца из картона. Смесители помещают в термостат при температуре 35 °С

на 18-20 ч. Для регистрации опыта через 18 ч смесители вынимают из термостата попарно - опыт и контроль.

Подсчет   подвижных   и   неподвижных   трепонем.  По   количеству   смесителей   в   штативе   расставляют   и

нумеруют   маленькие  пробирки  (12х60  мм).   Содержимое   смесителя   выливают   в  соответствующую  нумеро-

ванную пробирку, перемешивают тем же смесителем с надетой на него пипеткой и наносят каплю взвеси с

активным комплементом на левую сторону предметного стекла, а на правую сторону  -  с инактивированным

комплементом той же сыворотки; посредине стекла ставят номер сыворотки. Капли накрывают покровными

стеклами 20х20 мм. Капли должны быть небольшими, иначе трепонемы «плывут» с током жидкости, и тогда

суждение   об   их   подвижности   и   подсчет   затруднительны.   Учет   результатов   реакции   начинают   с   инак-

тивированного   комплемента.   Подсчитывают  25-30  трепонем   и   отмечают,   какое   количество   среди   них

подвижных   и   какое  -  неподвижных.   Если   в   контроле   содержится   меньше  17  подвижных   трепонем   из  25

сосчитанных,   то   такой   опыт   непригоден   и   его   следует   повторить.   В   пробирках   с   инактивированным

комплементом отсутствие подвижности трепонем объясняется не иммобилизацией, а токсичностью сыворотки

или недостаточно высоким качеством среды сохранения (зафязнение бактериями, примесь медикаментов и т.

д.).

При   определении  подвижности   трепонем  следует  учесть,  что  движения  трепонем  различны.  Они   могут

обладать весьма активной подвижностью, особенно отчетливы сгибательные движения, а иногда отмечаются

только винтовые движения. Иногда трепонема лежит как бы неподвижно, но если присмотреться, то видно, что

через некоторое время она начинает активно двигаться. Следует также уметь отличать активные движения

трепонемы от движения с током жидкости.

В пробирках, в которые вылили содержимое смесителей, в дальнейшем определяют остаточный комплемент

(во всех пробирках опыта и контроля). Пробирки с инактивированным комплементом служат как бы контролем

для сравнения происшедшего гемолиза.

Расчет специфической иммобилизации производят по следующей формуле:

Число подвижных трепонем 

___

число подвижных в контроле

в контроле

 

     

        

        

        

        

        

        

        

        

        

   трепонем в опыте

 

    

        

        

        

   

• 100

Число подвижных трепонем в котроле

Реакция иммобилизации считается положительной, когда процент иммобилизации выше 51; от 31 до 50 % -

слабоположительной; сомнительной - от 21 до 30% и отрицательной - ниже 20 %.

Опыт   с   сомнительными,   а   иногда   и   слабоположительными   результатами   следует   повторить;   при   этом

можно   получить   или   положительный,   или   отрицательный   результат.   Неудовлетворительным   считается

результат, если  имеется  большое бактериальное загрязнение или  отмечается  токсичность  сыворотки. Такие

исследования следует  повторить  с новой  порцией сыворотки. Целесообразно также подвергать  повторному

исследованию все сыворотки, давшие полное расхождение со стандартными серологическими реакциями. Эти

сыворотки заслуживают особого внимания, так как в таких случаях результаты РИБТ могут дать опору для

суждения о наличии или отсутствии сифилиса.

При постановке опыта обращают внимание на соблюдение стерильности и чистоты посуды. Она должна

быть   свободна   от   примеси   веществ,   могущих   оказать   вредное   влияние   на   жизнеспособность   трепонем.

Смесители и всю посуду моют сначала холодной водой, затем горячей, споласкивают дистиллированной водой,

не   применяя   никаких   дезинфицирующих   средств.   Смесители   стерилизуют   в   автоклаве,   подсушивают   в

сушильном шкафу.

Описанная методика РИБТ достаточно проста и дает возможность ставить реакцию иммобилизации всюду,

где   имеются   квалифицированный   персонал   и   возможность   содержать   кроликов.   Этот   метод   можно

использовать также с другими питательными средами.

Реакция  иммунного прилипания бледных трепонем  (РИП)  Приводится по методическим рекомендациям,

составленным   Г.П.   Авдеевой   (Узбекский   научно-исследовательский   кожно-венерологический   институт).

основана   на   том,   что   вирулентные   тканевые   трепонемы,   сенсибилизированные   сывороткой   больного

сифилисом,   в   присутствии   комплемента   и   эритроцитов   прилипают   к   поверхности   эритроцитов   и   при

центрифугировании увлекаются с ними в осадок, исчезая из надосадочной жидкости.

Перед началом работы, связанной с приготовлением антигена из бледных трепонем, в кастрюлю объемом 2-

3 л наливают на 2/3 дистиллированной воды и в процессе работы складывают в нее колбы, пробирки, пипетки,

предметные   стекла,   загрязненные   антигеном.   Готовят   также   почкообразный   тазик,   заливаемый   на  2/3  дис-

тиллированной   водой,   куда   складывают   покровные   стекла   после   работы.   Приготовление   препарата   для

подсчета бледных трепонем необходимо проводить с максимальной точностью, так как при неточном разливе

ингредиентов,   при   избытке   или   недостатке   исследуемого   материала   в   препарате   можно   получить

недостоверные результаты. Учет результатов следует проводить в день постановки реакции, лучше всего тут же

после   центрифугирования,   так   как   при   длительном   стоянии   пробирок  (15-24  ч)   возможны

ложноположительные результаты. Покровные стекла должны иметь размеры только 24х24 мм. Надосадочную

жидкость берут микропипеткой объемом 0,1 мл.

Для   постановки   реакции   используются   следующие   ингредиенты:   испытуемая   сыворотка,   антиген,

комплемент, эритроциты донора, изотонический раствор натрия хлорида. Кровь берут из вены и обрабатывают,

как   для   реакции   Вассермана.   Сыворотку   крови   инактивируют   в   водяной   бане   при   температуре   55-56°С   в

течение 30 мин.

В   качестве   антигена   используют   взвесь   бледных   трепонем   штамма   Никольса.   Здоровым   кроликам

интратестикулярно вводят по  0,75-1  мл взвеси бледных трепонем, содержащей не менее 60-70 особей в поле

зрения. На 7-12-й день кролика забивают воздушной эмболией, вводя  20  см

3

  воздуха в ушную вену. Яички

удаляют, очищают от оболочек, жира, освобождают от придатков и разрезают на мелкие кусочки, которые

затем помещают в стерильную колбу, заливают 10-15 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида.

После этого всю жидкость из колбы отсасывают пипеткой в пробирку и определяют в ней число бледных

трепонем.   Для   этого   микропи-геткой   из   пробирки   наливают  0,01  мл   на   предметное   стекло,   покрывают

покровным стеклом и смотрят в темном поле зрения. Если число бледных трепонем в поле зрения достигает

100, то в колбу с тканями яичка добавляют 50 мл, а если 50, то 20-25 мл стерильного изотонического раствора

натрия хлорида и производят встряхивание в шюттель-аппарате в течение  50  мин. Первую  порцию  взвеси

бледных   трепонем   уничтожают   (она   не   может   быть   использована   в   качестве   антигена).   Вторую   порцию

жидкости,   полученную   при   экстрагировании,   отсасывают   стерильной   пипеткой,   разливают   в   химические

пробирки  и снова определяют  в ней  число бледных трепонем в поле зрения. При наличии в этой  порции

жидкости 50-100 бледных трепонем яички можно подвергать повторным экстрагированиям с новыми порциями

изотонического раствора натрия хлорида до тех пор, пока в антигене не будет не менее 20 бледных трепонем в

поле   зрения.   После   каждого   экстрагирования   жидкость   из   колбочки   отсасывают   пипеткой   в   стерильные

химические   пробирки   и   центрифугируют   при  1000  об/мин   в   течение  15  мин.   Надосадочную   жидкость

отсасывают (или сливают) из всех пробирок в одну стерильную колбочку, прогревают при температуре 56°С в

течение  30  мин, и в ней определяют число бледных трепонем в темном поле зрения, просматривая  10  полей

зрения.   Ампулирование   производят   сразу   или   на   2-3-й   день   после   приготовления   антигена.   На   ампулах   с

антигеном обозначают серию антигена, дату его изготовления и среднее число бледных трепонем в одном поле

зрения. Перед каждой постановкой РИП необходимо определять количество бледных трепонем в антигене.

Рабочий антиген должен содержать 15-20 бледных трепонем в поле зрения. Антиген применяется в дозе 0,3 мл

для каждой испытуемой  сыворотки. Расчет  необходимого количества  антигена делается  в день  постановки

реакции. Например, для исследования 50 сывороток крови нужно 0,3х55, что в результате дает 16,5 мл рабочего

антигена (поскольку необходимо взять на 5 пробирок больше с учетом контролей и случайных потерь).

Комплемент   растворяют   согласно   указанию   на   этикетке,   вводят   в   дозе  0,05  мл   в   опыт.   Так,   для

исследования  50  сывороток крови необходимо  0,05  мл х  55,  т. е.  2,75  мл комплемента. Взвесь эритроцитов

готовят так: применяется только цитратная кровь донора  0(1)  группы, которую взбалтывают до получения

однородной смеси, наливают в центрифужные пробирки и трижды отмывают изотоническим раствором натрия

хлорида. Надосадочная жидкость должна быть прозрачной и негемолизированной. Из осадка отмытых эрит-

роцитов готовят  50 %  взвесь их в изотоническом растворе натрия хлорида, которую наливают в пробирки в

дозе 0,1 мл для каждой испытуемой сыворотки. Расчет необходимого количества эритроцитов для 50 сывороток

производят следующим образом: 0,1 мл х 55, получается 5,5 мл (в данном случае 3 мл отмытых эритроцитов и 3

мл изотонического раствора).

Техника   постановки.   Предварительно   для   реакции   разводят   все   ингредиенты.   На   дно   центрифужной

пробирки микропипеткой наливают  0,05  мл испытуемой сыворотки, добавляют  0,35  мл смеси  комплемента

(0,05 мл) с антигеном  (0,3  мл). Пробирки энергично встряхивают в течение 30  с и оставляют при комнатной

температуре на 30 мин; затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл взвеси эритроцитов, пробирки энергично

встряхивают в течение 30 с и оставляют в термостате при температуре 37°С на 30 мин, после чего все пробирки

центрифугируют при 1000 об/мин в течение 3 мин.

Учет результатов проводят путем подсчета бледных трепонем в надосадочной жидкости. Для этого 0,01 мл

надосадочной жидкости микропипеткой наносят на предметное стекло, покрывают  покровным стеклом и в

темном   поле   зрения   подсчитывают   число   бледных   трепонем   в  10  полях   зрения.   Для   облегчения   подсчета

рекомендуется   использовать  11-клавишный   лейкоцитарный   счетчик.   При   этом   на   первой   клавише   (слева)

учитывается число полей зрения, а на последней клавише (справа)  -  число трепонем в  10  полях зрения. При

просмотре препарата под микроскопом учитываются только те бледные трепонемы, которые могут свободно

перемещаться   с   током   жидкости.   Те   же   трепонемы,   которые   попали   в   поле   зрения   с   током   жидкости

дополнительно, после начала подсчета  («приплывшие»), в этом поле зрения уже не учитываются. Процент

прилипания бледных трепонем исчисляется по формуле:

100 – О

 

 n  

* 100

K

где On - число бледных трепонем в 10 полях зрения из опытной пробирки; К - число бледных трепонем в 10

полях зрения из контрольной пробирки.

При иммунном прилипании бледных трепонем, равном 0-20%, результат расценивается как отрицательный;

21-30% -  как сомнительный;  31-50 % -  слабоположительный  и при  51-100%-как  положительный. В ответе

результат реакции выписывается без указания процента. В случае несовпадения результатов РИП сданными

других реакций необходимо провести повторный учет результатов РИП с вновь приготовленным препаратом,

повторить постановку реакции с этой же сывороткой крови, при необходимости повторить РИП с сывороткой

крови, взятой у обследуемого повторно.

РИП   следует   применять   в   следующих   случаях:   при   диагностике   тех   форм   сифилиса,   когда   на   основании

данных   анамнеза,   клиники,   результатов   КСР   и   других   исследований   не   удается   подтвердить   диагноз

заболевания; при дифференцировании неспецифических результатов КСР; при контрольном наблюдении после

окончания лечения. Специфичность и чувствительность РИП близки РИБТ и РИФ.

Реакция гемагглютинации с бледными трепонемами (ТРПГА). Принцип метода заключается в следующем:

формалинизированные тонизированные бараньи эритроциты соединяются с экстрактом из патогенных бледных

трепонем.   Образующийся   комплекс,   который   фиксируется   на   эритроцитах,   составляет   корпускулярный

антиген. При соединении антигена с сывороткой, содержащей гомологичные антитела, образуется иммунный

комплекс, который вызывает агглютинацию эритроцитов. Антигеном для этой реакции являются эритроциты

барана или индюка, покрытые частицами бледных трепонем от зараженных кроликов, а затем фрагментирован-

ные ультразвуком. Адсорбирующий разбавитель (состоит из фрагментов эритроцитарных мембран барана либо

индюка   и   быка,   трепонем   Рейтера,   ткани   семенников   кролика,   кроличьей   сыворотки)   заливают   в   лунки

пластин, куда затем вносят инактивированную сыворотку. Разбавитель связывает неспецифические групповые

антитела.   Специфические   иммуноглобулины   к   бледным   трепонемам   вызывают   агглютинацию.

Предварительный результат может быть зарегистрирован после инкубации в течение 3-4 ч. Появление равно-

мерной розовой окраски указывает на положительный результат, а агглютинат (преципитат) темно-красного

цвета   в   виде   пятна   или   кольца   является   показателем   осаждения   эритроцитов.   ТРПГА-тест,   выполняемый

вручную или автоматизированным методом, является достаточно специфичным и чувствительным тестом.

Реакция микрогемагглютинации с бледными трепонемами (МНА-ТР) является вариантом ТРПГА. Ее ставят

на   пластинках   для   микротитрования.   Она   требует   по   сравнению   с   ТРПГА   намного   меньшего   количества

сыворотки,   адсорбирующего   разбавителя   и   антигена.   Окончательный   результат   получают   уже   после  4  ч

инкубирования   сыворотки.   Автоматизированная   реакция   микрогемагглютинации   с   бледными   трепонемами

(АМНА-ТР) благодаря автоматизации процессов заполнения тест-пластин и разведения сыворотки еще проще и

обходится   еще   дешевле,   чем   реакция   АМН-ТР.   Она   особенно   пригодна   при   массовых   обследованиях   на

сифилис.

Клиническая оценка результатов серологических реакций.

При первичном серонегативном периоде сифилиса бывают положительными РИФ и реакция Колмера как

наиболее чувствительные серореакции. Однако это не является основанием для постановки таким больным

диагноза   первичного   серопозитивного   сифилиса.   У   ряда   больных   в   этом   периоде   бывает   изолированный

положительный   результат   при   постановке   реакции   Вассермана   с   трепонемны-ми   или   с   кардиолипиновым

антигенами. В конце 3-й или в течение 4-й недели после появления первичной сифиломы становятся поло-

жительными стандартные серологические реакции  -  с этого момента начинается первичный серопозитивный

период   сифилиса.   На   1-2-й   неделе   первичного   серопозитивного   сифилиса   отмечается   увеличение   степени

позитивности серореакции (1+, 2+, 3+) и нарастание титра реагинов (1:5, 1:10, 1:20). РИФ и реакция Колмера

уже у всех больных дают резко положительный результат, но РИБТ, как правило, отрицательная или процент

иммобилизации   очень   низок.   Диагноз   первичного   серопозитивного   сифилиса   ставится   и   тем   больным,   у

которых осадочные реакции и реакция Вассермана с неспецифическими антигенами дали даже однократный

слабоположительный результат. При дальнейшем течении первичного сифилиса все серологические реакции

становятся   резко  положительными  (4+);   титр  реагинов  достигает  1:80,  1:160,  РИФ  продолжает  быть  резко

положительной,   но   РИБТ   у   большинства   больных   еще   остается   отрицательной   или   может   стать

слабоположительной.

При вторичном свежем сифилисе резко положительный результат по всем стандартным серологическим

реакциям наблюдается почти в 100% наблюдений; титр реагинов наиболее высок - 1:160; 1:240 или 1:320. РИФ

- 4+;  РИБТ дает  положительнй  результат  более чем у половины больных, однако процент иммобилизации

трепо-нем невысок (40-60%).

При вторичном рецидивном сифилисе положительный результат по стандартным серологическим реакциям

отмечается   в  96-98%  наблюдений.   Отрицательные   результаты   могут   иногда   объясняться   малосимптомным

рецидивным   течением,   наличием   астенизации   и   сочетанием   сифилиса   и   ВИЧ-инфекции.   РИБТ   дает

положительный результат у 85-90% больных при выраженной степени иммобилизации - 80-90-100%.

Третичный   сифилис   характеризуется   положительными   результатами   по   стандартным   серологическим

реакциям   в  50-90%  наблюдений   и   положительной   РИБТ   у  92-100%  пациентов   с   высоким   процентом

иммобилизации.

Диагноз   скрытого   серопозитивного   сифилиса,   как   указывалось   выше,   устанавливают   только   по

положительным серореакциям в крови с обязательным подтверждением их по РИБТ, так как только РИБТ (и в

меньшей   степени   РИФ)   позволяет   отдифференцировать   ложноположительные   серореакции   (даже   с

позитивностью в 2+ или 3+) от истинно положительных.

Разные   формы   сифилиса   нервной   системы   и   висцерального   сифилиса   имеют   различную   частоту   и

выразительность стандартных серореакции. Так, прогрессивный паралич в 100% случаев сопровождается резко

положительными всеми стандартными серологическими реакциями. Сифилис сосудов мозга, спинная сухотка,

сифилитическое  поражение сердечно-сосудистой  системы сопровождаются положительными серореакциями

лишь в 40-50-60% наблюдений. Однако РИБТ почти при всех перечисленных патологических состояниях дает

резко положительный результат (90-100% иммобилизации).

При диагностировании врожденного сифилиса в первые 2 мес после рождения стандартные серологические

реакции у ребенка не определяют, т. к. они могут быть положительными за счет пассивной передачи реагинов

через плаценту. По этой же причине не имеет значение и положительный результат РИБТ. Пассивно передан-

ные от матери ребенку имобилизины самопроизвольно исчезают в течение 6 мес после рождения. Если ребенок

инфицируется незадолго до родов, то в этом случае РИБТ будет еще отрицательной (в связи с более поздним

образованием иммобилизинов), несмотря на наличие в организме ребенка сифилитической инфекции.

При врожденном сифилисе детей грудного возраста с активными проявлениями стандартные серореакции

могут быть отрицательными в 1% наблюдений.

При врожденном сифилисе раннего детского возраста отрицательные стандартные серореакции варьируют

от 15 до 20%, но в этих случаях РИБТ дает положительные данные у 90-98% детей.

При   позднем   врожденном   сифилисе   даже   при   наличии   активных   проявлений   стандартные   серореакции

констатируются лишь у 70-80% обследованных, но зато РИБТ четко положительная у 100% больных с высоким

титром иммобилизинов.

Современные усовершенствованные серореакции с использованием принципов иммуноферментных

констант.

Несмотря на значительное количество тестов для серодиагностики сифилиса, их высокую чувствительность

и   специфичность   имеется   ряд   состояний   при   которых   данные   серодиагностики   требуют   проверки   и

дополнительных исследований. Например, у пациентов, полноценно леченных по поводу сифилиса, иногда

длительное время остаются положительными серореакции. Это объясняется состоянием серорезистентности,

которое   до   настоящего   времени   не   получило   научной   трактовки.   Затрудняется   также   дифференциальная

диагностика   неведомого   сифилиса   от   рецидива   процесса   и   реинфекции.   С   целью   разработки   более

информативных   вариантов   серореакции   были   использованы   детали   антителообразования   у   больных

сифилисом, с предложением и исследованием следующих вариантов серореакции: метод иммуноферментного

анализа (ИФА), метод иммуноблоттинга (IgM-серология), полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Иммуноферментный анализ.

Метод   иммуноферментного   анализа   (ИФА,  The  enzymelinked  immunosorbent  Assay,  Elisa)   широко

используется   для   диагностики   сифилиса.   Принцип   реакции   заключается   в   соединении   сифилитического

антигена, сорбированного на поверхности твердофазного носителя, с антителом испытуемой сыворотки крови и

выявления   специфического   комплекса   антиген  -  антитело   с   помощью   антивидовой   иммунной   сыворотки,

меченной ферментом. Взаимодействие фермента с субстратом дает цветную реакцию, интенсивность которой

зависит от количества связанных сывороточных антител.

В   нашей   стране   методика   постановки   ИФА   для   серодиагностики   сифилиса   с   отечественными

ингредиентами разработана в отделе микробиологии ЦНИКВИ. При исследовании  1609  образцов сыворотки

крови и спинномозговой жидкости выявлена чувствительность, составившая 95,2%, и высокая специфичность.

Отрицательные   результаты   ИФА   у   полноценно   леченных   больных   сифилисом   могут   служить   критерием

излечения (Дмитриев Г.А.). При автоматизированном учете результатов эта реакция используется для профи-

лактического освидетельствования на сифилис больших групп обследуемых: доноров, беременных и др.

Тест для выявления IgG (Captia Syphilis G test) - тест-ловушка использует в качестве антигена очищенные

патогенные   трепонемы.   У   больных   с   вторичным,   ранним   и   поздним   сифилисом   и   нейроси-филисом   и   у

реинфицированных пациентов чувствительность теста 100%. Тот же принцип ловушки для антител применен с

целью определения сывороточных IgM (Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е.).

Метод иммуноблоттинга.

При   проведении   иммуноблоттинга   трепонемы   подвергаются   электрофорезу   с   разделением   белковых

иммунодерминант   на   нитроцеллюлозе.   Затем   производится   обработка   разделенных   точек   исследуемой

сыворотки и антителами к IgG либо IgM, меченными ферментами или радиоактивными веществами.

lgM-серология.

При   изучении   антителообразования   в   организме   больных   сифилисом   установлено,   что   первыми   после

заражения вырабатываются специфические IgM, выявляемые уже на 2-й нед после заражения и достигающие

максимальной концентрации в крови на 6-9 нед. Через 6 мес после окончания терапии у большинства больных

в   крови   они   не   определяются,   На   4-й   нед   после   инфицирования   организм   начинает   продуцировать   в

достаточной степени специфические IgG. Этот вид иммуноглобулинов в наибольшем количестве определяется

через  1   -2  года   после   заражения.   Заслуживает   особого   внимания   то,   что   специфические  IgM  перестают

вырабатываться   при   исчезновении   из   организма   антигена,   а   секреция  IgG  продолжается   клонами   клеток

памяти. Кроме того, крупные молекулы IgM не проходят через плаценту от матери к плоду, в связи с чем по их

наличию у ребенка судят об его инфицировании бледной трепонемой.

Ввиду того, что концентрация в крови специфических  IgM  закономерно снижается после эффективного

лечения, рост титра этих антител может служить вспомогательным признаком наличия рецидива заболевания

или реинфекции (В.Н.Беднова). В  1997  г. предложена реакция 19S  IcM-FTA-ABS, а затем 19S  IgM-TPHA. В

основе этих тестов лежит разделение с помощью гельфильтрации испытуемых сывороток на 19S IgM и 7IgG и

выявление   первых   с   помощью   иммунофлюоресцентного   метода   и   теста   гемагглютгинации.   Затем   была

предложена реакция гемадсорбции на твердофазном носителе IgM-SPHA, объединяющая элементы постановки

ИФА   и   РПГА,   а   также   19SIM-SPHAH  IgM-TP-ABS-ELISA.  IgM-SPHA-тест  наиболее   пригоден   для

характеристики сифилитического процесса и в ЦНС в частности, а также отличия рецидива заболевания от

реинфекции.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Метод   заключается   в   многократном   увеличении   (амплификации)   количества   ДНК   выявляемого

микроорганизма.   Разработка   вариантов   ПЦР   для   диагностики   сифилиса   обусловлена   недостаточностью

стандартных   тестов   при   раннем   серонегативном,   врожденном   сифилисе   и   нейросифилисе.   ПЦР   является

превосходным   методом   для   диагностики   сифилиса   при   небольшом   количестве   трепонем   в   исследуемом

материале.   Большим   достоинством   ПЦР   является   возможность   автоматизации   реакции   путем   заданного

циклического   температурного   режима   для   определяемой   за   счет   меченных   праймеров   цветной   реакции.

Остается невыясненным вопрос - отражает ли наличие трепонемной ДНК присутствие жизнеспособных трепо-

нем или это могут быть остатки погибших микроорганизмов, содержащие способную к амплификации ДНК.

Применение   ПЦР   может   иметь   большое   значение   при   диагностике   врожденного   сифилиса   (пассивный

трансплацентарный   перенос   антител   не   влияет   на   результаты   теста),   нейросифилиса,   первичного

серонегативного сифилиса (в настоящее время единственным критерием является прямое микроскопическое

обнаружение   трепонем),   а   также   у   больных,   у   которых   диагностика   сифилиса   с   помощью   обычных

серологических реакций затруднена из-за ин-фицирования ВИЧ (Дмитриев Г.А., Брагина Е.Е.).

Исследование спинномозговой жидкости.

Особое   внимание   уделяется   исследованию   спинномозговой   жидкости   (ликвора)   для   определения

пораженности   сифилисом   нервной   системы,   как   критерий   качества   лечения   у   лиц   с   патологическими

изменениями в ликворе до начала лечения и как один из критериев излеченности больных.

Спинномозговую   жидкость   получают   при   люмбальной   пункции.   Место   прокола   соответствует   точке

пересечения   двух   линий:   вертикальной   (идет   вдоль   остистых   отростков)   и   горизонтальной   (линия   Якоби).

Горизонтальная   линия   должна   соединять   гребни   подвздошных   костей   и   проходить   между   остистыми

отростками позвонков.

В пробирку собирают 7-8 мл (но не более 10 мл) спинномозговой жидкости. Это количество распределяют в

две   пробирки,   одну   из   которых   направляют   в   клиническую   лабораторию,   а   другую  -  в   серологическую

лабораторию.

В клинической лаборатории исследуют цитоз, содержание белка, глобулиновые реакции Панди и Нонне-

Апельта. Минимальные патологические изменения в спинномозговой жидкости следующие: содержание белка,

начиная с 0,4%, цитоз - 8 клеток в 1 мкл, глобулиновые реакции (реакция Нонне - Апельта++, реакция Пан-ди+

++; реакция Ланге - больше двух двоек в цифровом значении, положительная реакция Вассермана). Показатели

выше указанных, даже будучи изолированными, свидетельствуют о выраженных патологических изменениях в

спинномозговой   жидкости.   Патологической   считается   также   такая   спинномозговая   жидкость   в   которой

несколько   показателей   изменены   соответственно   данным   минимальной   патологии,   а   реакция   Вассермана

положительна. Концентрация белка в спинномозговой жидкости свыше  400  мг/л и число клеток в ней более