содержание .. 435 436 437 438 ..

Том 3. Справочник по кожным болезням - часть 437

красного водорастворимого. Перемешивают, разливают по 20 мл в стерильные чашки Петри. Среду можно хранить в
холодильнике при 4° в течение одного месяца.

Приготовление индикатора: 2 г фен!олового красного водорастворимого добавляют к 1 л дистиллированной воды,

доводят рН до 7,8, используя 20% раствор едкого натрия, стерилизуя в автоклаве при 120° в течение 20 минут.

Посев чистой культуры подлежащего дифференциации грамотрицательного кокка производят на пове_f0хность

среды ферментации, предварительно подогретой в термостате, в виде двух взаимоперпендикулярных штрихов длиною
1 см. На поверхность среды в одной чашке Петри можно посеять от 1 до 5 испытуемых штаммов. Чашки с посевами
помещают в эксикатор с влажной ватой на дне, но без создания в !нем повышенного содержания углекислого газа.

Результаты реакции учитывают через сутки. Положительным считают изменение красного цвета среды на желтый

в зоне роста микроорганизмов под действием их сахаролитических ферментов. При отсутствии этого действия среда
аeстается красной или становится вишневой, что регистрируется как отрицательный результат.

ЦКВИ разработана также более экономичная модификация указанного способа определения сахаролитических

свойств грамотрицательных кокков, которую удобно использовать при а8зучении малого числа штаммов. При
применении данного способа растворы всех пяти сахаров наносят на поверхность среды в одной чашке, что позволяет
изучать сахаролитические свойства одного штамма при наличии одной чашки со средой. При изготовлении среды для
данной модификации к МП!А добавляют только желток свежего куриного яйца в соотношении, указанном выше. Чашки
Петри, в которые разливаются среды, должны быть установлены на горизонтальной поверхности. Хранение среды в
чашках допускается в течение одного месяца в xoлoдильнике при 4°.

Перед испоаbьзованием среду нагревают в термостате, после чего дно чашки с внешней стороны делят на пять

секторов и чашки устанавливают на горизонтальной плоскости. На поверхность среды каждого сектора стерильной
пастеровской пипеткой наносят по одной капле 80% раствора одного из пяти вышеук_e0занных сахаров, растворенных
в 0,2% стерильном растворе фенолового красного водорастворимого, приготовленного как указано выше. Эти растворы
сахаров стерилизуют кипячением в водяной бане в течение 15 минут. Неиспользованные растворы можно хранить в
холодильнике при 4° в течение одн_eeго месяца.

Посев испытуемой культуры производят на все пять секторов в одной чашке в зоне нанесения растворов сахаров,

после того как произойдет диффузия их в среду.

Инкубация посевов и учет результатов осуществляется как указано выше.
А4обавление к среде ферментации антибиотиков, согласно методическим указаниям, способствует сохранению

стерильности среды при хранении и препятствует загрязнению изучаемых культур при посеве их на среду ферментации.

Определение чувствительности гонококков к антибиотикам

При безуспешном лечении гонореи возникает необходимость определения чувствительности гонококка к

антибиотикам.   С   этой   целью   используют   метод   диффузии   в   агар   с   применением   стандартных   бумажных   дисков,
пропит_e0нных   антибиотиками.   Асцит-агар   или   безасцитную   питательную   среду   разливают   в   чашки   Петри.   На   ее
поверхность   наносят   1   мл   взвеси   суточной   чистой   культуры   гонококка   в   изотоническом   растворе   хлорида   натрия
(густота взвеси 10 ЕД по оптическому стандарту мутности), которую стеклянным шаfателем равномерно распределяют
но поверхности среды, выдерживают 15 минут при комнатной температуре, избыток взвеси удаляют с помощью пипетки.
Затем на поверхность среды помещают бумажные диски с антибиотиками, применяемыми для лечения гонореи. Чашки
в   эксикаторе   выдерживают   в   та5рмостате   1-2   суток.   При   оценке   результатов   измеряют   в   мм   диаметр   зон   полной
задержки роста гонококка вокруг дисков, включая их диамер. Отсутствие зон указывает на отсутствие чувствительности,
зоны диаметром до 10 мм - на малую чувствительность, более 10 мм - на чувствительность испытуемыр5 штаммов
гонококка к концентрации антибиотика в стандартных дисках, причем чем больше зона, тем выше чувствительность.

Использование смешанных культур для определения чувствительности гонококка к антибиотикам не допустимо.
При микроскопическом оа1наружении большого числа гонококков в патологическом отделяемом возможен

непосредственный посев отделяемого на среду в чашках Петри с последующем наложением дисков с антибиотиками.
При этом берут густую взвесь отделяемого в 1 мл изотонического раствора, равномерно распределя'feт ее шпателем по
поверхности среды, причем избыток не удаляют, а ожидают полного всасывания взвеси в среду. В остальном
исследование проводят аналогично ранее описанному.

Определение бета-лактамазной активности гонококка

В последние годы все шире распространяются штаммы гонококка, продуцирующие бета-лактамазу, которая

инактивируя пенициллин, обусловливает безуспешность лечения больных гонореей этим антибиотиком. Выработку
гонококком бета-лактамазы определяют чашечным способаeм, при котором к стерильной основе питательной среды для
выделения гонококка, расплавленной в водяной бане и охлажденной до 45°, добавляют помимо обогащающих веществ
взвесь стафилококка, чувствительного к пенициллину. Для этого из суточной культуры стафилококка готовят взвесь в
с_f2ерильном изотоническом растворе густотой 5 ЕД по оптическому стандарту мутности, затем эту взвесь разводят
еще в 10 раз, берут 6 мл взвеси и добавляют к 100 мл среды. Среду со взвесью перемешивают и разливают по
стерильным чашкам Петри. На застывшую среду в центр чашки помещают стандартны'e9 диск с пенициллином и от него
по радиусам до края чашки засевают в виде линий испытуемые микроорганизмы. При использовании 1 чашки можно
исследовать 4-5 штаммов. При проведении данного исследования необходимо иметь штамм любого микроорганизма,
продуцирующий бета-лактамазу (положи_f2ельный контроль). Чашки Петри с посевами помещают в термостат при 36-
37°. Через сутки среда прорастает стафилококком (рис.1.3) за исключением зоны задержки роста (рис.1.2) вокруг диска
(рис.1.1.). Микроорганизмы, не продуцирующие бета-лактамазу, вырас!тают в виде полосы, не изменяя очертаний зоны
задержки роста стафилококка (рис.1.7.). При выработке штаммом бета-лактамазы она нейтрализует бензилпенициллин,
диффундирующий в питательную среду из диска, в результате чего по краям линии роста этого микроорганизма по нап!

равлению к диску наблюдается рост стафилококка внутри среды, что приводит к искривлению очертаний зоны задержки
роста (рис.1.5.). Если штамм не продуцирует бета-лактамазу, но чувствителен к бензилпенициллину, то он вырастает до
зоны задержки роста (рис.1.4). _ccикроорганизмы, продуцирующие стафилоцин, который губительно действует на
стафилококк, при своем росте образуют полосу просветления в газоне (рис.1.6.). По степени искривления зоны
задержки роста судят о количестве вырабатываемой испытуемым штаммом бета-лактамазы.

!Следует учесть, что при пересевах гонококк может потерять способность продуцировать бета-лактамазу.

Организационные вопросы

Лаборатория, осуществляющая бактериологическую диагностику гонор0еи, должна иметь бокс с предбоксником,

комнату   для   мытья   посуды,   отдельные   помещения   для   взятия   материала   от   больных   и   его   обработки,   для
микроскопического   исследования   мазков   и   культур,   подготовки   лабораторной   посуды,   а   также   для   приготовления
питательных сред и их стерилизации. 'cbаборатория должна быть обеспечена термостатами, сушильными шкафами,
холодильниками,   автоклавами,   инактиваторами,   центрифугами,   инструментарием,   лабораторной   посудой,   а   также
необходимыми реактивами и ингредиентами для окраски и приготовления питательных сред.

!Работа с живыми культурами микроорганизмов требует строгого соблюдения правил личной и общественной

безопасности при ее выполнении. Все предметы, которые были использованы при работе с патологическим материалом
или   живыми   культурами   (петли,   пипетки,   пробирки,   предметные   стекла!   и   др.)   немедленно   обеззараживают
прожиганием на пламени, либо погружением в дезинфицирующий раствор, либо автоклавированием. Работу с живыми
культурами микроорганизмов производят только в боксе, его не используют для приготовления стерильных питательных
сред.   Стены   и   потолок   бо'eaса   должны   быть   выкрашены   масляной   краской,   пол   выложен   плиткой   или   покрыт
линолеумом,   столы   обиты   легко   моющимися   материалами.   В   боксе   необходима   бактерицидная   лампа,   на   рабочих
местах - банки с дезинфицирующим раствором, желательна газовая горелка, которая может быть заменена сп!иртовой.
В предбокснике ставят шкафы для спецодежды и стерильной посуды, необходимых для работы в боксе. Ежедневно до
работы и после нее бокс обрабатывают дезинфицирующими растворами и облучают бактерицидной лампой.

Рис.1 1 - стандартныа9 диск, пропитанный раствором пенициллина 2 - зона

задержки   роста   3   -   газон   индикаторной   культуры   золотистого   стафилококка
(штамм   209)   4   -   рост   микроорганизма   не   продуцирующего   бета-лактамазу   и
чувствительного к пенициллину 5 - рост микроорганизма продуцирующего бета-
лактамазу   6   -   рост   микр'eeорганизма   не   продуцирующего   бета-лактамазу   и
вырабатывающего   стафилоцин   7   -   рост   микроорганизма   не   чувствительного   к
пеницилину и не вырабатывающего бета-лактамазу

Бактериологический контроль на загрязненность бокса должен проводиться не менее оа4ного раза в неделю. Для

этого на 15 минут оставляют на столе открытыми чашки Петри с мясопептонным агаром (МПА) и средой Сабуро, затем
первую чашку инкубируют в течение 48 часов при 37°, вторую - 96 часов при 22°. Допускается рост не более 10 колоний
сапрофитных микроорганизмов.

Изва5стно, что правильная организация лабораторных исследований, их высокое качество помогает раннему

распознаванию и своевременному лечению гонореи и трихомониаза, решение вопросов излеченности больного и, тем
самым, создают условия для более эффективной борьбы с распространение'ec этих заболеваний, для правильности их
учета.

Бактериологическая диагностика является одним из важных звеньев в борьбе с распространением

заболеваемости гонореей и трихомониазом, так как эффективная организация и проведение лечебно-профилактических
и противоэ'efидемических мероприятий без этого чувствительного и специфического метода выявления возбудителя
невозможны.   Основным   этапом   бактериологической   диагностики   является   первичное   выделение   возбудителя
инфекции,   которое   осуществляется   путем   культивирования   на   питательной   ср!еде   исследуемого   отделяемого
пораженных   органов,   содержащего   микроорганизмы.   Поэтому   надежность   исследований   и,   соответственно,
эффективность   работы   бактериологической   лаборатории   в   значительной   мере   зависит   от   качества   исследований.
Получение точных и достоверных резульр2атов  может быть  достигнуто лишь  при оптимальном числе проведенных
исследований в единицу времени, увеличение их приводит к стремлению каждым работником быстрее провести каждое
исследование,   повышению   утомляемости   и,   естественно,   к   снижению   качества   исследования,   а   в   результата5
возможности   гиподиагностики   заболевания.   Оптимальные   условия   для   работы   бактериологической   лаборатории
достигаются в том случае, когда каждый работник выполняет исследования в соответствии с нормами затрат рабочего
времени, полагающегося для производства данного исследов'e0ния.

Отделами эпидемиологии и микробиологии Центрального научно-исследовательского кожно-венерологического

института   Минздрава   СССР,   по   методикам   и   при   непосредственной   консультационной   помощи   Нормативно-
исследовательского   центра   Всесоюзного   научно-иссле!довательского   института   гигиены   и   организации
здравоохранения им. Н. А. Семашко на основании проведенных хронометражных замеров деятельности работников
бактериологических   лабораторий   кожно-венерологических   диспансеров   разработаны   расчетные   нормы   времени   на
отдельные виды! лабораторных исследований при диагностике гонореи и трихомониаза (приложение).

Главным управлением лечебно-профилактической помощи и Планово-финансовым управлением Министерства

здравоохранения СССР указанные нормы письмом N 10-9/476-43 от 21 января 1985 года0 разрешено использовать
руководителям органов и учреждений здравоохранения при решении вопросов по рациональной расстановке и
использованию кадров в подведомственных им лечебно-профилактических учреждениях.

Приложение

Расчетные нормы времени на отдельные виды лабораторных

исследований в бактериологических лабораториях

кожно-венерологических диспансеров

__________________________________________________________________________

¦ ¦ Время на одно исследование
¦ ¦ в минутах и секундах *(5)

N ¦ Наименование ______________________________________
п/п ¦ !исследований ¦ ¦ В том числе:

¦ ¦ _________________________
¦ ¦ Всего ¦ врача-ла- ¦ лабо-

¦ ¦ ¦ боранта ¦ ранта
________________________________________________________________________

1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5
_________________________________________________________________________

1. Микробиологическая диагностика гонореи.
1.1. Культуральные и бактериоско- 22 мин 11 мин 11 мин

пичес_eaие исследования для ди- 54 сек. 09 сек. 45 сек.
агностики гонореи без забора

материала в лаборатории
1.2. То же с изучением чувствитель- 36 мин 24 мин 11 мин

ности чистых культур гонококка 21 сек. 36 сек. 45 сек.
к антибиотика0м методом диф-

фузии в агар с использованием
дисков

1.3. Культуральные и бактериоско- 38 мин 11 мин 26 мин
пические исследования для ди- 06 сек. 09 сек. 57 сек.

агностики гонореи с забором
материала в лаб'eeратории (все-

го).
В том числе:

1) забор материала, приготов- 15 мин - 15 мин
ление мазков на 2 стекла и 12 сек. 12 сек.

производство посева на 2
пробирки со средой;

2) бактериоскопически'e5 иссле- 9 мин 6 мин 3 мин
дования мазков, окрашенных 00 сек. 00 сек. 00 сек.

метиленовым синим и по
Граму;

3) работа с культурами (при- 9 мин 5 мин 4 мин
готовление мазков, их изу- 12 сек. 09 сек. 03 сек.

че_edие);
4) приготовление питательных 2 мин - 2 мин.

сред (безасцитные, асцит- 48 сек. 48 сек.
агар);

5) приготовление материалов, 1 мин - 1 мин.
обеспечивающих проведение 54 сек. 54 ceк.

исследован!ий для диагности-
ки гонореи (посуды, про-

бок, тампонов, красок, кон-
троль работы аппаратуры,

стерилизация, убивка зараз-
ного материала и др.)

1.4. Культуральные и бактериоско- 51 мин 24 мин 26 мин
!ain пические исследования для ди- 33 сек. 36 сек. 57 сек.
агностики гонореи с забором

материала в лаборатории и изу-
чением чувствительности чистых

культур гонококка к антибиоти-
кам методом диффузии в ага0р

с использованием дисков

2. Микробиологическая диагностика гонореи и трихомониаза
2.1. Культуральные и бактериоскопи- 34 мин 17 мин 17 мин

ческие исследования для одно- 24 сек. 18 сек. 06 сек.
временной _e4иагностики гонореи

и трихомониаза без забора ма-
териала в лаборатории

2.2. То же с изучением чувстви- 47 мин 30 мин. 17 мин.
тельности чистых культур го- 51 сек. 45 сек. 06 сек.

нококка к антибиотикам мето-
'e4ом диффузии в агар с исполь-

зованием дисков
2.3. Культуральные и бактериоско- 50 мин 17 мин 33 мин

пические исследования для од- 33 сек 18 сек. 15 сек.
новременной диагностики гоно-

реи и трихомониаза с забором
! материала в лаборатории (все-

го).
В том числе:

1) забор материала, пригогов- 16 мин - 16 мин
ление мазков на 2 стекла и 09 сек. 09 сек.

производство посева на 2
пробирки с питательной сре-
! дой для гонококков и в

1 пробирку со средой для
влагалищных трихомонад;

2) бактериоскопические исследо- 10 мин 7 мин. 2 мин
вания мазков, окрашенных 27 сек. 30 сек. 57 сек.

метиленовым синим и по
! Граму;

3) работа с культурами (при- 17 мин 9 мин 7 мин
готовление культур, изучение 09 сек. 48 сек. 21 сек.

их);
4) приготовление питательных 4 мин. - 4 мин

сред (безасцитные, асцит- 42 сек. 42 сек.
аг!ар, жидкие и др.);

5) приготовление материалов, 2 мин - 2 мин
обеспечивающих проведение 06 сек. 06 сек.

исследований для диагности-
ки гонореи и трихомониаза

(посуды, пробок, тампонов,
красок, ко'edтроль работы ап-

паратуры, стерилизация, убив-
ка заразного материала и

др.)
2.4. Культуральные и бактериоско- 64 мин 30 мин. 33 мин

пические исследования для од- 00 сек. 45 сек. 15 сек.
новременной диагност'e8ки гоно-

реи и трихомониаза с забором
материала в лаборатории и изу-

чением чувствительности чистых
культур гонококка к антибиоти-

кам методом диффузии в агар с
использованием дисков

!В расчетные нормы включено время на: прием, регистрацию больных и выдачу заключений; взятие материала

непосредственно из очагов заболевания и его исследование; проведение всей необходимой подготовительной работы к
исследованию (приготовление реактивов, красок, питательаdых сред и др.). Время переходов (проездов) для взятия
материала на исследование лаборантом в стационаре лечебно-профилактического учреждения или другого учреждения
должно учитываться по фактическим затратам.

При распределении времени между врачом-лаборантом (заведующим) и лаборантом настоящие нормы

предусматривают,   что   при   непосредственном   выполнении   исследований   врач-лаборант   выполняет   следующие
манипуляции: микроскопирование мазков патологического материала, взятого из очагов и окрашенного метиленовым
синим и по Граму, и мазков из аaультур, окрашенных по Граму, для обнаружения возбудителей гонореи и трихомониаза
с регистрацией результатов исследования в бланке; макроскопическое изучение выросших культур, а также постановка
оксидазного   теста;   микроскопирование   выросшей   культуры   в   нативном   препарате   для   о'e1наружения   возбудителя
трихомониаза с регистрацией результатов исследований в бланке; пересевы колоний гонококка и выделение его чистой
культуры;   пересев   культур   влагалищных   трихомонад   в   свежую   питательную   среду;   определение   чувствительности
чистых культур гонококков  к ант_e8биотикам  методом диффузии в агар с использованием  дисков; контроль работы
лаборантов,   обучение   их;   контроль   работы   лабораторий,   занимающихся   диагностикой   гонореи   и   трихомониаза,   в
курируемых   учреждениях,   подготовка   кадров   в   них.   Все   остальные   манипуляции   выполняются   лаборанта_ecи   под
контролем врача-лаборанта (заведующего). Данное распределение обязанностей не исключает взаимозаменяемости в
тех случаях, когда это диктуется необходимостью или условиями работы.

Нормы предназначаются для определения фактического объема работы бактериологической лаборатории, ее

производственной мощности, анализа качества ее работы и установления более правильных соотношений между
врачами-лаборантами и лаборантами, но не могут служить основанием для расчета по заработной плате, а также для
установления штатов лабораторий.

Затраты времени врачами-лаборантами и лаборантами исчисляются в зависимости от объема работы,

выполненной   каждым   из   них,   в   соответствии   с   изложенными   нормами.   Так,   например,   в   бактериологической
лаборатории в течение года всего произведено 3800 исследований для диагностики гонореи со взятием материала в
лаборатории (1.3) и 1600 исследований для одновременной диагностики гонореи и трихомониаза (2.3), из которых в 425
и  360  случаях,  соответственно,  изучалась   чувствительность  гонококка   к  антибиотикам  методом   диффузии   в  агар  с
использованием   дисков   (1.4.   и   2.4.).   При   этом   л_e0боратория   располагала   в   данном   году   2   штатными   единицами
врачей-лаборантов и 3 - лаборантов.

Затраты времени, необходимые для проведения указанной работы в соответствии с расчетными нормами,

составляют для 2 врачей-лаборантов: (11 мин 09 сек Х (3800 - 425) Х2)+(17 мин 18 сек Х (1600 - 360) X 2) +(24 мин 36
се_ea Х 425 Х 2)+(30 мин 45 сек Х 360 Х 2), что в сумме составляет 2687 часов. То же для 3-х лаборантов: (26 мин 57 сек
Х (3800 - 425) Х З) +(33 мин 15 сек Х (1600 - 360) Х 3) + (26 мин 57 сек Х 425 Х 3)+(33 мин 15 сек Х 360 Х 3), сумма равна
7780 часов.

Фактически в течение года 2 врача-лаборанта работали 3396 часов (283 раб. дня Х 6 часов Х 2), а 3 лаборанта -

5094 часа (283 раб. дня Х 6! X 3). Следовательно, в лаборатории, выполняющей указанный объем работы,
целесообразно было использовать 0,75 (2687:3396) вместо 2 должностей врачей-лаборантов и 1,5 (7780:5094) вместо 3
должностей лаборантов.

Серологический метод исследования (реакция Борде-Жангу)

Принцип. Специфические антигонококковые антитела вступают в соединение со специфическим антигеном

(убитая культура гонококка, содержащая 3 млрд микробных тел в 1 мл по оптическому стандарту). Образовавшиеся
комплексы сорбируют вводимый в реакцию коаcплемент. Индикация образовавшихся комплексов достигается

введением гемолитической системы (эритроциты барана+гемолитическая сыворотка). Применяется для выявления
больных гонореей, в основном при хронических и осложненных формах заболевания.

Реагенты:
!f11. 0,9% изотонический раствор натрия хлорида.
2. Антиген специфический гонококковый, две разные серии, сохраняется в холодильнике при 4°.
3. Комплемент - смесь сывороток крови морских свинок. Может быть использован лиофильновысушенный или

жидкий, консер_e2ированный - 5 г сернокислого натрия и 4 г борной кислоты на 100 мл. Хранится в холодильнике при
4°, срок годности до двух месяцев.

4. Гемолизин - кроличья гемолитическая сыворотка против эритроцитов барана с титром не ниже 1 :1200,

сохраняется в холодильнике при 4°.

5. Эр_e8троциты барана. Кровь получают у барана путем пункции яремной вены. Кровь собирают в стерильную

банку со стеклянными бусами, встряхивают 5-10 минут. Фильтрованием через марлю отделяют образовавшиеся сгустки
фибрина. Дефибринированная кровь барана хранится в холодильнике при 4° в те_f7ение 3-5 дней. При необходимости
более длительного хранения кровь консервируют. К 100 мл дефибринированной крови барана добавляют 15 мл смеси,
приготовленной по следующей прописи: глюкозы 6 г, борной кислоты 4,5 г, 100 мл изотонического раствора натрия
хлорида; приготовленную смесь кипятят на _e2одяной бане 3 дня подряд по 20 минут, срок годности консервированной
крови барана до 4 недель. Дефибринированная консервированная и неконсервированная кровь хранится в
холодильнике при 4°.

Специальное оборудование

1. Центрифуга.
2. Термостат с температурой 37°.
3. Холодильник с температурой 4°.
4. Инактиватор (водяная или суховоздушная баня) с температурой 56°.
5. Приборы дозировочные для серологических исследований (Флоринского) ФЛ-3 и ФЛ-4.
6. Пипетки градуированные на 1,2 мл с делениями 0,01 мл.
7. Пипетки градуированные на 5, 10 мл с делением 0,1 мл.
8. Пробирки размером: 14х60 мм, 15х100 мм, 15х150 мм.
9. Цилиндры мерной емкостью 100, 250, 500 мл с делениями на 5 мл.
10. Химические стаканы емкор1тью 50, 100, 250, 500 мл.

Ход определения. Постановке основного опыта предшествует подготовительная работа, состоящая из следующих

этапов:

Обработка испытуемой сыворотки крови. Для исследования требуется 7-10 мл кров_e8, которую получают

пункцией   локтевой   вены.   Пункцию   производят   стерильной   иглой   при   соблюдении   правил   асептики.   Взятие   крови
производят   натощак   или   не   ранее   6   часов   после   приема   пищи.   Нельзя   брать   кровь   у   больных   с   повышенной
температурой,   после   употребления   спиртных   напитков   ране'e5   24   часов,   перенесших   недавно   инфекционное
заболевание, у женщин во время менструации, у беременных в последние 10 дней беременности, у рожениц в первые
10 дней после родов, у новорожденных в первые 10 дней жизни. В лабораторию кровь, собранная в сухую чистую
пробирку, должна быть доставлена! не позднее 48 часов с момента взятия при условии ее хранения в холодильнике при
4°.   Сыворотка   крови   может   быть   использована   для   постановки   в   день   взятия   крови.   При   этом   доставленную   в
лабораторию   кровь   (в   день   ее   взятия)   помещают   в   термостат   при   37°   на   15-30   минут.   Образовавшийся   сгусток
отде'ebяют   стеклянной   палочкой   от   стенок   пробирки   и   центрифугируют   15   минут   при   1000   об/мин.   Над   сгустком
образуется   слой   прозрачной   сыворотки   крови,   которую   при   помощи   пипетки   с   резиновым   баллоном   без   примеси
эритроцитов переносят в другую пробирку. При наличии в сыворотке крови примеси эр_e8троцитов ее центрифугируют
и отделяют от них. Кровь, доставленную в лабораторию накануне постановки реакции, обводят стеклянной палочкой и
помещают в холодильник при 4°. Перед постановкой реакции образовавшуюся над сгустком крови сыворотку переносят
в   другую   пробирку.   Снятую   со   _f1густка   сыворотку   крови   инактивируют   при   56°   30   минут.   Сыворотки   крови   ранее
инактивированные,   в   день   постановки   реакции   должны   быть   повторно   прогреты   при   56°   в   течение   15   минут.
Инактивированные сыворотки крови могут сохраняться в холодильнике при 4° в течение 5-6 дней. При необходимости д!
лительного хранения сывороток крови (до 3-4 недель) их консервируют добавлением сухой борной кислоты (из расчета
получения   2%  концентрации)   или  замораживают  в  морозильной  камере  холодильника  на  тот   же  срок,  не  допуская
повторного замораживания и оттаивания. Допускается исследование !сыворотки крови, высушенной на вощаной бумаге
(на каждый 0,5 мл сыворотки крови до ее высушивания добавляют по 3 капли свежеприготовленного 40% раствора
пищевого сахара). Для исследования сухую сыворотку крови необходимо растворять в изотоническом растворе натрия
хлорида в объеме, рав'edом объему высушенной сыворотки крови. Перед исследованием проводят инактивирование
при 56° в течение 30 минут.

Желтушные, хилезные, резко гемолизированные и проросшие сыворотки крови для исследования непригодны.
Приготовление раствора антига5нов. Антигены разводят соответственно способу и титру, указанному на этикетке.

Титр - это количество чистого антигена в 1 мл раствора.

Приготовление гемолитической системы. Дефибринированную кровь барана или эритроциты барана в объеме,

необх!одимом для работы в данный день, трех-пятикратно отмывают изотоническим раствором натрия хлорида путем
центрифугирования. Центрифугируют 10 минут при 1,5 тысячах оборотов в минуту. Последнюю бесцветную порцию
промывной жидкости сливают, а осадок вновь центрифугируют для его уплотн_e5ния. Надосадочную жидкость вновь
удаляют, а из плотного осадка готовят 3% взвесь эритроцитов барана в изотоническом растворе натрия хлорида.
Равный объем гемолитической сыворотки, разведенной в изотоническом растворе натрия хлорида по утроенному титру

(например, на этикетке указ_e0н титр 1:1200; для разведения титр будет 1:400, т. е. 0,1 мл гемолитической сыворотки на
40 мл изотонического раствора натрия хлорида) приливают к равному объему 3% взвеси эритроцитов барана и
производят быстрое смешивание, путем переливания из одной колбы в другую. Полученную гемолитическую сист_e5му
выдерживают в термостате при 37° 30 минут.

Титрование комплемента. Комплемент морской свинки разводят 1 : 10 изотоническим раствором натрия хлорида.

При работе с сухим комплементом предварительно необходимо растворить содержимое ампулы в изотоничес'eaом
растворе натрия хлорида в объеме, равном объему высушенного комплемента.

Отрицательную инактивированную сыворотку крови человека разводят изотоническим раствором натрия хлорида

1:5.

Титрование комплемента проводят в 36 пробирках, поставленных по !12 штук в три ряда. Два ряда пробирок для

титрования комплемента в присутствии двух антигенов и третий ряд - для титрования комплемента без антигенов в
присутствии изотонического раствора натрия хлорида. Пять контрольных пробирок: две - для контроля антигенов и по
одной - для контроля аaомплемента, гемолитической сыворотки и изотонического раствора натрия хлорида на
гемотоксичность - заполняют их до объединения раствора гемолитической сыворотки и взвеси эритроцитов барана
(таблица N 1).

Таблица 1

Схема проведения контроля

_________________________________________________________________________

Ингредиенты (мл) ¦ Контрольные пробирки
(общий объем - 1,25 мл) _____________________________________!r ¦ 1 ¦ 2 ¦
3 ¦ 4 ¦ 5

_________________________________________________________________________
Гемолитическая сыворотка, разве- - 0,25 - - -

денная по утроенному титру
3% взвеси эритроцитов барана 0,25 0,25 0,25 0,2!5 0,25

Комплемент 1 : 10 0,25 - - - -
Антиген гонококковый N 1, раз- - - - 0,5 -

веденный по титру
Антиген гонококковый N 2, раз- - - - - 0,5

веденный по титру
Изотонический раствор натрия 0,75 0,75 1,0 0,5 0,5

!хлорида
_________________________________________________________________________

Помещают в термостат при 37° на 45 минут
_________________________________________________________________________

Результат ! -Г -Г -Г -Г -Г
_________________________________________________________________________

После 45 минут пребывания в термостате при 37° во всех контрольных пробирках должен отсутствовать гемолиз.
Комплемент, разведенный 1:10, раз'ebивают в 12 пробирок первого ряда в дозах: 0,1, 0,16, 0,2, 0,24, 0,3 0,36, 0,4,

0,44, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65 мл (таблица N 2). Общий объем содержимого пробирок доводят до 1 мл соответствующими
объемами изотонического раствора натрия хлорида: 0,9, 0,84, 0,8, 0,76, 0,7, 0,64, 0,6, 0,56, 0,5, 0,45, 0,4, 0,35 мл.
Полученную в каждой пробирке смесь тщательно перемешива0ют и переносят по 0,25 мл в соответственно стоящие
позади два ряда пробирок и 0,25 мл выливают. Затем во все 36 пробирок разливают по 0,25 мл инактивированной
отрицательной сыворотки крови человека, разведенной изотоническим раствором натриях хлорида 1: 5. Далее в 12
пробирок первого ряда прилива!ют по 0,25 мл разведенного по титру гонококкового антигена N 1; разведенный по титру
гонококковый антиген N 2 приливают по 0,25 мл в 12 пробирок второго ряда; изотонический раствор натрия хлорида
приливают по 0,25 мл в 12 пробирок третьего ряда. Штатив с пробирками встряхивают и добавляют по 0,5 мл гемо!
литической системы в третий ряд пробирок (без антигенов). Штатив с пробирками вновь встряхивают и помещают в
термостат при 37° на 45 минут. После инкубации в термостате в 24 пробирки первого и второго рядов добавляют по 0,5
мл гемолитической системы. Содержимое пробирок вновь встряхивают и 'efомещают в термостат при 37° на 45 минут.
По истечении 45 минут определяют рабочую дозу комплемента, которая устанавливается следующим образом: в основу
берут титр комплемента без антигенов, затем титр комплемента в присутствии антигенов, к которому делают надбавку в
пределах 30-50% в завис_e8мости от степени гемолиза в пробирках с меньшим количеством комплемента.

Титром комплемента является наименьшее его количество, способствующее полному гемолизу эритроцитов

барана в присутствии антигена и отрицательной сыворотки крови человека.

А2 данном случае титр комплемента будет 0,4, а рабочая доза комплемента - 0,6 т.е. 6% комплемент (таблица N

2).

Для каждого рабочего дня готовят необходимый объем комплемента, разведенного по рабочей дозе, исходя из

расчета 0,75 мл комплемента на каждую испытуемую сыво_f0отку крови, при условии постановки реакции Борде-Жангу
с двумя разными сериями антигена. Так, на 60 испытуемых сывороток крови необходимо 45 мл комплемента,
разведенного по рабочей дозе. Следовательно, к 42,3 мл изотонического раствора натрия хлорида нужно добавить 2,7
мл комплемента (при ш_e5стипроцентной рабочей дозе комплемента). В случае получения разных титров комплемента
в присутствии гонококковых антигенов двух разных серий используют при постановке реакции разные рабочие дозы
комплемента в соответствии с полученными титрами, т. е. для каждого антигена свою р!абочую дозу.

Таблица 2

Титрование комплемента в присутствии антигена и отрицательной

сыворотки крови человека

________________________________________________________________________

Ингредиенты ¦ NN пробирок
(мл) (общий ____________________________________________________________

объем - ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
1,25 мл) ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦ 10 ¦ 11 ¦ 12

cf1_________________________________________________________________________
Комплемент

1:10 0,1 0,16 0,2 0,24 0,3 0,36 0,4 0,44 0,5 0,55 0,6 0,65
Изотонический

раствор нат-
рия хлорида 0,9 0,84 0,8 0,76 0,7 0,64 0,6 0,56 0,5 0,45 0,4 0,35

____________________5f_____________________________________________________
После тщательного перемешивания из каждой пробирки первого

ряда переносят по 0,25 мл в соответствующие пробирки второ-
го, третьего ряда и по 0,25 мл удаляют из каждой пробир_eaи

первого ряда.
_________________________________________________________________________

Отрицательная по 0,25 мл во все 36 пробирок
инактивирован-

ная сыворотка
крови человека

!1 : 5
_________________________________________________________________________

Антиген гоно- 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
кокковый N 1,

разведенный (первый ряд пробирок)
по титру

_______________________5f__________________________________________________
Антиген гоно- 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

кокковый N 2,
разведенный (второй ряд пробирок)

по титру
____________________________________________________________!_____________

Изотонический 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
раствор нат-

рия хлорида (третий ряд пробирок)
_________________________________________________________________________

Гемолитичес- 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
!lкая система (третий ряд пробирок)
_________________________________________________________________________

Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45 минут.
_________________________________________________!________________________

Гемолитичес- 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
кая система (первый и второй ряды)

_________________________________________________________________________
Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45 !минут.

_________________________________________________________________________
Результат -Г -Г -Г -Г -Г -Г +Г +Г +Г +Г +Г +Г

_________________________________________________________________________
Примечание: -Г (з'e0держка гемолиза); +Г (гемолиз).

Качественный метод.Каждую испытуемую инактивированную сыворотку крови, разведенную 1:5 изотоническим

раствором натрия хлорида, исследуют в трех пробирках, предварительно разлив в каждую по 0,25 мл. В первую про!
бирку добавляют 0,25 мл гонококкового антигена N 1, разведенного по титру; во вторую - 0,25 мл гонококкового антигена
N 2, разведенного по титру; в третью (контрольную) - 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. Комплемент,
разведенный по рабочей дозе, добавляют по 0,25 мл во все опытные и контрол_fcные пробирки. После первичной 45
минутной инкубации в термостате при 37° приливают во все опытные и контрольные пробирки по 0,5 мл гемолитической
системы. После встряхивания пробирки вновь помещают в термостат при 37° на 45-60 минут до наступления полного
гемолиза в контрольной пробирке иср1ледуемой сыворотки (таблица N 3).

Таблица 3

Методика постановки качественной реакции Борде-Жангу

_________________________________________________________________________

Ингредиенты (мл) ¦ NN пробирок
(общий объем - 1,25 мл) _____________________________________

¦ 1 ¦ 2 ¦3 (контроль)
_________________________________________________________________________

Исп_fbтуемая инактивированная 0,25 0,25 0,25
сыворотка крови, разведенная 1 :5

_________________________________________________________________________
Антиген гонококковый N 1, раз- 0,25 - -

веденный по титру
_______5f__________________________________________________________________

Антиген гонококковый N 2, раз- - 0,25 -
веденный по титру

_________________________________________________________________________
Изотоническа8й раствор натрия - - 0,25

_________________________________________________________________________
Комплемент, разведенный по ра- 0,25 0,25 0,25

бочей дозе
_________________________________________________________5f________________

Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45 минут
_________________________________________________________________________

Гемолитическая система 0,5 0,5 0,5

_______________________________Pf_________________________________________

Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45-60 минут (до наступления гемолиза в контрольной пробирке

испытуемой сыворотки крови).

Оценка результатов.Для обозначения позитивн_eeсти реакции Борде-Жангу пользуются системой четырех

плюсов. Полная задержка гемолиза в опытных пробирках расценивается как резкоположительный результат (4+),
значительная задержка гемолиза - положительный (3+), частичная задержка гемолиза - слабоположительный (2+ и 1+),
незначительная за0держка гемолиза - сомнительный (+-). Полный гемолиз в опытных пробирках расценивается как
отрицательный результат реакции.

Результаты реакции будут ошибочны при: 1) несоблюдении условий и срока хранения испытуемой сыворотки

крови, антигенов, комплемента, гемолитическ'eeй сыворотки, эритроцитов барана; 2) нарушении условий и методики
постановки реакции; 3) исключении из постановки контрольных положительных и слабоположительных сывороток крови;
4) неправильно выбранной рабочей дозе комплемента (избыток или недостаток его в опыте); 5) использовании при
постановке реакции загрязненных пробирок, пипеток.

Примечание: Указанные ошибки при постановке реакции приводят к появлению как ложноотрицательных, так и

ложноположительных результатов.

Количественный метод. Этим методом определ!яют титр антител в положительных сыворотках крови путем

исследования в реакции связывания комплемента уменьшающихся количеств сывороток крови, разведенных
изотоническим раствором натрия хлорида. Количественный метод реакции Борде-Жангу ставят с положительными
сыворотками _eaрови, давшими 4+. Сыворотки крови в день постановки реакции повторно прогревают при 56° 15 минут.

Каждую испытуемую сыворотку крови исследуют в 8 пробирках. В первую пробирку наливают 0,8 мл

изотонического раствора натрия хлорида, со второй по седьмую пробирки - 0,25 мл изотонича5ского раствора натрия
хлорида. В первую пробирку вносят 0,2 мл инактивированной испытуемой сыворотки крови, содержимое перемешивают
и по 0,25 мл переносят во вторую и восьмую (контрольную) пробирки, затем 0,25 мл выливают. Из второй пробирки
после перемешивания переносят 0,25 мл в третью, из тр_e5тьей - четвертую и т. д. до седьмой пробирки, из которой
0,25 мл разведенной сыворотки крови выливают. Затем приливают по 0,25 мл гонококкового антигена, разведенного по
титру с первой по седьмую пробирку. В восьмую (контрольную) - 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида.
После встряхивана8я во все восемь пробирок добавляют по 0,25 мл комплемента, разведенного по рабочей дозе.
Первичная инкубация в термостате при 37° продолжается 45 минут, после чего во все пробирки приливают по 0,5 мл
гемолитической системы. Встряхнув пробирки, их помещают в термостат при 37° на 45-60 минут и после н!аступления
полного гемолиза в восьмой (контрольной) пробирке регистрируют результат реакции (таблица 4).

Таблица 4

Методика постановки количественной реакции Борде-Жангу

________________________________________________________________________

Ингредиенты (мл) ¦ NN пробирок
(общий объем - 1,25 мл) ________________________________________

¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦(ко-

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦нтр-
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦оль)

_________________________________________________________________________
Изотонический раствор натрия

хлорида 0,8 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 -
!0 Испытуемая инактивированная сы-

воротка крови 0,2
_________________________________________________________________________

После перемешивания из 1 пробирки
0,25 мл удаляют, а во 2 и 8 пробирки

переносят по 0,25 мл. Из 2 пробирки
после перемешивания переносят последо-

вательно из пробирки в пробирку (из 2 в
3, из 3 в 4 и т. д. до 7 пробирки вклю-

чительно) по 0,25 мл.
! Из 7 пробирки 0,25 мл удаляют. Полу-

чают разведения сыворотки крови в про-
бирках соответственно

1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:5
_________________________________________________________________________

Антиген гонококковый, разведен-
ный по титру 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 -

_________________________________________________________________________
Изотонический раствор натрия

хлорида - - - - - - - 0,25
_________________________________________________________________________

Комплемент, разведенный по ра-
бочей дозе 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

_________________________________________________________________________
Встряхнуть, поместить в термостат при 37° на 45 минут

_________________________________________________________________________
Гемолитическая система 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

_________________________________________________________________________
Встряхнуть, поместить в термостат при

37° на 45-60 минут до наступления пол-
ного гемолиза в контрольной пробирке

испытуемой сыворотки крови
_________________________________________________________________________

содержание .. 435 436 437 438 ..