Том 3. Справочник по кожным болезням - часть 606

2)  Трепонемные   тесты,   в   которых   используются   специфические   АГ   трепонем,   обязательны   для

подтверждения диагноза (микрогемагглютинационный тест на  AT  к бледной трепонеме, РПГА и РИФ. Они

являются более сложными и дорогостоящими, чем тесты 1-й группы.

В перспективе предполагается использование новых прямых методов определения возбудителя  -  ИФА и

ПЦР, клинические испытания которых дают хорошие результаты при диагностике врожденного сифилиса и

нейросифилиса (Larsen et al., 1995).

Прямая   визуализация   патогенных   трепонем   является   широко   используемым   и   доступным   методом

бактериологического их обнаружения. Он заключается в исследовании возбудителя сифилиса непосредственно

в   тканевой   жидкости   из   высыпных   элементов,   подозрительных   на   сифилитические   проявления.   Тканевую

жидкость, полученную способом аппликации, скарификации или пункции, исследуют в наивном препарате в

темном поле зрения или в окрашенных препаратах (по Романовскому-Гимзе, по Бурри или после импрегнации

по   Фонтану   и   Морозову).   Трепонемы   можно   выявить   в   экссудате   из   очагов   поражения   при   первичном,

вторичном свежем, вторичном рецидивном сифилисе, в пунктате, полученном из лимфатических узлов, в соке

плаценты   при   родах.   Отсутствие   трепонем   в   типичных   очагах   поражения   может   быть   обусловлено   дли-

тельностью существования очага или предварительным лечением пациентов.

Серологическая диагностика.

При   серологическом   обследовании   на   сифилис   применяется   комплекс   реакций:   стандартные   (КСР)  -

реакция   Вассермана   с   двумя-тремя   антигенами   и   две   осадочные   реакции   (Кана   и   цитохолевая);   при

необходимости   рекомендуется   постановка   более   чувствительных   и   специфических   реакций   РИБТ   и   РИФ.

Особенно велико значение РИБТ и РИФ для распознавания ложноположительных результатов стандартных

серологических реакций и ретроспективной диагностики сифилиса.

Комплекс серологических реакций позволяет выявить значительное число больных сифилисом в разных

стадиях заболевания. При замене неспецифических антигенов трепонемными и при постановке серологических

реакций   на   холоде   (реакция   Колмера)   можно   повысить   процент   выявления   и   увеличить   специфичность

реакции.   Применение   в   качестве   обязательных   антигенов   кардиолипинового   антигена,   трепонемного

озвученного антигена из протеиновой фракции патогенных или культуральных трепонем дает возможность су-

дить об иммунном состоянии больного сифилисом при постановке диагноза, определении результатов терапии

и критерия излеченности (в совокупности с другими показателями). Кроме того, серологическое обследование

проводится лицам, поступающим на работу в детские учреждения, на пищевые предприятия и ряд других про-

изводств при периодическом обследовании декретированных контингентов. Обязательному серологическому

обследованию подвергаются доноры, а также больные терапевтических, неврологических, психиатрических и

других стационаров.

Для   выполнения   комплекса   серологических   реакций   требуется   высококвалифицированный   персонал

лабораторий,   соответствующее   лабораторное   оборудование   и   значительное   количество   ингредиентов.

Многочисленность серологических реакций объясняется тем, что доказана антигенная мозаичность бледных

трепонем,   а   в   связи   с   этим   и   наличие   в   сыворотке   крови   больного   сифилисом   соответствующей

множественности   антител   (реагины,   комплементсвязывающие   и   полисахаридные   антитела,   агглютинины,

иммобилизины,   антитела,   вызывающие   иммунную   флюоресценцию,   и   др.).   В   каждой   стадии   сифилиса

преобладают те или иные антитела и, следовательно, реакции с одними антителами могут быть уже положи-

тельными,   а   с   другими  -  еще   отрицательными.   Кроме   того,   относительная   специфичность   стандартных

серореакций побуждает в целях избежания диагностических ошибок пользоваться не одной из этих реакций, а

их комплексом. Несмотря на такой комплексный подход при серологическом обследовании пациента, следует

помнить,   что   в   ряде   случаев   даже   весь   комплекс   может   давать   ложноположительный,   неспецифический,

результат.   Ложноположительные   серологические   реакции   в   крови   наблюдаются   при   малярии,   сыпном   и

возвратном тифе, лепре, бруцеллезе, пневмонии, скарлатине, при злокачественных новообразованиях, во время

менструаций, за 2 нед до родов и в течение 3 нед после родов, после приема алкоголя, жирной пищи, некоторых

лекарственных препаратов, при хронических гнойных процессах, болезнях печени и др. Установлено, что с

увеличением возраста пациентов возрастает количество неспецифических ложноположительных результатов

стандартных серореакций. Все это заставляет  весьма осторожно относиться к показателям серологического

обследования   пациентов   и   считать   серореакций   ценной,   но   вспомогательной   методикой,   подтверждающей

данные   клинической   картины,   результаты   других   лабораторных   исследований   (на   бледную   трепонему,

спинномозговой жидкости), результаты конфронтации.

Реакция Вассермана (РВ) отличается сложностью постановки. Ее производят в специальных серологических

лабораториях   специалисты-серологи.   Она   основана   на   феномене   связывания   комплемента.   В   постановке

реакции   используют   как   специфические   антигены   из   бледных   трепонем,   так   и   неспецифические   антигены

(экстракты   из   органов   здоровых   животных,   например,   мышцы   бычьего   сердца).   Связывание   комплемента

производится комплексом (липоидный антиген и реагин испытуемой сыворотки). Для индикации образовав-

шегося комплекса применяют гемолитическую систему (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). При

постановке РВ с кардиолипиновым антигеном ее чувствительность возрастает. Также более чувствительной

оказалась   модификация   РВ   на   холоде  (реакция   Колмера).  Особенностью   реакции   Колмера   является

двухфазность температурных режимов (первая фаза - при температуре 18...20 °С в течение 30 мин, вторая - в

холодильнике при температуре +4...+6°С в течение 16-20 ч), при которых протекает связывание комплемента.

Реакция   Колмера   улавливает   реагины   в   тех   сыворотках,   где   в   силу   их   небольшой   концентрации   РВ,

поставленная   по   обычной   методике,   дает   отрицательный   результат.   Однако,   по   мнению   большинства

сифилидологов, реакция Колмера и РВ с кардиолипиновым антигеном при своей высокой чувствительности

уступает в своей специфичности другим модификациям РВ.

В   случае   получения   резко   положительных   результатов   реакций   Вассермана   и   Колмера   их   ставят   с

уменьшающимися дозами испытуемой сыворотки для определения титра реагинов (количественная методика

Боаса).   Количественное   определение   реагинов   помогает   отдифференцировать   ранний   и   поздний   скрытый

сифилис, а также позволяет легче оценивать эффективность противосифилитической терапии: снижение титра

реагинов свидетельствует об эффективности лечения.

Осадочные   реакции  (Кана   и   цитохолевая   Закса-Витебского)   много   проще   по   технике   выполнения   по

сравнению   с   РВ.   Для   их   постановки   используют   более   концентрированные   антигены,   которые   содержат

большое   количество   холестерина.   При   их   постановке   выпадает   осадок,   хорошо   видимый   невооруженным

глазом (иногда для оценки результатов пользуются лупой или агглютининоскопом).

Степень   позитивности   РВ,   реакции   Колмера   и   осадочных   реакций   обозначается   числом   плюсов   или

крестами: 4+ (резко положительная), 3+ (положительная), 2+ или 1+ (слабоположительная), ± (сомнительная), -

(отрицательная). При постановке количественной реакции Вассермана или Колмера указывается то разведение

сыворотки, при котором еще получается резко положительный результат  (например,  1:5, 1:10, 1:20  и т.д.).

Реакция Кана, согласно многочисленным данным, дает совпадающие результаты с реакцией Вассермана в 93-96

% наблюдений (ее неспецифические результаты регистрируются в 1,6%), а реакция Закса-Витебского - в 95-99

% (ее неспецифические результаты регистрируются в 1,3 % наблюдений).

В связи с большим объемом профилактических обследований и сложностью выполнения КСР в настоящее

время широко применяется экспресс-метод серодиагностики сифилиса, когда не требуется брать кровь из вены.

Любой лаборант, берущий кровь для клинического анализа, возьмет кровь и для ускоренного исследования на

сифилис. Дополнительно ему нужно лишь использовать отдельный капилляр для определения СОЭ, и провести

регистрацию результатов этой микрореакции.

Ускоренный   метод   серодиагностики   сифилиса.  (Приводится   на   основании   методического   письма,

составленного микробиологическим отделом ЦНИКВИ. Авторы Н.М. Овчинников и Т.И. Милонова.)

Методика постановки микрореакции. Кровь берут из кончика пальца, так же, как и для исследования СОЭ;

необходимо   только,   чтобы   лаборант   для   исследования   на   сифилис   взял   на   один   капилляр   больше,

соответственно увеличив и количество цитрата натрия. Для этого, смочив капиллярные пипетки Панченкова,

набирают  5 %  раствор цитрата натрия до метки  75  и выливают в пробирку. Затем набирают три капилляра

крови и вносят их в ту же пробирку, перемешивают. В один капилляр набирают кровь для СОЭ, а оставшуюся в

пробирке   кровь   в   конце   приема   оставляют   стоять   в   течение  1  ч   при   комнатной   температуре,   после   чего

проводят исследование.

Оборудование: капиллярные пипетки Панченкова (количество их зависит от объема работы), пластинки из

органического стекла с лунками и плоским дном диаметром 1 см, пастеровские пипетки, пробирки длиной 8-10

см и диаметром 1-1,2 см, перья Дженнера.

Ингредиенты:  кардиолипиновый антиген для микрореакции, натрия хлорид  (химически  чистый), холина

хлорид, натрия цитрат, мертиолат (не обязателен; нужен только, если антиген хранится более 5 дней).

Растворы:  0,85   %  изотонический   раствор   натрия   хлорида;  10   %  раствор   холина   хлорида,   разведенный

изотоническим   раствором   натрия   хлорида   (при   приготовлении   раствора   следует   помнить,   что   холин

гигроскопичен, поэтому необходимо растворить весь порошок сразу после того, как будет вскрыт флакон с

препаратом). Если раствор приготовлен с добавлением  0,01 %  раствора мертиолата, он может  храниться в

течение года; 5 % раствор натрия цитрата.

Приготовление эмульсии кардиолипинового антигена.

Для микрореакций используется специальный кардиолипиновый антиген. Для приготовления его эмульсии

к 1 мл кардиолипинового антигена добавляют 1 мл изотонического раствора натрия хлорида и смесь оставляют

при комнатной температуре на  30  мин. Затем ее центрифугируют при  1000-2000  об/мин в течение  15  мин.

Надосадочную   жидкость   сливают,   а   к   осадку   добавляют  3  мл  10   %  раствора   натрия   хлорида.   Осадок

взбалтывают до полного ресуспендирования. Эмульсию антигена хранят в холодильнике при температуре  +4

°С в пробирке под корковой пробкой. В холодильнике она сохраняется в течение 1 нед, а при добавлении 0,01

%  раствора мертиолата  -до  2  нед. Каждый раз перед постановкой реакции эмульсию антигена проверяют на

реактивность на заведомо положительной и отрицательной сыворотках.

Техника постановки реакции с плазмой. Кровь в пробирке при стоянии разделяется на два слоя. Нижний

содержит эритроциты, а верхний - плазму. Пастеровской пипеткой отсасывают плазму, стараясь не захватить

эритроциты. При недостаточном количестве плазмы пробирку с кровью следует отцентрифугиоовать в течение

5-10 мин при 1000-2000 об/мин. В лунку пластинки из органического стекла (при отсутствии пластин реакцию

можно   ставить   на   предметных   стеклах)   вносят   кровь   от  1  больного   и   нумеруют   лунку   соответственно

составленному списку. В каждой лунке к 2-3 каплям плазмы добавляют по 1 капле эмульсии антигена; капли

перемешивают, и смесь встряхивают в течение 5 мин, затем во все лунки добавляют по 1 капле изотонического

раствора натрия хлорида; смесь перемешивают покачиванием и оставляют при комнатной температуре на  5

мин.   В   плазме,   полученной   от   больного   сифилисом,   появляются   хлопья   разной   степени   интенсивности,

расцениваемые   как   положительный   результат   (3+,   4+),   слабо   положительный   (2+,   1+).   При   отсутствии

сифилиса иногда может быть слабо выраженный флокулят, поэтому учет результатов следует производить,

ориентируясь на характер реакции в контролях. Поскольку микрореакция носит  отборочный характер, при

получении положительных результатов сыворотку крови исследуют в КСР, а при необходимости  -  в РИБТ и

РИФ.

Реакция с липоидным антигеном (VDRL).

Следует   напомнить,   что   уже   антиген,   первоначально   использованный   Вассерманом   в   реакции   связывания

комплемента,   содержал,   как   было   показано   в   дальнейшем,   не   антиген   бледной   трепо-немы,   алипоидное

вещество  -  кардиолипин. Иммуноглобулины, вступающие в реакцию с липоидным антигеном, впоследствии

были названы реагинами. Они являются аутоантителами к веществу митохондриальных мембран.

Одним   из   лучших   стандартных   методов,   в   которых   используются   липоидные   антигены,   является

рекомендуемая ВОЗ реакция VDRL. Название этой реакции происходит от заглавных букв учреждения, где она

была разработана,  -  Venereal  Diseases  Research  Laboratory  в Атланте (штат Джорджия, США). Антиген для

реакции  VDRL  включает  0,03   %  кардиолипина,  0,9   %  холестерина   и  0,21   %  лецитина.   Его   добавляют   к

инактивированной сыворотке больного, помещаемой на предметное стекло, которое затем вращают в течение

4-5 мин при комнатной температуре и сразу регистрируют результат: наличие в сыворотке реагинов вызывает

макроскопически видимую флокуляцию. Реактоспособность сыворотки в реакции VDRL выявляется примерно

через  4  нед после заражения сифилисом. Количественную оценку циркулирующих антител получают путем

разведения   сыворотки   перед   постановкой   реакции   в   геометрической   прогрессии:  1:2,   1:4,   1:8,   1:16.

Ложноположительные   результаты   (биологическая   неспецифическая   реактивность)   могут   обусловливаться

аутоантителами при заболеваниях, протекающих с нарушениями иммунитета (красная волчанка, ревматизм,

болезнь Шегрена, дисгаммаглобулинемия), а также при заболеваниях, связанных с усиленным разрушением

клеточных   ядер   (малярия,   пситтакоз,   вирусная   пневмония,   карцинома).   Главными   достоинствами   реакции

VDRL  являются низкая стоимость, легкость постановки, быстрое получение результатов с довольно высокой

чувствительностью и специфичностью, хотя и меньшей, чем в реакции с трепонем-ным антигеном.

Реакции иммунофлюоресценции.

Все   большее   значение   для   серологических   исследований,   особенно   при   скрытом   сифилисе   и   для

распознавания   неспецифических   результатов   стандартных   серологических   реакций,   приобретают   спе-

цифические серологические реакции. К ним относятся РИФ и РИБТ.

Принцип   РИФ   основан   на   выявлении   флюоресцирующих   антител,   так   как   меченные   флюорохромом

антитела   не   теряют   способности   соединяться   с   соответствующим   антигеном   и   тем   самым   обусловливают

свечение препаратов в сине-фиолетовых лучах, источником которых является ртутно-кварцевая лампа.

РИФ в серодиагностике сифилиса начала применяться в нашей стране с конца 60-х годов (Беднова В. Н.,  1977).

Ее   отличительной   чертой,   по   сравнению   со   стандартными   серореакциями,   является   более   высокая

чувствительность   (поэтому   она   бывает   положительной   у   ряда   больных   уже   в   первичном   серонегативном

периоде сифилиса) при сохранении высокой специфичности. Однако, по мнению ряда авторов, РИФ уступает

по специфичности РИБТ, хотя по технике постановки она значительно проще.

Реакция ставится в нескольких модификациях: РИФ-10, РИФ-200 и РИФ-абс. Считается, что РИФ-10 более

чувствительна, а РИФ-200 и РИФ-абс - более специфичны. Реакция ставится непрямым методом в 2 фазы. В

первой фазе реакции на антиген наносится испытуемая сыворотка крови. Если в ней имеются соответствующие

антитела, то образуется комплекс антиген - антитело. Для выявления образовавшегося комплекса проводится

вторая   фаза   реакции,   при   которой   его   обрабатывают   меченной   флюорохромом   иммунной   кроличьей

сывороткой (против сывороточных глобулинов человека)

Полученный   во   второй   фазе   комплекс   антиген  -  антитело   определяется   с   помощью   люминесцентной

микроскопии. Если  свечения антигена нет, то это указывает  на отсутствие в испытуемой  сыворотке крови

соответствующих антигену антител.

Наиболее   ценной   модификацией   реакции   иммунофлюоресценции   является   РИФ-200,   основным

назначением   которой   считается   не   ранняя   серодиагностика   сифилиса,   а   распознавание   неспецифических

результатов КСР и серодиагностика других форм сифилитической инфекции, в том числе и скрытого сифилиса.

При установлении излеченности сифилиса решающим является только отрицательный результат РИФ-200. Как

и всякая другая серологическая реакция, РИФ-200 не обладает абсолютной специфичностью, поэтому вопрос о

наличии   или   отсутствии   заболевания   должен   решаться   на   основании   совокупности   клинических,

серологических и других данных.

Методика   постановки   РИФ-200.   Кровь   берут   из   вены   в   чистую   и   сухую   пробирку   в   объеме  5  мл   и

обрабатывают   как   для   реакции   Вассермана.   Инактивируют   сыворотку   однократно   в   течение  30  мин   при

температуре 56°С. Хранят при температуре +4 °С или -20°С. Во время лечения больных пенициллином иногда

могут быть получены ложноотрицательные результаты реакции, поэтому в этих условиях РИФ проводить не

следует.

Антиген. В качестве антигена используют взвесь патогенных бледных трепонем штамма Никольса из 7-

суточного орхита кролика. Получение и хранение антигена требует соблюдения условий стерильности, так как

с одним и тем же антигеном реакция ставится в течение длительного времени. (Антиген может быть получен в

ампулах   из   ближайшей   лаборатории,  где   ставят   РИФ).  Перед  каждой   постановкой  реакции  взвесь   хорошо

перемешивают и исследуют в темном поле зрения для определения ее густоты. Для РИФ необходимо иметь 40-

60 трепонем в темном поле зрения, и, если взвесь более густая, то ее разводят изотоническим раствором натрия

хлорида, (рН 7,2). Разводить надо только то количество антигена, которое необходимо для постановки реакции.

Антивидовая  флюоресцирующая  сыворотка.  В  реакции  необходима  меченная  флюорохромом  сыворотка

крови   животных,   иммунизированных   сывороточным   белком   человека.   Лиофильно   высушенную

флюоресцирующую сыворотку растворяют при соблюдении условий стерильности в дистиллированной воде, в

том объеме, который указан на этикетке ампул, переливают в стерильную пробирку с корковой или резиновой

пробкой и в процессе использования хранят в холодильнике при температуре -4 °С. В день постановки реакции

нужное количество сыворотки разводят по титру дистиллированной водой. Титр каждой серии необходимо

определять. Для этого берут 5 сывороток крови больных сифилисом и 5 сывороток здоровых людей, разводят

их изотоническим раствором натрия хлорида в  200  раз и ставят реакцию с использованием во второй фазе

различных разведении флюоресцирующей сыворотки против сывороточных глобулинов человека той серии,

титр которой определяется. Окончательным титром можно считать тот, который проверен на 100 исследуемых

сыворотках, из которых не менее 20 должно быть от больных сифилисом.

Техника постановки реакции. Из антигена готовят препараты на тонких, хорошо обезжиренных предметных

стеклах, на обратной стороне которых обозначены кружки диаметром  1 см. Запаянным концом пастеровской

пипетки круговыми движениями распределяют антиген в пределах кружка, и высушенный на воздухе мазок

фиксируют   в   течение  5  мин   в   чистом   ацетоне.   После   фиксации   стекла   помещают   во   влажную   камеру.

Инактивированные испытуемые сыворотки крови разводят в 200 раз изотоническим раствором натрия хлорида.

Для проведения первой фазы реакции на помещенные во влажную камеру препараты наносят испытуемые

сыворотки. Для того, чтобы покрыть препарат, достаточно  1  капли сыворотки. После этого влажную камеру

закрывают и помещают в термостат при температуре 35°С на 30 мин. По истечении этого времени препараты

вынимают из влажной камеры, промывают в течение 10 мин в двух порциях изотонического раствора натрия

хлорида и помешают в штатив для высушивания. После высушивания препараты вновь помещают во влажную

камеру и наносят по капле разведенной по титру флюоресцирующей сыворотки против глобулинов человека.

Вторую   фазу   реакции   проводят   при   комнатной   температуре,   после   чего   препараты  10  мин   промывают   в

изотоническом   растворе   натрия   хлорида,   высушивают   и   монтируют   для   люминесцентной   микроскопии.

Монтирование   препаратов   заключается   в   том,   что   на   них   стеклянной   палочкой   наносят   маленькие   капли

забуференного   глицерина  (1  часть   фосфатного   буфера   при   рН  7,4  и  9  частей   глицерина),   накрывают   их

тонкими, хорошо обезжиренными предметными стеклами, на которые стеклянной палочкой наносят по капле

нелюминесцирующее   иммерсионное   масло   (диметилфталат).   Исследование   препаратов   производят   в

люминесцентном   микроскопе   или   в   люминесцентном   устройстве   ОЙ-17.  Степень   свечения   трепонем,

зависящая   от   количества   антител   в   сыворотке   крови,   обозначается   плюсами.   Свечение   считается

положительным, если его оценивают как 4+, 3+ и 2+.

Реакция иммунофлюоресценции-абсорбции с бледной трепонемой (FTA-ABS).  Используемый для реакции

антиген   представляет   собой   взвесь   бледных   трепонем   из   пораженных   сифилисом   яичек   кролика,

фиксированную   ацетоном   на   предметном   стекле.   Можно   также   использовать   лиофилизированные   бледные

трепонемы после их восстановления в изотоническом растворе натрия хлорида. Инакти-вированную сыворотку

инкубируют с сорбентом (трепонемы Рейтера) для абсорбирован ия неспецифических групповых антител. За-

тем сыворотку помещают пипеткой на антиген, находящийся на предметном стекле. Специфические антитела

(глобулины)   связываются   бледными   трепонемами.   После   промывания   ктрепонемам   на   предметном   стекле

добавляют   комплекс   античеловеческого   глобулина   с   флюоресцентным   красителем   (флюоресцеин-

изотиоцианат). Этот комплекс связывается с человеческим глобулином на оболочке клеток бледных трепонем и

может быть идентифицирован методом флюоресцентной микроскопии. По прошествии не менее 2 ч по степени

флюоресценции   сыворотку   можно   классифицировать   как   нереактоспособную,   пограничную   или

реактоспособную. Реакция, обозначаемая двумя плюсами или больше, свидетельствует об инфекции.

Появления   реактоспособности   можно   ожидать   примерно   в   начале   3-й   недели   после   заражения,   а   у

нелеченных больных она обнаруживается постоянно. Сыворотка остается реактоспособной и через несколько

лет после успешного лечения раннего сифлиса, а у больных, получивших адекватное лечение при позднем

сифилисе,  -  на   протяжении   десятилетий.   Главными   достоинствами   реакции  FTA-ABS  являются   довольно

высокая специфичность и чувствительность, а также быстро наступающая реактоспособность. Положительная

FTA-ABS  может   иметь   решающее   значение   для   диагностики   в   сомнительных   случаях,   особенно   при

положительных   реакциях  VDRL  или   автоматизированной   реакции   микрогемагглютинации   (АМНА-ТР),

используемых для скрининга (LugerA., 1981).

Реакция 19S IgM-FTA-ABS. При идентификации антител IgM к бледным трепонемам реакцией FTA-ABS с

использованием   конъюгата  анти-IgM  в   качестве   реагента   выявлялись   ложноположительные   и

ложноотрицательные результаты. Реакция  19S IgM-FTA-ABS  в этом отношении является наиболее точным,

специфичным   методом.   В   целях   отделения   крупных   молекул  19S   IgM  от   более   мелких   молекул   7S  IgM

используется   методика   ультрацентрифугирования,   адсорбирования   на   белке   А   и   гель-фильтрация   с

применением ультрагеля АсА  34  с трисбуфером при рН  8,0  на колонке К  26/100  при объеме геля  300  мл,

скорости потока 27 мл/ч и температуре 24

0

С. В этой системе первый пик элюата содержит фракцию 19S IgM. В

процессе   фильтрования   отделяются   непрочные   иммунные   комплексы.   Использование   фракции  19S   IgM  в

реакции FTA-ABS обеспечивает высокую специфичность, устраняя возможность неспецифических, ошибочных

результатов.

Реакция иммобилизации бледных трепонем.

Основное назначение РИБТ - распознавание ложноположительных результатов при постановке стандартных

серологических  реакций.  Это  особенно важно  у больных,  у  которых отсутствуют  клинические  проявления

активного сифилиса или имеются поражения внутренних органов или нервной системы. Неоценима роль этой

реакции   для   распознавания   ложноположительных   результатов   стандартных   серологических   реакций   у

беременных, где от результата РИБТ фактически зависит судьба (здоровье) ребенка.

Сущность   реакции   заключается   в   потере   подвижности   бледными   трепонемами   в   присутствии

иммобилизинов испытуемой сыворотки и активного комплемента. Реакция ставится в условиях анаэробиоза.

Техника выполнения самой реакции довольно сложна, поэтому она ставится в специальных лабораториях.

Иммобилизины появляются в сыворотке крови больных позднее, чем другие антитела, и, следовательно,

РИБТ становится положительной позже, чем стандартные серореакции и РИФ.

Оценка реакции: при иммобилизации до  20 %  бледных трепонем реакция считается отрицательной; при

иммобилизации от 21 до 50 % бледных трепонем - слабоположительной; при иммобилизации от 51 до 100% -

положительной (оценка процента иммобилизации бледных трепонем производится по специальной таблице).

Положительный   результат   РИБТ   наблюдается   у   больных   с   тропическими   трепонематозами   (пинта,

беджель).   Иногда   РИБТ   дает   ложноположительный   результат   при   саркоидозе,   эритематозе,   туберкулезе,

циррозе печени, атеросклерозе и др. С возрастом пациентов число ложноположительных результатов РИБТ

увеличивается.

Упрощенная методика РИБТ (Методика разработана проф. Н. М. Овчинниковым.). Кровь для получения сы-

воротки берут из вены стерильно в сухую чистую и простерилизованную посуду. Больной перед взятием крови

не   должен   принимать   никаких   лекарственных   средств,   которые   могли   бы   оказать   вредное   влияние   на

подвижность трепонем; в частности, необходимо прекратить введение дюрантных препаратов пенициллина на

срок   возможной   задержки   его   в   организме.   Инактивация   сыворотки   производится   в   течение  30  мин   при

температуре  56  °С,   а   если   сыворотка   была   инактивирована   накануне,   то   в   день   постановки   реакции   ее

прогревают   в   течение  10  мин.   Никаких   консервантов   в   сыворотку   не   добавляют.   При   необходимости

длительного хранения сыворотку можно заморозить при -20 °С. Сыворотки, высушенные на вощаной бумаге (с

добавлением свежеприготовленного 40 % пищевого сахара по 3 капли на каждые 0,5 мл сыворотки), можно в

отдельных   случаях   применять   для   исследования.   Следует,   однако,   учитывать,   что   титр   иммобилизинов

снижается  при   высушивании   сыворотки  подобно реагинам  и  при   невысоких титрах  снижение  может   быть

значительным. Поэтому не следует широко пользоваться в РИБТ высушенными сыворотками.

Срок годности для исследования высушенной сыворотки 5 дней с момента приготовления в южных районах

нашей страны или в жаркое время года и 10 дней - в остальных регионах. Сыворотка нативная, хранящаяся в

холодильнике при температуре +3...+5°С, также теряет свою активность.

В   качестве   антигена   применяют   взвесь   бледных   трепонем   из   раннего   орхита   кролика,   зараженного

сифилисом, обычно штаммом Никольса. Для заражения следует брать совершенно здоровых кроликов-самцов

массой 2-2,5 кг, предварительно исследовав у них кровь на реакцию Вассермана. Отбирают только кроликов с

отрицательными результатами серологических реакций. Заражение производят внутрь яичка взвесью трепонем

в количестве не менее 50-60 в поле зрения в объеме 0,50-0,75 мл. Непосредственно после заражения кролику

вводят внутримышечно  20  мг кортизона, а в последующие дни  -  по  10  мг ежедневно. Рекомендуемое рядом

исследователей   одновременное   рентгеновское   облучение   кроликов   трудно   для   выполнения   и   не   дает

существенных преимуществ.

Для удаления яичка (при 6-8-дневном орхите) кролика привязывают к станку, обескровливают сердечной

пункцией   (некоторые   предпочитают   обескровливать   через   сонную   артерию).   Затем   забивают   кролика

воздушной   эмболией   (введение  15  см

3

  воздуха   в   краевую   вену   уха).   Яички   выводят   в   мошонку   путем

поглаживания ладонью по животу кролика сверху вниз. Поверхность кожи мошонки, предварительно немного

подстриженной   ножницами,   смазывают   спиртом,   поджигают,   тут   же   тушат   и   опять   поджигают.   Этим

достигаются   освобождение   кожи   от   шерсти   и   одновременно   дезинфекция   кожи.   После   этого   мошонку

покрывают   резиновой   стерильной   салфеткой   с   разрезом,   через   который   выводят   наружу   яичко.   Оператор

фиксирует   яичко   одной   рукой,   а   другой   рукой   делает   скальпелем   небольшой   поперечный   разрез   кожи

мошонки. Ножницами отрезают яичко от подлежащих тканей и помещают его в стерильную чашку Петри.

Такого же рода манипуляцию проделывают и с другим яичком. Далее ножницами удаляют придаток, осво-

бождают яичко от жира и разрезают его на 10-15 кусочков. Готовят препарат с каплей изотонического раствора

натрия хлорида и определяют под микроскопом в темном поле наличие трепонем и их число. Все кусочки

помещают   в   стерильную   колбу   объемом  50-75  мл,   в   которую   уже   налита   среда   (сыворотка   кролика,

разведенная  0,83 %  стерильным раствором натрия хлорида, в количестве  10-14  мл на яичко). Колбу ставят в

аппарат   для   встряхивания   на  20-30  мин.   После   этого   все   содержимое   выливают   в   большую   стерильную

центрифужную пробирку и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин для удаления плотных кусочков

тканей.   Затем   надосадочную   жидкость   сливают   и   готовят   препараты   для  микроскопии.   Определяют   число

трепонем в темном поле зрения (окуляр  10,  объектив  40).  Если число трепонем большое, то взвесь следует

развести, чтобы было по  10-15  трепонем в поле зрения, так как при большем их числе трудно подсчитывать

иммобилизованные трепонемы.

Обычно   в   центрифужной   пробирке   над   осадком   оставляют   некоторое   количество   жидкости   и   дают

возможность немного ей постоять. Жидкостью, содержащей большое число трепонем, заражают кроликов для

следующей   постановки   реакции.   При   каждой   постановке   следует   одновременно   производить   и   заражение.

Зараженных кроликов содержат в клетках в проветриваемом помещении при температуре +18...20°С. Пища

кроликов должна содержать значительное количество витаминов.

Для сохранения трепонем жизнеспособными предложено большое количество различных сред (Овчинников

Н. М., 1961).

Первоначально среда Нельсона была очень сложна. Затем Нельсон значительно упростил ее, но она все еще

сложна.  A.  Bellone  и М.  Bonelli  (1957)  в качестве среды для сохранения трепонем применяют разведенную

изотоническим раствором натрия хлорида сыворотку человека (2:1), а К. Meinike и К. Lagel (1959) - сыворотку

кролика (2:1 или 1:1). Следует отметить, что трепонемы, взвешенные в одном изотоническом растворе натрия

хлорида и особенно вместе с сывороткой больного и комплементом в небольшой дозе, выживают, судя по

контрольным   исследованиям,   и   без   какой-либо   среды,   однако   сроки   их   выживания   значительно   короче,

подвижность менее активна, и наблюдается значительное количество сомнительных результатов.

Н.М.   Овчинников  (1961,   1962)  предложил   для   РИБТ   простую   среду.   Готовят  0,2%  раствор   пищевого

желатина на 0,83 % растворе натрия хлорида. Раствор стерилизуют автоклавированием при температуре 110°С

в течение 10 мин, после чего добавляют стрептомицина сульфат из расчета 1:10000. Среда для опыта состоит из